Y的变不同时期糖尿病大鼠胰腺神经肽化
作者：傅茂 李秀钧
单位：傅茂(中山医科大学孙逸仙纪念医院内分泌科， 广东 广州 510120)；李秀钧(西医科大学附属第一医院内分泌科， 四川 成都 610041)
关键词：神经肽Y；糖尿病；实验性；胰腺；大鼠
00zk36
中图分类号： R364.2 文献标识码： A
文章编号： 1000-257X(2000)04S0-封2-03
神经肽Y与摄食、血压、心率、呼吸调节、平滑肌舒缩以及下丘脑神经内分泌调节等重要的生理功能有关。广泛分布于中枢神经系统和外周的许多器官。研究发现胰腺中动脉、导管、腺泡及胰岛周围均有神经肽Y阳性的神经分布[1]，胰岛内分泌细胞中也有神经肽Y阳性的细胞[2]，提示神经肽Y即可通过神经支配，也可通过旁分泌或自分泌来调节胰岛素的分泌。我们用免疫组织化学和原位杂交的方法，对链脲佐菌素(streptozocin, STZ)糖尿病大鼠胰腺中神经肽Y的变化情况进行了研究。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 STZ糖尿病大鼠模型建立
健康雌性Wistar大鼠(华西医大动物实验中心提供)30只，体质量180～250 g，用随机数字表将其分为3组，每组10只。1组作为正常对照，另2组给予STZ 50 mg.kg-1腹腔注射，注射后3 d测血糖，随机血糖达16.7 mmol.L-1者，诊断为糖尿病。血糖未达16.7mmol/L-1者立即腹腔补注STZ，50 mg.kg-1，大多数鼠经第二次注射后成模，未成模者予以淘汰。成糖尿病3周(第3周组)和24周(第24周组)后，分别于8：00至12：00时测血糖、胰岛素及体质量处死动物。
1.2 制 片
用戊巴比妥钠(40 mg.kg-1)腹腔注射麻醉，迅速取出胰腺，置甲醛中固定。常规脱水包埋。切成4 μm厚切片，裱于涂防脱片胶处理后的载玻片上，备用。
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1.3 免疫组化染色
常规免疫组化程序。NPY抗体(Sigma公司，1∶800)、胰岛素抗体(中山生物化学公司，1∶100)。空白对照用PBS代替一抗进行同样免疫组化染色。替代对照用正常兔血清代替一抗进行同样免疫组化染色。对照试验均为阴性。
1.4 原位杂交方法
含NPY的重组质粒PCRTMⅡ(由胡应和博士惠赠，Bayer公司)经Ecoli DH5α扩增和检测后，于T7和SP6启动子进行正义和反义地高辛探针标记(标记药盒购于Boehringer公司)。石蜡切片脱蜡，预处理后，加入Dig-cRNA-探针进行杂交，45 ℃过夜；然后用RNA酶A去除残余的RNA，加地高辛抗体，用NBT/BCIP染色。杂交反应对照和探针对照均为阴性。
1.5 图像分析
, http://www.100md.com
在图像分析系统(Micro Image Analysis System, MIAS-2000型，四川联合大学图像测试中心提供)测定每张胰腺切片中5个较完整的胰岛面积，计其中的阳性细胞数。
1.6 统计学处理
《中国医学百科全书、医学统计学》统计软件包进行统计，两样本均数比较用t检验，多个样本均数的比较用方差分析中的q检验。检验水准α=0.05。
2 结 果
2.1 动物的代谢情况
所有糖尿病大鼠均有典型多饮、多食、多尿、血糖增高及体重减轻的特点。糖尿病组血浆胰岛素较对照组明显降低(P<0.01)，第24周组较第3周组稍高，但无显著性差异(P>0.05)。第24周糖尿病组大多出现程度不等的白内障。
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2.2 STZ糖尿病鼠胰岛面积和胰岛中胰岛素及神经肽Y变情况
注射STZ后，第3周和第24周组糖尿病组胰岛的面积均较对照组明显缩小，第24周组虽较第3周组胰岛面积稍小，但无统计学差异。HE染色见糖尿病组胰岛内细胞数目减少，细胞间的结缔组织增加，细胞核异染色质增多，并有明显靠边现象。糖尿病大鼠胰岛中胰岛素阳性细胞数较对照鼠明显减少，第24周组与第3周组的阳性细胞数无差异。残存的胰岛素阳性细胞多位于胰岛的中央。
正常鼠神经肽Y阳性细胞(免疫反应阳性物质位于胞浆)多分布于胰岛的周边，胰岛中央也有一些神经肽Y阳性的细胞分布，但阳性反应较弱；在第3周糖尿病组，神经肽Y的含量较正常对照明显增加，阳性细胞在胰岛的中央、周边均可见，阳性细胞的界限欠清楚(图1A)。在第24周糖尿病组，神经肽Y阳性细胞较正常对照组增多，较第3周组减少，其差异均有统计学意义。第24周组神经肽Y阳性细胞中央周边均可见分布，且细胞界线清楚(图1B)。胰腺外分泌实质内可见神经肽Y阳性神经纤维分布于腺泡间、动脉外膜及胰岛周围。在胰腺的外分泌腺中未发现NPY的mRNA的表达，在正常大鼠胰岛中也未观察到神经肽Y mRNA的表达。但在糖尿病大鼠第3周时可发现胰岛内较多的细胞表达神经肽Y的mRNA，在胰岛周边和中央均有分布，中央分布要密集一些(图2A)。第24周组胰岛中也可见一些表达，散在分布于胰岛中，较第3周组明显减少(图2B)。
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图1 糖尿病大鼠胰岛中NPY阳性细胞
Fig.1 NPY-ir cells in pancreas of diabetic rat is
localized by a yellow-orange color
A: 3 weeks diabetic rat, B: 24 weeks diabetic rat (immunocytochemistry ×400)
图2 糖尿病大鼠胰岛中NPY mRNA阳性细胞
Fig.2 NPY mRNA cells in pancreas of 3 weeks diabetic
rat is localized by a blue color
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A: 3 weeks diabetic rat, B: 24 weeks diabetic rat (in situ hybridization ×400)
3 讨 论
我们的研究证实，在Wistar大鼠的的胰腺外分泌实质中可见神经肽Y阳性神经纤维分布，在动脉的外膜及胰岛周围可见神经肽Y阳性神经纤维围绕。研究证实刺激内脏自主神经可使胰静脉中神经肽Y含量增高3～7倍，神经肽Y增高可抑制胰腺的外分泌。神经肽Y的脑室灌注，可引起血中胰岛素水平增高[3]。提示神经肽Y神经可能参与胰腺外泌及内分泌的调节。
在鼠胚胎发育早期可见神经肽Y与胰岛素共存[4]，在培养的β细胞株中也发现有神经肽Y的mRNA表达[5]。故认为神经肽Y可能通过神经、旁分泌或自分泌来调节胰岛的内分泌功能。本研究观察到正常鼠胰岛的内分泌细胞中可见神经肽Y阳性细胞分布，神经肽Y阳性细胞主要分布于胰岛周边，在胰岛中央也可见一些阳性反应较弱的细胞，这和Louw[2]、Teitelman[6]等的报道相符合。本实验在正常大鼠胰岛中未观察到神经肽Y的mRNA表达，可能系正常大鼠胰岛中神经肽Y的mRNA含量少，用原位杂交方式未能显示出来。糖尿病鼠第3周和第24周组均发现有的NPY表达增加。引起胰岛内神经肽Y表达增加原因尚不清楚。
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在第24周糖尿病组胰岛的神经肽Y含量及mRNA水平均较第3周组低，说明随着糖尿病病程的延长，增高的神经肽Y可有所下降。其原因尚不完全清楚，第3周组神经肽Y含量多，可能与在第3周时β细胞破坏后，各种体内平衡受到破坏，胰岛内环境变化更大有关。第3周组神经肽Y阳性物质细胞界限不清，可能与β细胞破坏，神经肽Y的阳性物质释放到细胞间隙有关；也可能与表达神经肽Y的细胞将合成的神经肽Y释放入细胞间隙较多有关。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(399770351)
作者简介：傅 茂(1963-)，女，四川内江人；现中山医科大学孙逸仙纪念医院内分泌科博士后，1998年在华西医科大学获博士学位，讲师.
参考文献：
[1] De Giorgio R, Stemini C, Anderson K, et al. Tissue distribution an innervation pattem of peptide immunoreactivities in the rat pancreas [J]. Peptides, 1992,13(1):91.
, http://www.100md.com
[2] Louw J, Woodroof C W, Wolfe-coote S A. Distribution of endocrine cell displaying immunoreactivity for one or more peptides in the pancreas of adult vervet monkey (cercopithecus aethiops)[J]. Anat Res, 1997, 247(3):405.
[3] Zarjevski N, Cusin I, Vettor R, et al. Intracerebroventricular administration of neuropeptide Y to normal rats has divergent effects on glucose utilization by adipose tissue and skeletal muscle [J]. Diabetes, 1994, 43(6):764.
, 百拇医药
[4] Jackerott M, Qster A, Larsson L I. PYY in Developing murinislet Cells: comparisons to development of islet hormones, NPY and Brdu incorporation [J]. J Histochem Cytochem, 1996, 44(2):809.
[5] Waeber G, Thompson N, Waebar B, et al. Neuropeptide Y expression and regulation in differentiated rat insulinsecreting cell line [J]. Endocrinology， 1993,133(6):1061.
[6] Teitelman G, Alpert S, Polak J M, et al. Precursor cells of mouse endocrine pancreas coexpress insulin, glucagon and the neural proteins tyrosine hydroxylase and neuropeptide Y, but not pancreatic polypeptide [J]. Development, 1993,118(7):1031.
收稿日期：2000-03-20, http://www.100md.com
单位：傅茂(中山医科大学孙逸仙纪念医院内分泌科， 广东 广州 510120)；李秀钧(西医科大学附属第一医院内分泌科， 四川 成都 610041)
关键词：神经肽Y；糖尿病；实验性；胰腺；大鼠
00zk36
中图分类号： R364.2 文献标识码： A
文章编号： 1000-257X(2000)04S0-封2-03
神经肽Y与摄食、血压、心率、呼吸调节、平滑肌舒缩以及下丘脑神经内分泌调节等重要的生理功能有关。广泛分布于中枢神经系统和外周的许多器官。研究发现胰腺中动脉、导管、腺泡及胰岛周围均有神经肽Y阳性的神经分布[1]，胰岛内分泌细胞中也有神经肽Y阳性的细胞[2]，提示神经肽Y即可通过神经支配，也可通过旁分泌或自分泌来调节胰岛素的分泌。我们用免疫组织化学和原位杂交的方法，对链脲佐菌素(streptozocin, STZ)糖尿病大鼠胰腺中神经肽Y的变化情况进行了研究。
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1 材料与方法
1.1 STZ糖尿病大鼠模型建立
健康雌性Wistar大鼠(华西医大动物实验中心提供)30只，体质量180～250 g，用随机数字表将其分为3组，每组10只。1组作为正常对照，另2组给予STZ 50 mg.kg-1腹腔注射，注射后3 d测血糖，随机血糖达16.7 mmol.L-1者，诊断为糖尿病。血糖未达16.7mmol/L-1者立即腹腔补注STZ，50 mg.kg-1，大多数鼠经第二次注射后成模，未成模者予以淘汰。成糖尿病3周(第3周组)和24周(第24周组)后，分别于8：00至12：00时测血糖、胰岛素及体质量处死动物。
1.2 制 片
用戊巴比妥钠(40 mg.kg-1)腹腔注射麻醉，迅速取出胰腺，置甲醛中固定。常规脱水包埋。切成4 μm厚切片，裱于涂防脱片胶处理后的载玻片上，备用。
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1.3 免疫组化染色
常规免疫组化程序。NPY抗体(Sigma公司，1∶800)、胰岛素抗体(中山生物化学公司，1∶100)。空白对照用PBS代替一抗进行同样免疫组化染色。替代对照用正常兔血清代替一抗进行同样免疫组化染色。对照试验均为阴性。
1.4 原位杂交方法
含NPY的重组质粒PCRTMⅡ(由胡应和博士惠赠，Bayer公司)经Ecoli DH5α扩增和检测后，于T7和SP6启动子进行正义和反义地高辛探针标记(标记药盒购于Boehringer公司)。石蜡切片脱蜡，预处理后，加入Dig-cRNA-探针进行杂交，45 ℃过夜；然后用RNA酶A去除残余的RNA，加地高辛抗体，用NBT/BCIP染色。杂交反应对照和探针对照均为阴性。
1.5 图像分析
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在图像分析系统(Micro Image Analysis System, MIAS-2000型，四川联合大学图像测试中心提供)测定每张胰腺切片中5个较完整的胰岛面积，计其中的阳性细胞数。
1.6 统计学处理
《中国医学百科全书、医学统计学》统计软件包进行统计，两样本均数比较用t检验，多个样本均数的比较用方差分析中的q检验。检验水准α=0.05。
2 结 果
2.1 动物的代谢情况
所有糖尿病大鼠均有典型多饮、多食、多尿、血糖增高及体重减轻的特点。糖尿病组血浆胰岛素较对照组明显降低(P<0.01)，第24周组较第3周组稍高，但无显著性差异(P>0.05)。第24周糖尿病组大多出现程度不等的白内障。
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2.2 STZ糖尿病鼠胰岛面积和胰岛中胰岛素及神经肽Y变情况
注射STZ后，第3周和第24周组糖尿病组胰岛的面积均较对照组明显缩小，第24周组虽较第3周组胰岛面积稍小，但无统计学差异。HE染色见糖尿病组胰岛内细胞数目减少，细胞间的结缔组织增加，细胞核异染色质增多，并有明显靠边现象。糖尿病大鼠胰岛中胰岛素阳性细胞数较对照鼠明显减少，第24周组与第3周组的阳性细胞数无差异。残存的胰岛素阳性细胞多位于胰岛的中央。
正常鼠神经肽Y阳性细胞(免疫反应阳性物质位于胞浆)多分布于胰岛的周边，胰岛中央也有一些神经肽Y阳性的细胞分布，但阳性反应较弱；在第3周糖尿病组，神经肽Y的含量较正常对照明显增加，阳性细胞在胰岛的中央、周边均可见，阳性细胞的界限欠清楚(图1A)。在第24周糖尿病组，神经肽Y阳性细胞较正常对照组增多，较第3周组减少，其差异均有统计学意义。第24周组神经肽Y阳性细胞中央周边均可见分布，且细胞界线清楚(图1B)。胰腺外分泌实质内可见神经肽Y阳性神经纤维分布于腺泡间、动脉外膜及胰岛周围。在胰腺的外分泌腺中未发现NPY的mRNA的表达，在正常大鼠胰岛中也未观察到神经肽Y mRNA的表达。但在糖尿病大鼠第3周时可发现胰岛内较多的细胞表达神经肽Y的mRNA，在胰岛周边和中央均有分布，中央分布要密集一些(图2A)。第24周组胰岛中也可见一些表达，散在分布于胰岛中，较第3周组明显减少(图2B)。
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图1 糖尿病大鼠胰岛中NPY阳性细胞
Fig.1 NPY-ir cells in pancreas of diabetic rat is
localized by a yellow-orange color
A: 3 weeks diabetic rat, B: 24 weeks diabetic rat (immunocytochemistry ×400)
图2 糖尿病大鼠胰岛中NPY mRNA阳性细胞
Fig.2 NPY mRNA cells in pancreas of 3 weeks diabetic
rat is localized by a blue color
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A: 3 weeks diabetic rat, B: 24 weeks diabetic rat (in situ hybridization ×400)
3 讨 论
我们的研究证实，在Wistar大鼠的的胰腺外分泌实质中可见神经肽Y阳性神经纤维分布，在动脉的外膜及胰岛周围可见神经肽Y阳性神经纤维围绕。研究证实刺激内脏自主神经可使胰静脉中神经肽Y含量增高3～7倍，神经肽Y增高可抑制胰腺的外分泌。神经肽Y的脑室灌注，可引起血中胰岛素水平增高[3]。提示神经肽Y神经可能参与胰腺外泌及内分泌的调节。
在鼠胚胎发育早期可见神经肽Y与胰岛素共存[4]，在培养的β细胞株中也发现有神经肽Y的mRNA表达[5]。故认为神经肽Y可能通过神经、旁分泌或自分泌来调节胰岛的内分泌功能。本研究观察到正常鼠胰岛的内分泌细胞中可见神经肽Y阳性细胞分布，神经肽Y阳性细胞主要分布于胰岛周边，在胰岛中央也可见一些阳性反应较弱的细胞，这和Louw[2]、Teitelman[6]等的报道相符合。本实验在正常大鼠胰岛中未观察到神经肽Y的mRNA表达，可能系正常大鼠胰岛中神经肽Y的mRNA含量少，用原位杂交方式未能显示出来。糖尿病鼠第3周和第24周组均发现有的NPY表达增加。引起胰岛内神经肽Y表达增加原因尚不清楚。
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在第24周糖尿病组胰岛的神经肽Y含量及mRNA水平均较第3周组低，说明随着糖尿病病程的延长，增高的神经肽Y可有所下降。其原因尚不完全清楚，第3周组神经肽Y含量多，可能与在第3周时β细胞破坏后，各种体内平衡受到破坏，胰岛内环境变化更大有关。第3周组神经肽Y阳性物质细胞界限不清，可能与β细胞破坏，神经肽Y的阳性物质释放到细胞间隙有关；也可能与表达神经肽Y的细胞将合成的神经肽Y释放入细胞间隙较多有关。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(399770351)
作者简介：傅 茂(1963-)，女，四川内江人；现中山医科大学孙逸仙纪念医院内分泌科博士后，1998年在华西医科大学获博士学位，讲师.
参考文献：
[1] De Giorgio R, Stemini C, Anderson K, et al. Tissue distribution an innervation pattem of peptide immunoreactivities in the rat pancreas [J]. Peptides, 1992,13(1):91.
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[2] Louw J, Woodroof C W, Wolfe-coote S A. Distribution of endocrine cell displaying immunoreactivity for one or more peptides in the pancreas of adult vervet monkey (cercopithecus aethiops)[J]. Anat Res, 1997, 247(3):405.
[3] Zarjevski N, Cusin I, Vettor R, et al. Intracerebroventricular administration of neuropeptide Y to normal rats has divergent effects on glucose utilization by adipose tissue and skeletal muscle [J]. Diabetes, 1994, 43(6):764.
, 百拇医药
[4] Jackerott M, Qster A, Larsson L I. PYY in Developing murinislet Cells: comparisons to development of islet hormones, NPY and Brdu incorporation [J]. J Histochem Cytochem, 1996, 44(2):809.
[5] Waeber G, Thompson N, Waebar B, et al. Neuropeptide Y expression and regulation in differentiated rat insulinsecreting cell line [J]. Endocrinology， 1993,133(6):1061.
[6] Teitelman G, Alpert S, Polak J M, et al. Precursor cells of mouse endocrine pancreas coexpress insulin, glucagon and the neural proteins tyrosine hydroxylase and neuropeptide Y, but not pancreatic polypeptide [J]. Development, 1993,118(7):1031.
收稿日期：2000-03-20, http://www.100md.com