GnRH类似物阿拉瑞林对培养的胃平滑肌细胞内钙离子浓度变化的影响
作者：陈蕾 黄威权 刘丽宏 吕葆真 蒲若蕾
单位：陈蕾 黄威权 吕葆真 蒲若蕾(第四军医大学组织学胚胎学教研室)；刘丽宏(药理学教研室，西安 710032)
关键词：GnRH类似物；胃平滑肌；钙；Fluo-3-AM；共聚焦显微镜检查
解剖学报00zk29
【摘要】目的 研究GnRH类似物(阿拉瑞林)诱导胃平滑肌细胞内钙动 员的机制。 方法 采用共聚焦技术检测细胞内钙荧光强度的变化。 结果 (1)在Hanks液中，GnRH类似物浓度为10-7、10-6、10 -5mol*L-1时，胃平滑肌细胞内Ca2+逐渐升高，其峰高(peak-restin g)分别为6.00±0.50、9.23±0.62、18.97±2.42，其达峰时间分别为42.37±1.65 、54.93±3.22、105.63±3.92s，并呈时间和剂量依赖性；(2)当阿拉瑞林浓度为10 -4mol*L-1时，胞内Ca2+略有升高，与10-5mol*L-1相 比(P<0.01)；(3)在有外钙和无外钙时，阿拉瑞林对胞内Ca2+ 的升高亦有显著 差异(P<0.01)；(4)在无外钙并加入内罗啶孵育后，GnRH引起的胞内C a2+轻度 升高，但与D-Hanks组相比无显著性差异(P<0.05)；(5)在Hanks液中， 用拉西地平孵育后 ，再加入阿拉瑞林，其胞内Ca2+仍可升高，并有显著差异(P<0.0 1)。结论Ca2+参与了GnRH 类似物阿拉瑞林对胃平滑肌细胞作用的细胞内分子 转导过程。细胞内Ca2+的增加既源于内钙的释放又源于外钙的内流。
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【中图分类号】Q579.2 【文献标识码】 A 【文章编号】 0529-1356(2000)增-112
EFFECTION OF GnRH ANALOGUE ON INTRACELLULAR CALCIUM MOBILIZATION IN CULTURED RAT STOMACH SMOOTH MUSCLE CELLS
HEN Lei，HUANG Wei-quan， L Bao-zhen，PU Ruo-lei
(Department of Histology and Embryology，)
LIU Li-hong
(Department of pharmacolo gy，the Fourth Military Medical University，Xi'an710032，China)
, 百拇医药
【Abstract】Objedctive To study the mechanism of GnRH agal ogus( Alarelin)on[Ca2+]i mobilization in stomach smooth muscle cells (SSMC)o f rats.Methods Cells were cutured and loaded with Fluo -3-AM.[Ca2+]i was measured by fluorescent intensity(FL)in each cell with confocal microscopy.Results (1)In Hanks solution，10 - 7，10-6，10 -5mol*L-1Alarelin can elevate[Ca2+]i ， its peak-resting values reached 6.00±0.50、9.23±0.62、18.97±2.42 respec tively，which indicate that the level of [Ca2+]i act in an dose-depen de nt and time-dependent.(2) Contrarily，when Alarelin was 10-4mol*L-1 ， its peak-resting value only reached 6.32±0.67， conpared with Alarelin 10 -5mol*L-1，which was sigificantly lower(P<0.01.(3)[ Ca2+]i wa s also singificantly higher in Hanks solution than that in D-Hanks solution(P< 0.05).(4)In D-Hanks solution with ryanodine，Alarelin had no effect on levels of [Ca2+]i，compared with group of D-Hanks(P>0.05).( 5)When pertreatment with Lacidipine in Hanks solution，the effect of Alarelin 10-5mol*L -1 was partly inhibited(P<0.01)。Conclusion The data indicate that[Ca2+]i plays an important role in molecular mechanism of intrace llular singal transduction pathways which GnRH analogue，Alarelin mediate in SSM C .T he increasing of[Ca2+]i was caused by releasing from intracellular sto r es and extracellular Ca2+influx，possibly through L-type calcium channels .
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【Key words】GnRH analogue; Stomach smooth muscle cell; Ca 2+; Flue-3-AM; Confocal microscopy 现已知，促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing hormone，GnRH)受体，广泛存在于下丘脑-垂体轴之外的组织中，例如性腺的颗粒细胞、胎盘滋养层细胞及子宫平滑肌细胞中均发现有GnRH受体的存在[1，2]。我们先前的实验也已证实大鼠消化系统广泛存在有GnRH受体的阳性细胞[3]。但对于具体功能尚未阐明，本实验采用荧光探针Fluo-3-AM标记培养大鼠胃平滑肌细胞内的游离[Ca2+]i，通过共聚焦显微镜观察单个细胞内荧光强度的瞬时变化，探讨GnRH类似物对胃平滑肌细胞作用的分子转导机制。
材料和方法
1.试剂
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阿拉瑞林(alarelin)购自上海丽珠东风生物技术有限公司、拉西地平(lacidipine)由本校药理教研室合成，经核磁共振氢谱确证其结构，HPLC纯度分析大于98%，使用时以二甲亚砜(DMSO)：15%吐温-80(1：50)配制。胶原酶、荧光探针Fluo-3-AM、依他酸(EGTA)、内罗啶(ryanodine)均购自Sigma公司。胰蛋白酶购自华美公司 。Hanks液含(mmol.L-1CaCl2 1.3，KCl 5.4，KH2PO4 0.4，MgCl2.6H2O 0.4，MgSO4.7H2O 0.4，NaCl 137，glucose5.6)D-Hanks液含(mmol.L-1KCl 5.4，KH2PO40.4，MgCl2.6H2O 0.4，MgSO4.7H2O 0.4，NaCl 137，EGTA0.1)。
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2.大鼠平滑肌细胞(stomach smooth muscle cell，SSMC)的培养
根据参与文献[4]介绍的方法并稍作修改。选用1～3d的雄性SD大鼠，75%酒精消毒腹部后，暴露腹腔。剪取胃部，立即置冰冷的Hanks液中，仔细刮除食物残渣及内膜，留下肌层和外膜，用冰冷的Hanks液冲洗3～4次。用剪刀剪碎后，置于一定量的1g.L-1胶原酶中，放置37℃搅拌消化60min，每20min收集1次细胞，离心中止消化，以DMEM培养液(含100mg.L-1小牛血清)制备成细胞悬液，并调整细胞密度为1×106/ml。种植入培养瓶中，置37℃，50ml.L-1CO2培养箱中孵育，贴壁90min后，将细胞悬液移入另一培养瓶，以后每3d换液1次。至平滑肌细胞长满成单层，此时细胞呈典型的“峰谷”状排列。免疫组织化学显示，培养细胞为α-actin反应阳性，证实为平滑肌细胞。以250mg.L-1胰酶消化传代。将3～5代细胞接种于一种特制的50mm培养皿中培养皿(下底部中央有一直径1mm小孔，从下方粘贴1个盖玻片)，培养24h细胞贴壁生长，荧光标记检测细胞内Ca2+水平。
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3.荧光探针Fluo-3-AM标记细胞内Ca2+
以二甲亚砜将Fluo-3-AM配成1.0mmol.L-1储备液低温冻存，用时以pH7.4 D-Hank液稀释成10μmol.L-1应用液，将各处理细胞以D-Hank液冲洗3次，加入0.2ml10μmol.L-1Fluo-3-AM，避光置37℃30min，吸出染液，以Hank液洗3次，加入0.2ml Hank液后用于检测。
4.实验分组及检测方法
(1)Hank液组：将阿拉瑞林分4个浓度梯度，分别为10-4、10-5、10-6、10-7mol.L-1；(2)D-Hank液组：用阿拉瑞林10-5mol.L-1；(3)内罗啶组：用10μmol.L-1孵育10min后加入D-Hank液+10-5mol.L-1的阿拉瑞林；(4)拉西地平组：用拉西地平10μmol.L-1孵育10min后加入Hank液，然后再加入10-5mol.L-1阿拉瑞林进行检测，具体方法是将培养皿置于ACAS570载物台上，在激光共聚焦显微镜下动态扫描细胞内荧光强度变化，激发波长488nm，发射波长522nm，采样频率为488Hz，共聚焦系统由Bio-Rad公司提供的软件控制，在Penftium90计算机中运行，每皿选2～3个视野，以平均荧光强度变化反映胞内游离钙浓度的相对水平。
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5.数据分析
数据经Pentium 90微机系统对图形及时间进行实时测量而获得。以均数±标准差(±s)表示，采用SPLM软件进行单因素方差分析。
结 果
1.阿拉瑞林对胞内Ca2+的影响
将上述分别Fluo-3-AM标记的胃平滑肌细胞置ACAS570上观察，可见经标记的细胞，其中部荧光强度较强，周边较弱。由于细胞状态的不同，基础荧光强度不同(以荧光强度表示)。阿拉瑞林可引起胞将内Ca2+的迅速升高。当阿拉瑞林为10-7、10-6、10-5mol.L-1时，其峰高值分别为6.00±0.50、9.23±0.62、18.97±2.42，(F＝97.81，P<0.01)其达峰时间依次为42.97±1.65、54.93±3.22、105.63±3.92s，(方差分析F＝498.42，P<0.01)，可以看出有明显的时间和剂量依赖性。当阿拉瑞林浓度为10-4mol.L-1时，其峰高为6.32±0.67，达峰时间为77.47±1.55s，无时间和剂量依赖性。
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附表 10-5mol.L-1对培养的胃平滑肌细胞[Ca2+]i的影响
Table Effects of Alarelin on [Ca2+]i in Hanks or D-Hanks solution in cultured SSMC of rats
分组
例数
静息值
峰值
峰高
达峰时间
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n
resting
peak
peak-resting
timeto peak
10-4mol.L-1阿拉瑞林(alarelin)
4
48.32±3.02
54.43±3.02
6.32±0.67
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77.47±1.55
10-5mol.L-1阿拉瑞林(alarelin)
6
46.41±2.98
65.38±5.40
18.97±2.42
105.63±3.92
10-6mol.L-1阿拉瑞林(alarelin)
5
38.55±0.47
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47.78±0.91
9.23±0.62
54.93±3.22
10-7mol.L-1阿拉瑞林(alarelin)
5
38.77±2.00
44.48±2.82
6.00±0.50
42.37±1.65
in D-Hanks
7
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42.33±1.11
49.71±2.02
6.39±1.48
107.99±5.46
in D-Hanks+内罗啶
(in D-Hanks+ryrodine)
6
47.43±0.84
54.04±1.71
6.61±1.64
220.17±20.40
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拉西地平(lacidipine)
5
46.43±2.04
52.51±4.54
6.09±2.70
70.02±3.34
2.钙拮抗剂对阿拉瑞林引起胞内Ca2+变化的影响
在无外钙时，胞内Ca2+的峰高为6.39±1.48，达峰时间为107.99±5.46s，加入内罗啶孵育10min后，再加入10-5mol.L-1的阿拉瑞林，也可引起胞内Ca2+的升高，其峰高为6.61±1.64，达峰时间为220.17±20.40s，但两者相比P>0.05，无统计学意义。
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用拉西地平在Hank液中孵育10min后，加放10-5mol.L-1的阿拉瑞林，可以部分抑制阿拉瑞林升高胞内Ca2+的作用，其峰高为6.09±2.70，(P<0.05)，达峰时间为70.02±3.34s(P<0.01)，见附表。
讨 论
一般认为，cAMP是GnRH发挥作用的第二信使之一[5]，但是GnRH作用的强弱与cAMP水平的升高与降低并没有必然的对应关系[6]。Lin等[7]的研究表明，GnRH受体的激活具有多种传导途径。目前一些实验表明，Ca2+在GnRH作用过程中发挥了第二信使的功能，GnRH受体信号转导是通过与G蛋白偶联的磷酸肌醇途径及Ca2+动员介导来完成的[8]，而且钙在这一过程中起着重要的调节作用[9]。
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本实验显示，给予小剂量的GnRH类似物阿拉瑞林可使胞内Ca2+的升高呈剂量和时间依赖性，其作用机制可能是GnRH类似物阿拉瑞林与受体结合后，在细胞膜表面移动，形成受体的微聚(microggregation)现象[10]，这一现象的发生是钙依赖性的。从而激活G蛋白，进而激活磷脂酶C(PLC)，使磷脂酰肌醇二磷酸(PIP2)分解为甘油二酯(DG)和1，4，5-3，磷酸肌醇(IP3)，IP3可开放胞内钙库，从而增加胞内Ca2+。这与Currie等[1]报道的GnRH对合体滋养细胞钙动员结果相一致。
本实验中，阿拉瑞林在无外钙和加入内罗啶时，可引起胞内Ca2+的升高，两者相比无统计学意义，说明阿拉瑞林能促进细胞内钙的释放，且其作用可能不是通过内罗啶受体来实现的。拉西地平是L-type Ca2+通道阻滞剂，当用拉西地平孵育后，再加入阿拉瑞林，可部分抑制胞内Ca2+的增高(P<0.01)，达峰时间无显著性差异，说明拉西地平不能完全抑制阿拉瑞林的作用，其作用除了通过L-type钙通道外，可能还有T-type钙通道、Na+-Ca2+交换等途径参与，这在今后的实验中还需进一步证实。
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有报道[11]，GnRH对机体细胞的功能起双向调节作用，在一定浓度范围内起促进作用，但超过一定浓度则起抑制作用，其机制可能是GnRH与受体结合后，会引起受体的同源性失敏 (homologus desensitization)，但同源性失敏的产生与否主要取决于GnRH的作用方式及作用时间的长短，若大剂量持续给药，则很快导致细胞的失敏。McArdle等[12]认为大剂量GnRH类似物与受体结合后，抑制了胞内钙动员，从而导致同源失敏的发生。本实验中，当阿拉瑞林浓度为10-4mol.L-1时，细胞内钙离子浓度反而下降，可能也属此种情况。
本研究证明了Ca2+参与了GnRH类似物阿拉瑞林对胃平滑肌细胞作用的分子转导过程，细胞内Ca2+的增加既源自平滑肌细胞内钙的释放又源自细胞外钙的内流。
【基金项目】国家自然科学基金资助项目(39770388)
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【作者简介】陈蕾(1965—)，女(汉族)，陕西省西安市人，在读医学博士
参考文献
[1] Currie WD，Setoyama T，Lee，PS，et al.Cytosolic free Ca2+ in human syncyt iotrophoblast cells increased by gonadotropin-releasing hormone[J].Endoc，199 3，133(5):2220-2226.
[2] Chegini N，Rogn H，Dou Q， et al.Conadotropin-releasing hormone( GnRH) and GnR H receptor gene expression in human myometrium and leiomyomata and the direct ac tion of GnRH analogs on myometrial smooth muscle cells and interaction with ovarian steroids in vetr o[J].J Clin Endocrinol Metab.1996，81(9):3215-3221.
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[3] 姚兵，黄威权，孙岚.大鼠消化道促性腺激素释放激素受体的免疫组织化学 研究[J].解剖学报，1999，30(2)：152～154.
[4] Missiaen L， De Smedt H，Droogmans G，et al.Calciumion homeostasis in smooth muscle[J].Pharmacol Ther，1992，56(2):191-231.
[5] Bourne GA.Cyclic AMP indirectly mediates the extracellular Ca2 +-independent release of LH[J].Mol Cell Endocrinol，1988，58(2-3):155-16 0.
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[7] Lin X，Conn PM.Transcriptional activation of gonadotropin-releasi ng hormone( GnRH) receptor gene by GnRH:involvement of multiple signal transduction pathways [J].Endocrinology，1999，140(1):358-364.
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[10] Conn PM Rogers DG， Seay SG. Biphasic regulation of the gonadotro pin-releas ing hormone receptor by receptor microaggregation and intracellular Ca2+le vels[J].Mol Pharmacol，1984，25(1):51-55.
[11] Anderson L，McGregor A，Cook JV，et al.Rapid desensitization of G nRH-stimulat ed intracelluar signalling events in alpha T3-1 and HEK-293 cells expressing the receptor[J].Endocrinology，1995，136(11):5228-52231.
[12] McArdle CA，Forrest-Owen W， Willars G，et al.Desensitization of gonadotropin -releasing hormone action in the gonadotrop-derived alpha T3-1 cell line[J ].Endocrinology，1995，136(11):4864-4871.
【收稿日期】2000-07-15 【修回日期】2000-09-04, 百拇医药
单位：陈蕾 黄威权 吕葆真 蒲若蕾(第四军医大学组织学胚胎学教研室)；刘丽宏(药理学教研室，西安 710032)
关键词：GnRH类似物；胃平滑肌；钙；Fluo-3-AM；共聚焦显微镜检查
解剖学报00zk29
【摘要】目的 研究GnRH类似物(阿拉瑞林)诱导胃平滑肌细胞内钙动 员的机制。 方法 采用共聚焦技术检测细胞内钙荧光强度的变化。 结果 (1)在Hanks液中，GnRH类似物浓度为10-7、10-6、10 -5mol*L-1时，胃平滑肌细胞内Ca2+逐渐升高，其峰高(peak-restin g)分别为6.00±0.50、9.23±0.62、18.97±2.42，其达峰时间分别为42.37±1.65 、54.93±3.22、105.63±3.92s，并呈时间和剂量依赖性；(2)当阿拉瑞林浓度为10 -4mol*L-1时，胞内Ca2+略有升高，与10-5mol*L-1相 比(P<0.01)；(3)在有外钙和无外钙时，阿拉瑞林对胞内Ca2+ 的升高亦有显著 差异(P<0.01)；(4)在无外钙并加入内罗啶孵育后，GnRH引起的胞内C a2+轻度 升高，但与D-Hanks组相比无显著性差异(P<0.05)；(5)在Hanks液中， 用拉西地平孵育后 ，再加入阿拉瑞林，其胞内Ca2+仍可升高，并有显著差异(P<0.0 1)。结论Ca2+参与了GnRH 类似物阿拉瑞林对胃平滑肌细胞作用的细胞内分子 转导过程。细胞内Ca2+的增加既源于内钙的释放又源于外钙的内流。
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【中图分类号】Q579.2 【文献标识码】 A 【文章编号】 0529-1356(2000)增-112
EFFECTION OF GnRH ANALOGUE ON INTRACELLULAR CALCIUM MOBILIZATION IN CULTURED RAT STOMACH SMOOTH MUSCLE CELLS
HEN Lei，HUANG Wei-quan， L Bao-zhen，PU Ruo-lei
(Department of Histology and Embryology，)
LIU Li-hong
(Department of pharmacolo gy，the Fourth Military Medical University，Xi'an710032，China)
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【Abstract】Objedctive To study the mechanism of GnRH agal ogus( Alarelin)on[Ca2+]i mobilization in stomach smooth muscle cells (SSMC)o f rats.Methods Cells were cutured and loaded with Fluo -3-AM.[Ca2+]i was measured by fluorescent intensity(FL)in each cell with confocal microscopy.Results (1)In Hanks solution，10 - 7，10-6，10 -5mol*L-1Alarelin can elevate[Ca2+]i ， its peak-resting values reached 6.00±0.50、9.23±0.62、18.97±2.42 respec tively，which indicate that the level of [Ca2+]i act in an dose-depen de nt and time-dependent.(2) Contrarily，when Alarelin was 10-4mol*L-1 ， its peak-resting value only reached 6.32±0.67， conpared with Alarelin 10 -5mol*L-1，which was sigificantly lower(P<0.01.(3)[ Ca2+]i wa s also singificantly higher in Hanks solution than that in D-Hanks solution(P< 0.05).(4)In D-Hanks solution with ryanodine，Alarelin had no effect on levels of [Ca2+]i，compared with group of D-Hanks(P>0.05).( 5)When pertreatment with Lacidipine in Hanks solution，the effect of Alarelin 10-5mol*L -1 was partly inhibited(P<0.01)。Conclusion The data indicate that[Ca2+]i plays an important role in molecular mechanism of intrace llular singal transduction pathways which GnRH analogue，Alarelin mediate in SSM C .T he increasing of[Ca2+]i was caused by releasing from intracellular sto r es and extracellular Ca2+influx，possibly through L-type calcium channels .
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【Key words】GnRH analogue; Stomach smooth muscle cell; Ca 2+; Flue-3-AM; Confocal microscopy 现已知，促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing hormone，GnRH)受体，广泛存在于下丘脑-垂体轴之外的组织中，例如性腺的颗粒细胞、胎盘滋养层细胞及子宫平滑肌细胞中均发现有GnRH受体的存在[1，2]。我们先前的实验也已证实大鼠消化系统广泛存在有GnRH受体的阳性细胞[3]。但对于具体功能尚未阐明，本实验采用荧光探针Fluo-3-AM标记培养大鼠胃平滑肌细胞内的游离[Ca2+]i，通过共聚焦显微镜观察单个细胞内荧光强度的瞬时变化，探讨GnRH类似物对胃平滑肌细胞作用的分子转导机制。
材料和方法
1.试剂
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阿拉瑞林(alarelin)购自上海丽珠东风生物技术有限公司、拉西地平(lacidipine)由本校药理教研室合成，经核磁共振氢谱确证其结构，HPLC纯度分析大于98%，使用时以二甲亚砜(DMSO)：15%吐温-80(1：50)配制。胶原酶、荧光探针Fluo-3-AM、依他酸(EGTA)、内罗啶(ryanodine)均购自Sigma公司。胰蛋白酶购自华美公司 。Hanks液含(mmol.L-1CaCl2 1.3，KCl 5.4，KH2PO4 0.4，MgCl2.6H2O 0.4，MgSO4.7H2O 0.4，NaCl 137，glucose5.6)D-Hanks液含(mmol.L-1KCl 5.4，KH2PO40.4，MgCl2.6H2O 0.4，MgSO4.7H2O 0.4，NaCl 137，EGTA0.1)。
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2.大鼠平滑肌细胞(stomach smooth muscle cell，SSMC)的培养
根据参与文献[4]介绍的方法并稍作修改。选用1～3d的雄性SD大鼠，75%酒精消毒腹部后，暴露腹腔。剪取胃部，立即置冰冷的Hanks液中，仔细刮除食物残渣及内膜，留下肌层和外膜，用冰冷的Hanks液冲洗3～4次。用剪刀剪碎后，置于一定量的1g.L-1胶原酶中，放置37℃搅拌消化60min，每20min收集1次细胞，离心中止消化，以DMEM培养液(含100mg.L-1小牛血清)制备成细胞悬液，并调整细胞密度为1×106/ml。种植入培养瓶中，置37℃，50ml.L-1CO2培养箱中孵育，贴壁90min后，将细胞悬液移入另一培养瓶，以后每3d换液1次。至平滑肌细胞长满成单层，此时细胞呈典型的“峰谷”状排列。免疫组织化学显示，培养细胞为α-actin反应阳性，证实为平滑肌细胞。以250mg.L-1胰酶消化传代。将3～5代细胞接种于一种特制的50mm培养皿中培养皿(下底部中央有一直径1mm小孔，从下方粘贴1个盖玻片)，培养24h细胞贴壁生长，荧光标记检测细胞内Ca2+水平。
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3.荧光探针Fluo-3-AM标记细胞内Ca2+
以二甲亚砜将Fluo-3-AM配成1.0mmol.L-1储备液低温冻存，用时以pH7.4 D-Hank液稀释成10μmol.L-1应用液，将各处理细胞以D-Hank液冲洗3次，加入0.2ml10μmol.L-1Fluo-3-AM，避光置37℃30min，吸出染液，以Hank液洗3次，加入0.2ml Hank液后用于检测。
4.实验分组及检测方法
(1)Hank液组：将阿拉瑞林分4个浓度梯度，分别为10-4、10-5、10-6、10-7mol.L-1；(2)D-Hank液组：用阿拉瑞林10-5mol.L-1；(3)内罗啶组：用10μmol.L-1孵育10min后加入D-Hank液+10-5mol.L-1的阿拉瑞林；(4)拉西地平组：用拉西地平10μmol.L-1孵育10min后加入Hank液，然后再加入10-5mol.L-1阿拉瑞林进行检测，具体方法是将培养皿置于ACAS570载物台上，在激光共聚焦显微镜下动态扫描细胞内荧光强度变化，激发波长488nm，发射波长522nm，采样频率为488Hz，共聚焦系统由Bio-Rad公司提供的软件控制，在Penftium90计算机中运行，每皿选2～3个视野，以平均荧光强度变化反映胞内游离钙浓度的相对水平。
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5.数据分析
数据经Pentium 90微机系统对图形及时间进行实时测量而获得。以均数±标准差(±s)表示，采用SPLM软件进行单因素方差分析。
结 果
1.阿拉瑞林对胞内Ca2+的影响
将上述分别Fluo-3-AM标记的胃平滑肌细胞置ACAS570上观察，可见经标记的细胞，其中部荧光强度较强，周边较弱。由于细胞状态的不同，基础荧光强度不同(以荧光强度表示)。阿拉瑞林可引起胞将内Ca2+的迅速升高。当阿拉瑞林为10-7、10-6、10-5mol.L-1时，其峰高值分别为6.00±0.50、9.23±0.62、18.97±2.42，(F＝97.81，P<0.01)其达峰时间依次为42.97±1.65、54.93±3.22、105.63±3.92s，(方差分析F＝498.42，P<0.01)，可以看出有明显的时间和剂量依赖性。当阿拉瑞林浓度为10-4mol.L-1时，其峰高为6.32±0.67，达峰时间为77.47±1.55s，无时间和剂量依赖性。
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附表 10-5mol.L-1对培养的胃平滑肌细胞[Ca2+]i的影响
Table Effects of Alarelin on [Ca2+]i in Hanks or D-Hanks solution in cultured SSMC of rats
分组
例数
静息值
峰值
峰高
达峰时间
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n
resting
peak
peak-resting
timeto peak
10-4mol.L-1阿拉瑞林(alarelin)
4
48.32±3.02
54.43±3.02
6.32±0.67
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77.47±1.55
10-5mol.L-1阿拉瑞林(alarelin)
6
46.41±2.98
65.38±5.40
18.97±2.42
105.63±3.92
10-6mol.L-1阿拉瑞林(alarelin)
5
38.55±0.47
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47.78±0.91
9.23±0.62
54.93±3.22
10-7mol.L-1阿拉瑞林(alarelin)
5
38.77±2.00
44.48±2.82
6.00±0.50
42.37±1.65
in D-Hanks
7
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42.33±1.11
49.71±2.02
6.39±1.48
107.99±5.46
in D-Hanks+内罗啶
(in D-Hanks+ryrodine)
6
47.43±0.84
54.04±1.71
6.61±1.64
220.17±20.40
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拉西地平(lacidipine)
5
46.43±2.04
52.51±4.54
6.09±2.70
70.02±3.34
2.钙拮抗剂对阿拉瑞林引起胞内Ca2+变化的影响
在无外钙时，胞内Ca2+的峰高为6.39±1.48，达峰时间为107.99±5.46s，加入内罗啶孵育10min后，再加入10-5mol.L-1的阿拉瑞林，也可引起胞内Ca2+的升高，其峰高为6.61±1.64，达峰时间为220.17±20.40s，但两者相比P>0.05，无统计学意义。
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用拉西地平在Hank液中孵育10min后，加放10-5mol.L-1的阿拉瑞林，可以部分抑制阿拉瑞林升高胞内Ca2+的作用，其峰高为6.09±2.70，(P<0.05)，达峰时间为70.02±3.34s(P<0.01)，见附表。
讨 论
一般认为，cAMP是GnRH发挥作用的第二信使之一[5]，但是GnRH作用的强弱与cAMP水平的升高与降低并没有必然的对应关系[6]。Lin等[7]的研究表明，GnRH受体的激活具有多种传导途径。目前一些实验表明，Ca2+在GnRH作用过程中发挥了第二信使的功能，GnRH受体信号转导是通过与G蛋白偶联的磷酸肌醇途径及Ca2+动员介导来完成的[8]，而且钙在这一过程中起着重要的调节作用[9]。
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本实验显示，给予小剂量的GnRH类似物阿拉瑞林可使胞内Ca2+的升高呈剂量和时间依赖性，其作用机制可能是GnRH类似物阿拉瑞林与受体结合后，在细胞膜表面移动，形成受体的微聚(microggregation)现象[10]，这一现象的发生是钙依赖性的。从而激活G蛋白，进而激活磷脂酶C(PLC)，使磷脂酰肌醇二磷酸(PIP2)分解为甘油二酯(DG)和1，4，5-3，磷酸肌醇(IP3)，IP3可开放胞内钙库，从而增加胞内Ca2+。这与Currie等[1]报道的GnRH对合体滋养细胞钙动员结果相一致。
本实验中，阿拉瑞林在无外钙和加入内罗啶时，可引起胞内Ca2+的升高，两者相比无统计学意义，说明阿拉瑞林能促进细胞内钙的释放，且其作用可能不是通过内罗啶受体来实现的。拉西地平是L-type Ca2+通道阻滞剂，当用拉西地平孵育后，再加入阿拉瑞林，可部分抑制胞内Ca2+的增高(P<0.01)，达峰时间无显著性差异，说明拉西地平不能完全抑制阿拉瑞林的作用，其作用除了通过L-type钙通道外，可能还有T-type钙通道、Na+-Ca2+交换等途径参与，这在今后的实验中还需进一步证实。
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有报道[11]，GnRH对机体细胞的功能起双向调节作用，在一定浓度范围内起促进作用，但超过一定浓度则起抑制作用，其机制可能是GnRH与受体结合后，会引起受体的同源性失敏 (homologus desensitization)，但同源性失敏的产生与否主要取决于GnRH的作用方式及作用时间的长短，若大剂量持续给药，则很快导致细胞的失敏。McArdle等[12]认为大剂量GnRH类似物与受体结合后，抑制了胞内钙动员，从而导致同源失敏的发生。本实验中，当阿拉瑞林浓度为10-4mol.L-1时，细胞内钙离子浓度反而下降，可能也属此种情况。
本研究证明了Ca2+参与了GnRH类似物阿拉瑞林对胃平滑肌细胞作用的分子转导过程，细胞内Ca2+的增加既源自平滑肌细胞内钙的释放又源自细胞外钙的内流。
【基金项目】国家自然科学基金资助项目(39770388)
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【作者简介】陈蕾(1965—)，女(汉族)，陕西省西安市人，在读医学博士
参考文献
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【收稿日期】2000-07-15 【修回日期】2000-09-04, 百拇医药