短暂缺氧对心肌细胞KATP通道的影响
作者：冯力 赵岐 刘杰
单位：冯力(中山医科大学药理学教研室, 广东 广州 510089)；赵岐(广州军区广州总医院眼科, 广东 广州 510010)；刘杰(第一军医大学病理生理教研室， 广东 广州 510515)
关键词：缺氧复氧；钾通道；缺血预适应；心肌
00zk16
摘 要：【目的】 探讨KATP通道在心肌缺血预适应(IP)中的作用。【方法】 用膜片钳单通道记录技术的细胞贴附式研究急性短暂缺氧复氧对新鲜分离的豚鼠心肌细胞细胞膜KATP通道影响。【结果】 短暂缺氧10 min可明显引起细胞膜KATP通道的开放，缺氧诱导的KATP通道的开放以簇状开放为主。复氧2 min及用2 mmol/L ATP可抑制通道开放，其电导值为89.7 pS。缺氧使通道开放概率(Po)明显增加, 并可诱发通道出现二级开放。【结论】 短暂缺氧可以激活心肌细胞膜KATP通道的开放，说明心肌细胞膜KATP通道参与了IP的保护作用。
, 百拇医药
中图分类号： R972 文献标识码： A
文章编号： 1000-257X(2000)04S0-0056-04
The Effect on Cardiac Plasma Membrane KATP Channel by Brief Hypoxia
FENG Li
(Department of Pharmacology,Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510089,China)
ZHAO Qi
(Department of Ophthalmology,Guangzhou Military General Hospital, Guangzhou 510010, China)
, 百拇医药
LIU Jie
(Department of Physiopathology, the First Military Medical University, Guangzhou 510515, China)
Abstract： 【Objective】 In order to study the role of the cardiac myocyte membrane KATP channel in ischemic preconditioning(IP) in vitro. 【Method】 The effect of 10 min hypoxia on KATP channel of isolated ventricular myocyte was observed, by using patch clamp technique (cell-attached configuration). 【Result】 The result show that KATP channel can be easily opened by 10 min brief hypoxia, and inhibited by reoxygenation within 2 min or by 2 mmol/L ATP. The opening of KATP channel was in burst. The single-channel conductance activated by hypoxia was 89.7 pS, the Po (open state probability) was increased by hypoxia, and the secondary opening of KATP channel was also induced.【Conclusion】 Brief hypoxia could activated cardic plasma membrane KATP channel and the results proved that KATP channel should take part in the IP.
, 百拇医药
Key words: anoxia and reoxygenation; potassium channels; ischemic preconditioning; myocardium
近几年的研究发现，给予多次短暂缺血和复灌后，心肌可以耐受随后长时间的缺血，梗塞面积可以缩小。这种多次短暂的缺血称为心肌缺血预适应(ischemic preconditioning,IP)[1]。许多实验证明KATP通道参与了IP的保护作用[2,3]，但缺乏在体外细胞水平KATP通道参与IP的证据。因此本实验采用新鲜分离的豚鼠心肌细胞，并模拟IP的短暂缺氧、复氧过程，直接观察在短暂缺氧环境下KATP通道开放的情况。
1 材料和方法
1.1 实验试剂
, 百拇医药
链酶蛋白酶E(pronase E)(Sigma)，优降糖(glybenclamide,GLY)(Sigma)。实验用液体配制：无钙台氏液(mmol/L)：NaCl 116, KCl 5.4, NaH2PO4 1.4, NaHCO3 15, MgSO4 1, Glucose 15, pH 7.3～7.4。台氏液(mmol/L)：NaCl 150, KCl 5.4, MgCl2 2, Glucose 10, HEPES 5, CaCl2 1.8, pH 7.3～7.4。浴槽液(mmol/L)：KCl 120, KOH 20, EGTA 5, Mg Cl2 1, TTX 0.001, HEPES 10, pH 7.3。电极液(mmol/L)：KCl 140, Mg Cl2 1, CaCl2 2, CdCl2 0.3, TTX 0.001, HEPES 10, pH 7.3。
, 百拇医药
1.2 心室肌细胞的急性分离
健康豚鼠250～350 g,雌雄不拘,猛击枕部致昏,迅速打开胸腔,取出心脏,置于4 ℃无钙台氏液中冲洗,剪开心包,主动脉插管后固定于Langendoff灌流架上,用无钙台氏液经豚鼠主动脉逆行灌注离体心脏,将冠状动静脉中的血液冲净，后改用含链酶蛋白酶E 0.1 g/L, CaCl2 150 μmol/L的无钙台氏液50 mL，灌流2～3 min,可见心脏比原来膨胀30%～50%,立即切下心室肌,剪开心室腔,在上述含酶的无钙台氏液中用吸管洗去残留的血块并将心室肌切碎,在上述酶液中温孵3～5 min, 用细尼龙网过滤,去掉心室肌碎块,将上清液稀释5倍至含钙1.8 mmol/L的无钙台氏液(保育液)中,室温下保存,待用。
1.3 体外细胞水平模拟IP短暂缺氧复氧模型
将含有细胞的保育液滴入记录通道活动的浴槽内,先用台氏液灌流浴槽,使细胞表面保持清洁以利于与微电极形成高阻封接,封接成功后将台氏灌注液改为浴槽高钾缺氧液正式缺氧灌注10 min。此缺氧液的制备是在密闭玻璃容器中给灌注液通以体积分数为95% N2+5% CO2混合气体20～30 min,使灌注液氧分压降至4 kPa以下,以恒定的灌流速度灌注,同时在浴槽表面也通以体积分数为95% N2+5% CO2混合气体来保持浴槽内溶液的缺氧程度，缺氧10 min后改为通以体积分数为95% O2+5% CO2混合气体的台氏灌注液继续灌注。
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1.4 单离子通道记录
本实验采用膜片钳技术的细胞贴附式记录模式。记录用玻璃微电极的尖端直径约为0.5～1.5 μm,充灌液体后电阻约为8～16 MΩ 。内插乏极化氯化银电极与膜片钳放大器探头相连。单通道电流经膜片钳放大器放大,放大器探头反馈电阻为10 GΩ 。低通滤波频率为3 kHz,经Digidata转换,在Fetchex下采样。
1.5 资料分析
用pCLAMP分析程序Fetchan进行开关事件的测量,设定通道的开、关事件的时间分辨率为200 μs,测量幅度的时间分辨率为500 μs,本文时间资料分析只选用单级开放的资料。将测量结果用pSTAT程序进行统计分析。
2 结 果
2.1 分离的心肌细胞的形态学
, 百拇医药
用上述方法分离的细胞,在光学显微镜下约有30%～40%呈条柱状 细胞直径为20～60 μm不等,长度约40～150 μm。细胞边界清楚,横纹排列清楚，台盼蓝染色为活细胞。在实验中我们采用这些条柱状细胞进行细胞膜的离子通道研究,发现封接较容易,封接成功率为88%。
2.2 缺氧诱导心肌细胞膜KATP通道的激活及该通道的特点
2.2.1 KATP通道的激活及鉴定 用贴附式模式记录KATP通道,因细胞是完整的,在没有缺血、缺氧及代谢受抑制的情况下,一般记录不到KATP通道的开放,我们在封接成功的30例正常的豚鼠心肌细胞中,给予细胞膜施加-100～+60 mV不同的钳制电压,没有发现1例具有KATP通道特性的电流活动；而在缺氧10 min后,封接成功的30例心肌细胞中有21例具有KATP通道特性,并有3例在钳制电压为-60 mV时可见有通道二级开放。为了排除其他通道电流活动的影响,我们在电极液中加有TTX阻断了Na+通道,用 CdCl2阻断了Ca+通道,再结合此通道具有较大的电流幅度,停止缺氧液灌注恢复台氏灌注液灌注2 min,通道电流消失(图1), 通道电流活动可以被浓度为2 mmol/L ATP所抑制等特性,证明此通道即为KATP通道。
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图1 短暂缺氧对KATP通道的激活作用
Fig.1 Effects of brief hypoxia on activation of KATP channel
c: close; o: opening
2.2.2 KATP通道的电流幅度及电导 用细胞贴附式记录时,电流幅度在同一钳制电压下基本相同,呈时间不等的方波。其幅度分布直方图呈对称的单峰状,能很好的进行正态分布拟合。在不同的钳制电压下,通道电流幅度算术均值和几何均值之间相比,无统计学上显著性差异(表1)。表1 表示的是在钳制电压为-20 mV、-40 mV、-60 mV时,通道电流幅度算术均值和几何均值两者相比,无显著性差异(P>0.05),说明为单通道电流。
表1 通道电流幅度的算术均值和几何均值的比较
, 百拇医药
Table 1 The comparision of current amplitude Holding
Arithemetic
Geometry
Vh / mV
I / pA
I / pA
-20
2.26±0.30
2.37±0.20
-40
3.82±0.57
, 百拇医药
3.93±0.36
-60
5.85±0.75
5.32±0.63
以钳制电位(holding potential，Vh / mV)水平为横坐标,相应通道外向电流幅值(outward current，Io/pA)为纵坐标,可见钳制电位在-60～0 mV范围内,各点排列基本成线性,位于一倾斜的直线上,说明通道无整流。在40 mV,上述直线的线性成分丧失,表示有轻微的内向整流电流成分参与。应用直线回归求出最佳拟合直线(图2,R=0.9),此即电流-电压关系曲线(I-V Curve),电导值即为该曲线斜率。该通道的电导值为89.7 pS(n=8)。I-V曲线与X轴相交处的电压值即为翻转电位,本组通道的翻转电位为2.2 mV,与K+的平衡电位0 mV极为接近,证明记录到的通道电流为钾离子通道电流。
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图2 KATP通道电流-电压(I-V)曲线
Fig.2 Current-Voltage relation curve
2.2.3 KATP通道的动力学特性 ①通道开放时间：缺氧诱导的心肌细胞KATP通道的开放以簇状开放为主。通道开放时间分布直方图呈指数分布,并可用双指数拟合。②通道的开放概率：在正常生理条件下，KATP通道通道开放概率(Po)为0。缺氧导致Po明显增加,在钳制电压为-20 mV、-40 mV 和-60 mV时，Po分别为0.219、0.337和 0.404。
2.2.4 通道的药理学特性 ①ATP的作用：完成吸附式记录后,将电极拉开,使电极下面的一小片细胞膜与细胞的其余部分分离,膜片内侧朝向浴槽液,当浴槽液中加入ATP,终浓度为2 mmol/L时,通道活动完全被抑制,证明记录的是KATP通道。②通道激活与Ca2+的关系：浴槽液用双蒸去离子水配制,并用5 mmol/L EGTA彻底鳌合溶液中可能含有的游离Ca2+,在进行细胞吸附式及内面向外式记录中,均可记录到通道的电流活动,表明通道的激活不受细胞内Ca2+的影响。
, 百拇医药
3 讨 论
随着对IP机制的深入探讨，有关KATP通道能在心肌细胞代谢障碍时发挥调节作用的报道日渐增多。基于目前在细胞水平探讨KATP通道在IP中作用的文献尚少, 短暂缺氧能否诱发KATP通道的开放仍存有争论[4,5]。故我们在细胞水平用膜片钳技术观察模拟IP时短暂缺氧对KATP通道的影响，本实验的结果证明，短暂缺氧10 min可以激活KATP通道。
我们用细胞贴附式记录通道情况,保证了细胞的完整,细胞的微环境及代谢未受到明显影响,比较接近在体情况,故用此方法记录缺氧引起的KATP通道的开放较符合实际情况。KATP通道的激活和失活受细胞内ATP浓度([ATP]i)的调控,此特性可作为其独特的鉴定方式,在细胞复氧后,或完成记录后进行内面向外式记录时加入正常生理条件下浓度(mmol/L)的ATP,均可使通道失活；再加上此通道I-V曲线与X轴交于静息膜电位(0 mV)附近,其翻转电位与钾离子平衡电位(Ek)很接近(因电极液与浴槽液钾离子浓度相等,Ek = 0 mV),表明此通道对钾离子选择性通透;电极液和浴槽液内含CdCl2和TTX阻断了Ca2+通道和Na+通道;本实验中记录的通道电导为89.7 pS与最近类似的文献报道相近(83 pS)[4]。综合以上几点说明我们实验中记录的是KATP通道,表明短暂缺氧后可激活KATP通道,进而发挥其保护心肌的作用。
, 百拇医药
有报道证明100 μmol/L的ATP即可抑制KATP通道的激活[6],但在缺血或缺氧的早期,心肌细胞内ATP浓度仍在mmol/L水平,那么KATP通道在缺血或低氧早期开放机制是怎样的呢？可能的机制是缺血心肌细胞内ATP的分布呈不均匀性, KATP通道附近ATP丢失较快,并且在缺血或缺氧情况下,ADP、H+、腺苷释放都增加,可以改变KATP通道对细胞内ATP敏感性, 从而使KATP通道活性增加。ADP不仅通过抑制ATP与KATP通道的结合,而促进通道的激活；而且也可结合二磷酸核苷酸(NDP)的位点，而促进通道活化，使 KATP通道活性增加[7],但确切的调节机制有待进一步研究。
基金项目：广东省博士启动基金资助项目(994054)
, 百拇医药 作者简介：冯 力(1966-)，女，河北石家庄人，博士，主治医师.
参考文献：
[1] Murry C E, Jennings R B, Reimer K A. Preconditioning with ischemia :a delay of lethal cell injury in ischemic myocardium [J].Circulation,1986,74(5):1124.
[2] Koning M M, Gho B C, Van Klaarwater E, et al. Rapid ventricular pacing produces myocardial protection by nonischemic activation of KATP channels [J].Circulation, 1996,93(1):178.
, http://www.100md.com
[3] Mizumura T, Nithipatikom K, Gross G J. Bimakalim an ATP-sensitive potassium channel opener mimics the effects of ischemic preconditioning to reduce infarct size,adenosine release,and neutrophil function in dogs [J].Circulation,1995,92(5):1236.
[4] Benndorf K, Bollmann G, Friedrich M, et al .Anoxia induces time-independent K+ current through K ATP channels in isolated heart cells of the guinea-pig[J]. J Physiol (Lond),1992,454:339.
, 百拇医药
[5] Yan G X, Yamada K A, Kleber A G, et al .Dissociation between cellular K+ loss, reduction in repolarization time,and tissue ATP levels during myocardial hypoxia and ischemia [J]. Circ Res, 1993,72(3):560.
[6] Ashcroft S J H, Ashcroft F M. Properties and functions of ATP-sensitive K-channels [J].Cell Signal,1990,2(1):197.
[7] Gribble F M, Ashfield R, Ammala C, et al. Properties of cloned ATP-sensitive K+ channels expressed in Xenopus oocytes[J].J Physiol (Lond), 1997, 498(Part 1):87.
收稿日期：2000-04-18, 百拇医药
单位：冯力(中山医科大学药理学教研室, 广东 广州 510089)；赵岐(广州军区广州总医院眼科, 广东 广州 510010)；刘杰(第一军医大学病理生理教研室， 广东 广州 510515)
关键词：缺氧复氧；钾通道；缺血预适应；心肌
00zk16
摘 要：【目的】 探讨KATP通道在心肌缺血预适应(IP)中的作用。【方法】 用膜片钳单通道记录技术的细胞贴附式研究急性短暂缺氧复氧对新鲜分离的豚鼠心肌细胞细胞膜KATP通道影响。【结果】 短暂缺氧10 min可明显引起细胞膜KATP通道的开放，缺氧诱导的KATP通道的开放以簇状开放为主。复氧2 min及用2 mmol/L ATP可抑制通道开放，其电导值为89.7 pS。缺氧使通道开放概率(Po)明显增加, 并可诱发通道出现二级开放。【结论】 短暂缺氧可以激活心肌细胞膜KATP通道的开放，说明心肌细胞膜KATP通道参与了IP的保护作用。
, 百拇医药
中图分类号： R972 文献标识码： A
文章编号： 1000-257X(2000)04S0-0056-04
The Effect on Cardiac Plasma Membrane KATP Channel by Brief Hypoxia
FENG Li
(Department of Pharmacology,Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510089,China)
ZHAO Qi
(Department of Ophthalmology,Guangzhou Military General Hospital, Guangzhou 510010, China)
, 百拇医药
LIU Jie
(Department of Physiopathology, the First Military Medical University, Guangzhou 510515, China)
Abstract： 【Objective】 In order to study the role of the cardiac myocyte membrane KATP channel in ischemic preconditioning(IP) in vitro. 【Method】 The effect of 10 min hypoxia on KATP channel of isolated ventricular myocyte was observed, by using patch clamp technique (cell-attached configuration). 【Result】 The result show that KATP channel can be easily opened by 10 min brief hypoxia, and inhibited by reoxygenation within 2 min or by 2 mmol/L ATP. The opening of KATP channel was in burst. The single-channel conductance activated by hypoxia was 89.7 pS, the Po (open state probability) was increased by hypoxia, and the secondary opening of KATP channel was also induced.【Conclusion】 Brief hypoxia could activated cardic plasma membrane KATP channel and the results proved that KATP channel should take part in the IP.
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Key words: anoxia and reoxygenation; potassium channels; ischemic preconditioning; myocardium
近几年的研究发现，给予多次短暂缺血和复灌后，心肌可以耐受随后长时间的缺血，梗塞面积可以缩小。这种多次短暂的缺血称为心肌缺血预适应(ischemic preconditioning,IP)[1]。许多实验证明KATP通道参与了IP的保护作用[2,3]，但缺乏在体外细胞水平KATP通道参与IP的证据。因此本实验采用新鲜分离的豚鼠心肌细胞，并模拟IP的短暂缺氧、复氧过程，直接观察在短暂缺氧环境下KATP通道开放的情况。
1 材料和方法
1.1 实验试剂
, 百拇医药
链酶蛋白酶E(pronase E)(Sigma)，优降糖(glybenclamide,GLY)(Sigma)。实验用液体配制：无钙台氏液(mmol/L)：NaCl 116, KCl 5.4, NaH2PO4 1.4, NaHCO3 15, MgSO4 1, Glucose 15, pH 7.3～7.4。台氏液(mmol/L)：NaCl 150, KCl 5.4, MgCl2 2, Glucose 10, HEPES 5, CaCl2 1.8, pH 7.3～7.4。浴槽液(mmol/L)：KCl 120, KOH 20, EGTA 5, Mg Cl2 1, TTX 0.001, HEPES 10, pH 7.3。电极液(mmol/L)：KCl 140, Mg Cl2 1, CaCl2 2, CdCl2 0.3, TTX 0.001, HEPES 10, pH 7.3。
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1.2 心室肌细胞的急性分离
健康豚鼠250～350 g,雌雄不拘,猛击枕部致昏,迅速打开胸腔,取出心脏,置于4 ℃无钙台氏液中冲洗,剪开心包,主动脉插管后固定于Langendoff灌流架上,用无钙台氏液经豚鼠主动脉逆行灌注离体心脏,将冠状动静脉中的血液冲净，后改用含链酶蛋白酶E 0.1 g/L, CaCl2 150 μmol/L的无钙台氏液50 mL，灌流2～3 min,可见心脏比原来膨胀30%～50%,立即切下心室肌,剪开心室腔,在上述含酶的无钙台氏液中用吸管洗去残留的血块并将心室肌切碎,在上述酶液中温孵3～5 min, 用细尼龙网过滤,去掉心室肌碎块,将上清液稀释5倍至含钙1.8 mmol/L的无钙台氏液(保育液)中,室温下保存,待用。
1.3 体外细胞水平模拟IP短暂缺氧复氧模型
将含有细胞的保育液滴入记录通道活动的浴槽内,先用台氏液灌流浴槽,使细胞表面保持清洁以利于与微电极形成高阻封接,封接成功后将台氏灌注液改为浴槽高钾缺氧液正式缺氧灌注10 min。此缺氧液的制备是在密闭玻璃容器中给灌注液通以体积分数为95% N2+5% CO2混合气体20～30 min,使灌注液氧分压降至4 kPa以下,以恒定的灌流速度灌注,同时在浴槽表面也通以体积分数为95% N2+5% CO2混合气体来保持浴槽内溶液的缺氧程度，缺氧10 min后改为通以体积分数为95% O2+5% CO2混合气体的台氏灌注液继续灌注。
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1.4 单离子通道记录
本实验采用膜片钳技术的细胞贴附式记录模式。记录用玻璃微电极的尖端直径约为0.5～1.5 μm,充灌液体后电阻约为8～16 MΩ 。内插乏极化氯化银电极与膜片钳放大器探头相连。单通道电流经膜片钳放大器放大,放大器探头反馈电阻为10 GΩ 。低通滤波频率为3 kHz,经Digidata转换,在Fetchex下采样。
1.5 资料分析
用pCLAMP分析程序Fetchan进行开关事件的测量,设定通道的开、关事件的时间分辨率为200 μs,测量幅度的时间分辨率为500 μs,本文时间资料分析只选用单级开放的资料。将测量结果用pSTAT程序进行统计分析。
2 结 果
2.1 分离的心肌细胞的形态学
, 百拇医药
用上述方法分离的细胞,在光学显微镜下约有30%～40%呈条柱状 细胞直径为20～60 μm不等,长度约40～150 μm。细胞边界清楚,横纹排列清楚，台盼蓝染色为活细胞。在实验中我们采用这些条柱状细胞进行细胞膜的离子通道研究,发现封接较容易,封接成功率为88%。
2.2 缺氧诱导心肌细胞膜KATP通道的激活及该通道的特点
2.2.1 KATP通道的激活及鉴定 用贴附式模式记录KATP通道,因细胞是完整的,在没有缺血、缺氧及代谢受抑制的情况下,一般记录不到KATP通道的开放,我们在封接成功的30例正常的豚鼠心肌细胞中,给予细胞膜施加-100～+60 mV不同的钳制电压,没有发现1例具有KATP通道特性的电流活动；而在缺氧10 min后,封接成功的30例心肌细胞中有21例具有KATP通道特性,并有3例在钳制电压为-60 mV时可见有通道二级开放。为了排除其他通道电流活动的影响,我们在电极液中加有TTX阻断了Na+通道,用 CdCl2阻断了Ca+通道,再结合此通道具有较大的电流幅度,停止缺氧液灌注恢复台氏灌注液灌注2 min,通道电流消失(图1), 通道电流活动可以被浓度为2 mmol/L ATP所抑制等特性,证明此通道即为KATP通道。
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图1 短暂缺氧对KATP通道的激活作用
Fig.1 Effects of brief hypoxia on activation of KATP channel
c: close; o: opening
2.2.2 KATP通道的电流幅度及电导 用细胞贴附式记录时,电流幅度在同一钳制电压下基本相同,呈时间不等的方波。其幅度分布直方图呈对称的单峰状,能很好的进行正态分布拟合。在不同的钳制电压下,通道电流幅度算术均值和几何均值之间相比,无统计学上显著性差异(表1)。表1 表示的是在钳制电压为-20 mV、-40 mV、-60 mV时,通道电流幅度算术均值和几何均值两者相比,无显著性差异(P>0.05),说明为单通道电流。
表1 通道电流幅度的算术均值和几何均值的比较
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Table 1 The comparision of current amplitude Holding
Arithemetic
Geometry
Vh / mV
I / pA
I / pA
-20
2.26±0.30
2.37±0.20
-40
3.82±0.57
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3.93±0.36
-60
5.85±0.75
5.32±0.63
以钳制电位(holding potential，Vh / mV)水平为横坐标,相应通道外向电流幅值(outward current，Io/pA)为纵坐标,可见钳制电位在-60～0 mV范围内,各点排列基本成线性,位于一倾斜的直线上,说明通道无整流。在40 mV,上述直线的线性成分丧失,表示有轻微的内向整流电流成分参与。应用直线回归求出最佳拟合直线(图2,R=0.9),此即电流-电压关系曲线(I-V Curve),电导值即为该曲线斜率。该通道的电导值为89.7 pS(n=8)。I-V曲线与X轴相交处的电压值即为翻转电位,本组通道的翻转电位为2.2 mV,与K+的平衡电位0 mV极为接近,证明记录到的通道电流为钾离子通道电流。
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图2 KATP通道电流-电压(I-V)曲线
Fig.2 Current-Voltage relation curve
2.2.3 KATP通道的动力学特性 ①通道开放时间：缺氧诱导的心肌细胞KATP通道的开放以簇状开放为主。通道开放时间分布直方图呈指数分布,并可用双指数拟合。②通道的开放概率：在正常生理条件下，KATP通道通道开放概率(Po)为0。缺氧导致Po明显增加,在钳制电压为-20 mV、-40 mV 和-60 mV时，Po分别为0.219、0.337和 0.404。
2.2.4 通道的药理学特性 ①ATP的作用：完成吸附式记录后,将电极拉开,使电极下面的一小片细胞膜与细胞的其余部分分离,膜片内侧朝向浴槽液,当浴槽液中加入ATP,终浓度为2 mmol/L时,通道活动完全被抑制,证明记录的是KATP通道。②通道激活与Ca2+的关系：浴槽液用双蒸去离子水配制,并用5 mmol/L EGTA彻底鳌合溶液中可能含有的游离Ca2+,在进行细胞吸附式及内面向外式记录中,均可记录到通道的电流活动,表明通道的激活不受细胞内Ca2+的影响。
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3 讨 论
随着对IP机制的深入探讨，有关KATP通道能在心肌细胞代谢障碍时发挥调节作用的报道日渐增多。基于目前在细胞水平探讨KATP通道在IP中作用的文献尚少, 短暂缺氧能否诱发KATP通道的开放仍存有争论[4,5]。故我们在细胞水平用膜片钳技术观察模拟IP时短暂缺氧对KATP通道的影响，本实验的结果证明，短暂缺氧10 min可以激活KATP通道。
我们用细胞贴附式记录通道情况,保证了细胞的完整,细胞的微环境及代谢未受到明显影响,比较接近在体情况,故用此方法记录缺氧引起的KATP通道的开放较符合实际情况。KATP通道的激活和失活受细胞内ATP浓度([ATP]i)的调控,此特性可作为其独特的鉴定方式,在细胞复氧后,或完成记录后进行内面向外式记录时加入正常生理条件下浓度(mmol/L)的ATP,均可使通道失活；再加上此通道I-V曲线与X轴交于静息膜电位(0 mV)附近,其翻转电位与钾离子平衡电位(Ek)很接近(因电极液与浴槽液钾离子浓度相等,Ek = 0 mV),表明此通道对钾离子选择性通透;电极液和浴槽液内含CdCl2和TTX阻断了Ca2+通道和Na+通道;本实验中记录的通道电导为89.7 pS与最近类似的文献报道相近(83 pS)[4]。综合以上几点说明我们实验中记录的是KATP通道,表明短暂缺氧后可激活KATP通道,进而发挥其保护心肌的作用。
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有报道证明100 μmol/L的ATP即可抑制KATP通道的激活[6],但在缺血或缺氧的早期,心肌细胞内ATP浓度仍在mmol/L水平,那么KATP通道在缺血或低氧早期开放机制是怎样的呢？可能的机制是缺血心肌细胞内ATP的分布呈不均匀性, KATP通道附近ATP丢失较快,并且在缺血或缺氧情况下,ADP、H+、腺苷释放都增加,可以改变KATP通道对细胞内ATP敏感性, 从而使KATP通道活性增加。ADP不仅通过抑制ATP与KATP通道的结合,而促进通道的激活；而且也可结合二磷酸核苷酸(NDP)的位点，而促进通道活化，使 KATP通道活性增加[7],但确切的调节机制有待进一步研究。
基金项目：广东省博士启动基金资助项目(994054)
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参考文献：
[1] Murry C E, Jennings R B, Reimer K A. Preconditioning with ischemia :a delay of lethal cell injury in ischemic myocardium [J].Circulation,1986,74(5):1124.
[2] Koning M M, Gho B C, Van Klaarwater E, et al. Rapid ventricular pacing produces myocardial protection by nonischemic activation of KATP channels [J].Circulation, 1996,93(1):178.
, http://www.100md.com
[3] Mizumura T, Nithipatikom K, Gross G J. Bimakalim an ATP-sensitive potassium channel opener mimics the effects of ischemic preconditioning to reduce infarct size,adenosine release,and neutrophil function in dogs [J].Circulation,1995,92(5):1236.
[4] Benndorf K, Bollmann G, Friedrich M, et al .Anoxia induces time-independent K+ current through K ATP channels in isolated heart cells of the guinea-pig[J]. J Physiol (Lond),1992,454:339.
, 百拇医药
[5] Yan G X, Yamada K A, Kleber A G, et al .Dissociation between cellular K+ loss, reduction in repolarization time,and tissue ATP levels during myocardial hypoxia and ischemia [J]. Circ Res, 1993,72(3):560.
[6] Ashcroft S J H, Ashcroft F M. Properties and functions of ATP-sensitive K-channels [J].Cell Signal,1990,2(1):197.
[7] Gribble F M, Ashfield R, Ammala C, et al. Properties of cloned ATP-sensitive K+ channels expressed in Xenopus oocytes[J].J Physiol (Lond), 1997, 498(Part 1):87.
收稿日期：2000-04-18, 百拇医药