骨与软组织肿瘤的细胞及分子生物学
作者：郭卫 冯传汉 徐万鹏
单位：北京大学人民医院骨肿瘤科 100044
关键词：
中华骨科杂志00zk09
1997年国际分子医学大会的召开，预示21世纪的医学将是分 子医学。骨与软组织肿瘤的发生、发展以及临床诊治，涉及分 子和细胞生物学的多方面。为此，本文概述了骨与软组织肿 瘤的分子及细胞生物学研究进展，为骨肿瘤科医生提供有关的 基础知识。
一、肿瘤形成的基础知识
肿瘤是因控制细胞增殖的基因发生变异或突变而诱导生成 的细胞群系(克隆)。基因突变由DNA损伤造成，正常细胞恶变 与DNA损伤程度平行。肿瘤细胞抗拒正常细胞周期的调控信号 ，而失去正常细胞、组织的功能。
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从分子生物学的观点来看，人类恶性肿瘤(包括骨肿瘤) 可分为两种类型。一种类型的肿瘤存在特定的分子生物学(基 因)改变，并由此导致肿瘤的发生。另一类肿瘤则存在多种 分子生物学上的改变，后者被认为是由于细胞经受多次打击而 形成。人类肿瘤发生的分子生物学机制，包括以下几点:
1.抗癌或抑癌基因的突变或丢失，如Rb、p53基因。
2.癌基因的激活或转录增强，如MDM2、CDK4。
3.两种基因由于染色体易位而导致融合，形成恶性转化因 子，如FLI1/EWS、ERG/EWS。
4.DNA转录修复基因的活性丧失，如p53。
近年结肠癌的研究表明，正常细胞恶变需要通过两个相当 复杂的但不偶联的途径:(1)促进DNA转录、翻译和复制，并且这 一过程不恰当地持续下去；(2)细胞增殖的控制或抑制失效。
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有数以百计的参与细胞生长的基因，如果它们有质量或数 量异常，或是功能亢进，就成为癌基因(oncogenes)。癌基因启 动后的产物(蛋白)能活跃细胞接受、转导(transduction)信号， 从而引起细胞核的一系列活动。癌基因等位基因之一的突变 能支配细胞的转(恶)变，它是显性基因。
上述的第二个途径是控制细胞增殖基因(抑癌基因)的突变 。例如:第一个被确定为抑制生长的蛋白，即视网膜母细胞瘤( retinoblastoma)蛋白(pRB-1)能起抑制基因表达作用，它的突变导致 无限制的细胞增生，见于视网膜母细胞瘤和一些骨肉瘤。另 一个抑癌蛋白p53能阻止细胞进入S期，p53基因的突变，丧失原 有功能，见于恶性(尤其是晚期)肿瘤，如骨肉瘤、软骨肉瘤 。
抑癌基因是隐性基因，一对等位基因必须都突变，才能出 现表型(phenotype)而发生肿瘤。突变的抑癌基因可以遗传，如 家族性视网膜母细胞瘤综合征(RB-1)基因及Li-Fraumeni综合 征，即家族性早期乳腺癌合并有软组织肉瘤及其他肿瘤(p53) 基因。如在这些家族中，父体或母体的性细胞遗传给子女一 个对位基因，如果传自另一亲体的相关对位基因随后也发生突 变，即出现肿瘤发生(tumorigenesis)。
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在人体内细胞的分化程度和范围是不同的，虽然成人细胞 不保留分化成任何一种或各种细胞的能力。结缔组织中的原始 间充质细胞，称为干细胞，能分化为某一特异细胞，如果情 况要求这样调控。骨髓、血液及骨膜的多潜能干细胞能成为骨 母细胞、纤维母细胞、软骨母细胞，它取决于局部及全身的 刺激。DNA的变化是肿瘤形成的另外一种机制，如果一个已经完 全分化的细胞表达正常时不表达的部分DNA，即可被刺激而继 续这种细胞复制周期，从而形成肿瘤，这一机制成为渐成或后 成发生(epigenesis)，它与突变(引发突变)发生不同，后者 细胞的DNA有一定的改变。若渐成发生的子细胞，继续读出这一 限区DNA，就形成肿瘤细胞产生肿瘤。临床上，渐成发生机制 很可能解释良性侵袭性肿瘤形成，而不是恶性肿瘤产生的方式 。然而，恶性肿瘤产生与良性肿瘤同一起源，可产生与起源 细胞正常功能不同的蛋白和酶，渐成发生机制可能说明这一现象。
二、细胞周期及其控制
正常细胞周期分为五期:
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1.G0期(静止期):细胞处于静止状态。
2.G1期:细胞分裂自此开始，首先有一定量核DNA增加而进入 下期。
3.S期:DNA含量增加，接近倍增。
4.G2期:DNA量为正常的一倍。
5.M期:细胞一分为二。
随后，分裂的细胞进入静止G0期或G1期而重复细胞周期。精 子或卵子DNA含量是测定细胞DNA的基准，称为单倍体(haploid) ，它是正常细胞DNA的一半，正常细胞DNA含量为二倍体(diploid )或称为2CDNA，S期及M期细胞DNA含量是四倍体或4C。
, 百拇医药 细胞进入和完成一个周期，是处于严格控制的，启动因素 是细胞外刺激，它向细胞发出需要同类细胞的信号(信号的实 质目前尚不清楚)。信号被核DNA读出之后，就产生周期素(C yclin)激酶(磷酸根转移酶-Kinase)和其他的蛋白及酶，刺激 细胞分裂。如果不需要更多的细胞，信息通过DNA传回给细胞， 分裂终止。细胞分裂过程持续存在于各个器官，例如，骨折 时骨母细胞大量增殖，直至骨折愈合。
良性及恶性肿瘤的形成，存在着失控的(病理性)细胞分 裂，即瘤细胞无论需要与否，一直繁殖下去。这是由异常刺激 (癌基因)或是限制细胞分裂的蛋白(抑癌基因)的缺失所 决定的。
这种失控可因DNA负责细胞分裂的部分或是负责产生刺激细 胞分裂因子(生长因子)的部分机能不良(异常)，两者中哪 一种机制或两种协同起作用，尚不清楚。大多数学者认为，细胞分裂失控是整个细胞周期的 功能失常，而不仅限于分裂期，是DNA的改变导致肿瘤发生。
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癌基因一词是指任何以显性方式支配肿瘤发生的DNA异常改 变。这种改变常常很小，仅是核苷酸的一个或几个序列的改变 ，称为点突变(point mutation)，是80年代才发现的，迅速扩展了 对癌基因及其功能的认识。近年发现了许多个癌基因，至少有 几个位于DNA控制细胞周期的部分，有一些位于担当产生刺激 细胞增生蛋白(生长因子)的部分，还有一些其功能尚未明确 。癌基因作用于细胞膜的受体，或于细胞内一个转导体，或 直接作用于胞核的转录因子，导致细胞分裂失控形成肿瘤。
近年的研究表明抑癌基因直接作用于控制细胞周期的结构 。细胞周期素(Cyclins目前已发现三种)和激酶(磷酸根转移酶 -Kinase)直接控制细胞周期，作用于不同时间，以控制细胞周 期。目前认为p53，正常(所谓野生型)作用于周期素阻滞细 胞周期而抑制其增殖。如果p53缺失或突变，则导致细胞周期无 约束的继续。
癌基因或突变型抑癌基因仅存在于肿瘤细胞内，称为体细 胞缺陷(somatic defect)，它被看作是最常见的导致肿瘤形成的DNA 改变。当DNA复制时，出现错误，就产生这种缺陷(突变)。致 癌物质和放射线照射损害DNA，从而增加上述DNA突变，被传到 子细胞而形成肿瘤，但不传给后代。细胞分裂时，DNA出现变动 可能是经常发生的，大部分有下列转归:(1)不改变该细胞的行 为；(2)阻碍细胞繁殖；(3)被DNA修复机制修复。
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当癌基因或突变型抑癌基因存在于某一个体的每一细胞时 ，它被称作胚细胞系缺陷(germetic defect)。它可通过配子传至后 代，胚细胞系突变经常是抑癌基因(属于隐性基因)。因此， 除非另一(第二个)对位基因有突变，不然不会发生肿瘤。
研究最多的肌骨系统肿瘤的抑癌基因突变是视网膜母细胞 瘤(RB-1)基因，原是在家族性视网膜母细胞瘤(retinoblastoma，RB)中发现的，当初认为此基因对RB是特异的，但 后来发现其与数种与RB无关的肿瘤有联系，包括骨肉瘤。
RB可以是散在的或在家族内发生。家族型RB在13号染色体上 有改变，RB患者的胚细胞中有一个Rb等位基因的异常，本身不 能产生RB，它们需要附加的体细胞缺陷共同作用而致癌。患者 自一个亲体经遗传获得带有Rb基因的胚细胞系缺陷，并自另一 个亲体获得正常的DNA。只要亲体一条染色体的DNA是正常的，抑 癌作用就存在，而细胞表现正常行为。若是后一条链上的对 位基因也不正常，即两个等位基因都不正常，就成为首发的RB 细胞。非家族性RB，Rb基因的突变是散发的，所以RB的发生率 少得多。
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家族性RB患者中，骨肉瘤的发生率增高是已知的事实。80年 代中期发现骨肉瘤细胞中，可有Rb基因异常。目前认为Rb基因 异常至少是形成骨肉瘤的机制之一。虽然近年发现更多的家族 性恶性肿瘤，但认为骨-肌细胞系统的肿瘤更多是体细胞的 突变。
Wilm瘤(由肾胚胎成分构成，发展迅速的恶性肿瘤)及神经 母细胞瘤(神经系统的恶性肿瘤)，也以家族形式发生。家 族性肿瘤的瘤细胞的形成，必须有胚系细胞缺陷附加有体细胞 缺陷，后者在DNA复制时发生，多种突变原(mutagen)如放射性 物质射线、化学物质氮芥、环磷酰胺(烷化剂)、多环芳香碳 氢化合物与之有关。致癌物质(carcinogen)近年认为也是突变 原。继Rb基因之后，另一与骨肌肿瘤有关的突变型抑癌基因p53 被发现，它位于17号染色体，见于骨肉瘤、软骨肉瘤和乳腺癌 、结肠癌、肺癌。正常(野生型)p53在细胞周期中阻止细胞分 裂，包括受损伤的细胞。这样，正常机制能使受损细胞DNA得 到修复，而不传至子细胞。当p53缺失或突变，受损的细胞DNA继 续复制传至子细胞繁殖而形成肿瘤。
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近年在探讨肿瘤如何形成中有意义的进展是认识瘤细胞在 它们复制DNA时可发生的体系基因缺陷，改变瘤子细胞的行为与 性能，这是与原亲代瘤细胞相比较而言的，这可能解释良性 肿瘤可变为恶性肿瘤的原因，如神经纤维瘤转化为神经纤维肉 瘤。这种机制也可能解释一种不寻常的肿瘤自然缓释现象， 最多见的是神经母细胞瘤转化为良性的神经节瘤。它不象是简 单的细胞系死亡，而是瘤细胞在其复制DNA的过程中丢失其恶 性潜能，包括转移的能力；另一种解释是，恶性细胞死亡，遗 留下良性细胞。
三、骨与软组织肿瘤的细胞遗传学研究
本世纪初德国Boveri首先提出肿瘤可能是染色体平衡失调的 结果。50年代细胞遗传学技术的发展，确定了人类染色体的准 确数目。70年代显带技术的发现，才能识别每一条染色体及其 细微异常，使肿瘤染色体的分析有了可靠的基础。近年癌基因 的发现及其在人类染色体的定位，以及癌基因转化激活学说 的提出，进一步促进了肿瘤染色体的研究。
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许多癌基因的位点，恰好是某些肿瘤染色体畸变的频发部 位。1984年Aurias首先发现Ewing肉瘤11、12号染色体有特异的易位 即t(11;12)(q24;12)。Turc-Carel等(1988)报告85例Ewing肉瘤染色体 分析，80%有上述异常。然而，该畸变不仅发生在Ewing肉瘤， 相同的畸变，也可发生于原始神经外胚瘤、感觉神经细胞瘤及 小细胞型骨肉瘤，说明这些肿瘤之间可能具有相关性。在一 部分前述肿瘤中t(11;12)是唯一的异常，说明它属于原发畸变， 而在多数肿瘤，除此以外，还有更多的继发畸变如Ewing肉瘤中 有8号染色体三体型(Trisonmy8)，衍生性16号(der16)(q10;p10)，1 号与16号染色体易位t(1,16)。
特异性的染色体畸变也见于其他骨与软组织肿瘤如横纹肌 肉瘤的t(2;13)(q37;q14)，滑膜肉瘤的t(X；18)(p11.2;q11.2)，粘液性脂 肪肉瘤的t(12；16)(q13;p11)(表1)。
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表1 肉瘤中染色体的改变
肿瘤
染色体改变
滑膜细胞肉瘤
t(X;18)(p11.2;q11.2)
Ewing肉瘤
t(11;22)(q24;q12)
原始神经外胚瘤
t(11;22)(q24;q12)
小细胞型骨肉瘤
t(11;22)(q24;q12)
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神经母细胞瘤
der(1)(p32;p36)
脂肪肉瘤(粘液性)
t(12;16)(q13;q11)
视网膜母细胞瘤
der(13)(q37;q14)
横纹肌肉瘤(腺泡型)
t(2;13)(q37;q14)
骨外粘液性软骨肉瘤
t(9;15;22) (q31;q25;q12.2)
感觉神经母细胞瘤
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t(11;22) (q24;q12)
多数骨肉瘤有较高的染色体数目和复杂的畸变。畸变主要 是缺失、易位标记(Marker)染色体，以13号染色体单体或部分 丢失较为常见(HovigE,1991;Sxhwartz,HS1992)。郭卫(1993)分析2 例骨肉瘤染色体中，有一例有58条及XY，A组+2，B组+2，C组- 3，D组-1，E组+3，F组+2，G组+2，5号有标志染色体，7号及 12号染色体缺长臂。
骨巨细胞瘤是介于良、恶性之间的潜在恶性骨肿瘤，其染 色体畸变相对的简单，主要为染色体末端缺失、端端易位形成 双着丝粒染色体、环状染色体等。Bridge(1992)报告，最常受累 的染色体是11p、13p、15p、18p、19p和21p。数目异常表现为亚二倍体及多倍 体。Schwartz(1989,1991)和Bardi(1991)分别报告最常受累的断裂点为1 9q、20q及15p。郭卫(1993)在13例骨巨细胞瘤中，发现8例出现双 着丝粒染色体(60.5%)，较多受累的染色体有4q、8q、5q、17p 、18p及22p；有6例出现多倍体核型，几乎所有病例都可出现亚 二倍体核型；其他可见的结构畸变有环状染色体、双微体、易 位，倒位及标记染色体，后者占半数以上；有2例未发现染色 体异常，3例有克隆性改变。Bridge认为有染色体畸变的病例组 中复发率高。以上所见，充分说明骨巨细胞瘤的潜在恶性。
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在恶性纤维组织细胞瘤(MFH)中已经发现一些非随机性的 断裂点，常出现在1、3、11、19号染色体，末端缺失及双着丝粒 染色体在MFH中也是常见的(Mandahl,1988,1989)。良性肿瘤也会有 规律性的染色体改变，不过较为简单。
肿瘤多种复杂性的染色体畸变，可以说明有细胞遗传学的 差异，它与肿瘤中存在多个细胞克隆有关。
Ewing肉瘤近年的病理组织学分类归属于骨小圆细胞肿瘤( 包括小细胞肉瘤、骨淋巴瘤、原始神经外胚瘤)。然而，Ewing 肉瘤、原始神经外胚瘤(primitive neuroectodermal tumor,PNET)和感觉 神经母细胞瘤有相同的染色体相互易位，提示后述三种肿瘤 有相似的产生机制或有接近的甚至相同的起源，也说明肿瘤分 类今后会随着细胞分子生物学的发展而更新，其趋向于着重 基因的点突变而不限于染色体的大体缺失。
四、与骨和软组织肉瘤发生有关的癌基因及抗癌基因(表2 )
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表2 人类骨骼肌肉系统肿瘤相关基因及其染色体定位
基因
染色体定位
肿瘤类型
癌基因
SAS
12q13-14
恶性纤维组织细胞瘤、骨肉瘤、软组织肉瘤
MDM2
多种组织类型肉瘤
(与p53蛋白结合使失活)
骨肉瘤(与发展转移有关)
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c-mye
8q24
Burkitt淋巴瘤、骨肉瘤
(可伴有Rb基因位点结构改变)
ras
不同染色体
骨肉瘤；关系街定
c-fos
14q21-31
骨肉瘤
抑癌基因
P16多种肿瘤抑制因子
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9p21
骨肉瘤(p16蛋白与CDK4特异性
结合蛋白，使失活)
P53(野生型)
17p13
小细胞肺癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、食管癌、骨肉瘤中发现突变
RB
13p14
视网膜母细胞瘤、骨肉瘤、胃癌、小细胞肺癌、导管型乳腺癌
WT
11p
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Wilm瘤、横纹肌肉瘤、乳腺癌、卵巢癌
DCC
18q
结肠癌(骨肉瘤多在18号
染色体有变异)
NF
多发性神经纤维瘤
(一)癌基因
1.SAS(sarcoma amplified sequance)基因，最初从恶性组织细胞瘤( MFH)分离出来，定位于染色体12q13-14，编码蛋白(TM4SF)。Ta rkkanen(1996)用互补基因组杂交法检测11例人骨肉瘤，8例有SAS扩 增。SAS基因与肿瘤的生长、转移高度恶性有关，在人的软组织 肉瘤中可有某些扩增。
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2.MDM2(murine double minute2)基因，是从含有双微体(double minute,DMS)的自发转化的鼠BALA/C3T3细胞株中分离出来的。该株 细胞具有多种转化细胞特性，裸鼠接种能致癌。每个细胞有20 ～30个DMS。用重组DNA文库分离DNA序列，证实基因扩增序列位于 DMS。有3个不同的基因即MDM1～3，位于鼠10号染色体，只有MDM2 能致癌。
Oliner等(1992)成功地克隆人的MDM2基因，定位于人的12q13- 14，转录5.5kb的mRNA，编码的蛋白相对分子质量为90×103。MDM 2蛋白是一种锌脂蛋白，半衰期为30min。
Hinds(1990)证实MDM2基因产物是p90蛋白，此蛋白既能与野生型 p53蛋白结合，又能与突变型p53蛋白结合，形成p53-p90蛋白结合 物。MDM2基因的表达能抑制p53基因的反式激活作用，因而对p53 功能起负调节作用。
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突变型p53基因与MDM2蛋白结合，则可提高MDM2表达水平，增 强恶性转化，这可解释为什么在恶性肿瘤中p53基因的错意突变 (Misesense mutation)比失功能突变(nonsense mutation)更为常见，因 为突变的p53蛋白比不表达的更具有致瘤性(Wolf等，1984)。
最近的研究已经表明，MDM2是p53介导的基因调节靶之一，MD M2含有一个顺作用元件，MDM2与p53蛋白结合从而调节其转录活动 ，提示在细胞内p53-MDM2自反馈环在维持MDM2/p53比值中起关键 作用(Oliner 1993,Price 1994)。
Oliner(1992)分析一组47例肉瘤组织，29%有MDM2扩增至5～50倍 。Landanyi(1993)在28例高度恶性骨肉瘤中发现4例(14%)有MDM2基 因扩增，3例为肺转移，1例为复发。
王新生等(1995)在24例骨肉瘤中发现2例有MDM2基因扩增， 均为肺转移病例，分别扩增18～20倍。20例骨巨细胞瘤中未见此 基因扩增，上述两种肿瘤均未见此基因重排。
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3.c-myc基因，位于8q24，其活性与细胞生长分裂密切相关。 Schwab(1985)发现c-myc在小鼠SEWA骨肉瘤细胞及其细胞系中有 mRNA表达水平增加。Ozaki(1993)发现人骨肉瘤及其细胞系中有c-m yc扩增，同时有Rb基因位点结构改变，临床上恶性进展迅速， 且有转移倾向，提示c-myc与Rb基因可能有协同作用。
(二)抑癌基因
1.p16基因，又称多种肿瘤抑制因子(MTS-1)或p16/CDKN2基 因，位于9p21区。由148个氨基酸组成CDK相关蛋白，即p16蛋白(S errano等1993)。p16与细胞周期性依赖性激酶4(Cyclin-dependent kinase4，CDK4)特异性结合使后者失活，对细胞周期起反向调节 作用。p16基因缺失在50%的瘤细胞存在，而骨肉瘤细胞系中达 60%(Nobori等，Kamb等，1994)。Miller等(1996)在52例骨肉瘤中 观察8例有p16缺失。
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p16蛋白是直接作用于细胞周期的抑癌因子(区别于p53蛋白 ，它在细胞内起作用，抑制生长)。p16及Rb蛋白和CDK在细胞周 期调控中也相互作用(Yan，1994)。
2.p53基因以其产生的核磷酸蛋白相对分子质量为53×103而 得名，定位于17p13。p53野生型有抑制细胞转化的功能，在调节 细胞生长中起重要作用，主要是阻止细胞在周期中进入S期。 其突变型基因的半衰期远较野生型者长，并与其产生的蛋白存 留在瘤细胞内。突变型p53基因不启动癌变，但促其发展。
Bartek等(1990)发现170例乳腺癌中54%有p53基因蛋白高表达，良性病变则没有。并用28例中3例证实癌蛋白(oncoprotein)的高表达是p53基因突变的结果，只有恶性病变中才发生。
Masuda等(1987)首先报告骨肉瘤中p53基因的重组。Toguchida等 (1989)发现37例中28例的17号染色体在p53基因位点上有杂合子 缺失(包括等位基因缺失)。Chandler等(1992)及Miller等(1990 )有同样的报道。
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郭卫与王新生(p53geneabnormalitiesinosteosarcoma.ChinMedJ，1 996，109:752)报告46例骨肉瘤中27例(58.7%)有p53蛋白高表达， 其细胞DNA含量高于低表达者，DNA指数分别为1.34+0.44及1.21+0 .35，差异有显著性意义。有肺转移者高表达者为75%，而无转 移者为55.5%。DNA(Southern)印迹分析46例骨肉瘤，7例(15.2%)有 结构异变，此百分比较文献上报道偏低，可能是缺乏测定杂 合子的技术与设备有关，同时也与Southern印迹法不能测出点突 变有关。
王新生(1995)用Southern杂交分析24例骨肉瘤标本中4例有p53基 因重排，其中3例出现异常带型，1例有片段的杂合性缺失。在 20例骨巨细胞瘤中，发现1例的原发灶无异常而其复发病变有4. 0kb的纯合性缺失，并在8.0kb多出一条带。
p53基因的改变包括丢失、基因重排、点突变所致失活联合 作用。MDM2基因与p53基因结合，阻止了p53的功能，如MDM2过量， 导致p53完全失活，细胞转化产生肿瘤。
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Chen等(1996)发现MDM2抑制p53对细胞G1期(有学者提出S期) 生长停滞和引起细胞凋亡的功能。
3.Rb基因，是第一个分离克隆出来的抑癌基因(Lee,1987)， 定位于染色体13q14，能产生一种多肽(p105-RB)，是一种磷酸 化的抗癌蛋白(AOP)。抑癌基因通过其AOP与相关的基因DNA结合 起作用，而封闭癌基因，抑制刺激细胞生长的因素。
野生型Rb基因产生的蛋白质，在正常细胞中有抑制细胞过 度增殖的效应，是抑制信号传导通路的组成部分。实验结果证 明Rb基因及其产物的生物学功能丢失后，细胞脱离正常生长抑 制，生长因子产生异常或不适当的激活细胞生长，使肿瘤发 生(Xu等,1994;Qin等,1995)。
Dryja(1986)最先报告Rb基因的突变与骨肉瘤发生的关系，他在 4例骨肉瘤细胞DNA的限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)分析中发现3例出现13号染色体长臂基因的 结合化，使该染色体上的隐性等位基因的表型得到表达。Togu chida(1988)用Rb基因cDNA探针对30例骨肉瘤细胞DNA进行Southern印迹分 析，发现13例(43%)有Rb基因异常，其中7例杂合性缺失，6例 为半合性缺失或重排。RFLP分析表明甚至在Southern杂合无明显R b基因结构异常的骨肉瘤，也有13号染色体特定位点的杂合性缺 失。
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Araki(1991)报告23例骨肉瘤，Southern杂交中8例(35%)Rb基因 结构异常，其中3例为纯合性缺失，5例为杂合性缺失。8例缺失 中7例发生在HindⅢ酶切所得的7.5kb片段上。5例进行Northern杂 交，4例未见Rb基因表达。
Rb基因的改变主要是缺失和微小改变。Feugeas等(1996)发现 Rb基因的杂合性(heterozygosity)缺失，提示骨肉瘤患者预后不 良，同时这可能是骨肉瘤发生的关键因素。
Rb基因的失活在骨肉瘤的发生中起重要作用，将正常人Rb基 因导入有Rb基因缺失的骨肉瘤细胞，可有效地限制其生长。
五、骨与软组织恶性肿瘤的分子生物学异常及其诊断方法 (表3)
表3 骨与软组织肉瘤中主要的特异性染色体易位及受累基因
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肿瘤类型
染色体易位
基因
Ewing肉瘤/原发性神经外胚瘤
t(11;22)(q24;q12)
FLII.EWS
t(21;22)(q22;q12)
ERC,EWS
t(7;22)(p22;q12)
ETV1,EWS
透明细胞性肉瘤
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FTF1,EWS
结缔组织性小圆细胞肉瘤
t(11;22)(p13;q12)
WT1,EWS
粘液性脂肪肉瘤
t(12;16)(q13;p11)
CHOP,TLS
腺泡状横纹肌肉瘤
t(2;13)(q35;q14)
PAX3,FKHR
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t(1;13)(p36;q14)
PAX7,FKHR
滑膜肉瘤
t(X;18)(p11;q11)
SSX;SYT
骨外粘液性软骨肉瘤
t(9;22)(q22;q12)
CHN
(一)骨肉瘤
高度恶性的经典骨肉瘤存在明显的多倍体改变及多发染色 体异常。至今已发现几个重要的基因改变与成骨肉瘤的发生有 关。Rb基因异常是成骨肉瘤发生的第一个线索。Rb基因的改变 是视神经母细胞瘤发生的原因，成骨肉瘤经常继发于视网膜母细胞瘤患者。Rb基因的改变在原发性成骨肉瘤 中也很多见。约有60%～75%的成骨肉瘤存在Rb基因的异常。丢 失一个Rb等位基因的骨肉瘤比带有正常Rb基因的骨肉瘤更具恶 性。在具有p53基因突变的Li-Fraumeni综合征的家族中，骨肉瘤 的发生率明显增高。该现象提示p53基因改变是骨肉瘤发生的另 一重要因素。p53基因的突变约发生于45%的成骨肉瘤中。其它 基因的改变，进一步促成了成骨肉瘤的发生，如c-myc及c-fo s基因的扩增及高表达。MDM2是一个p53基因的调节蛋白。MDM2基因 的扩增可抑制p53基因的活性，使细胞丧失p53基因调节的生长 控制，从而导致肿瘤的发生。已发现MDM2基因的扩增存在于部 分不同类型的肉瘤中，包括成骨肉瘤、纤维肉瘤、脂肪肉瘤等 。
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(二)软骨肉瘤
软骨肉瘤是原发恶性骨肿瘤中仅次于成骨肉瘤的第二好发 肿瘤。基于肿瘤细胞分化的不同，组织学上可分为三级。Ⅰ 级为低度恶性,Ⅲ级为高度恶性，Ⅱ级居两者之间。近来的研 究发现EXT1和EXT2基因的异常与家族遗传性骨软骨瘤有关，因而 认为EXT1和EXT2在继发性软骨肉瘤中起重要作用。许多基因的改 变被证实与其临床生物学行为有关。如同在成骨肉瘤一样，p5 3、Rb及MDM2基因的改变也被发现存在于部分软骨肉瘤中，且与 临床的恶性行为相关。
(三)Ewing肉瘤
Ewing肉瘤是在青少年中仅次于成骨肉瘤的第二好发的原发 性恶性骨肿瘤。Ewing肉瘤是骨的未分化小圆细胞肉瘤。原始神 经外胚瘤(PNET)是原发于软组织中的小圆细胞肉瘤，与Ewing肉 瘤不同的是，PNET具有神经外胚层分化的特点。Ewing肉瘤和原 始神经外胚瘤都具有11号和22号染色体的相互易位t(11;22)或21号 和22号染色体的相互易位t(21;22)。这些染色体的相互易位导致 了EWS基因与FLI1基因或ERG基因的重排。EWS基因位于22号染色体22 q12，其产物是一个RNA结合蛋白。FLI1基因是位于11号染色体上的 一个癌基因，其产物是一个恶性转化因子。Ewing肉瘤中EWS基因 与FLI1基因重排后形成了一个融合基因，其产物比单纯FLI1基因 的产物具有更强大的转化活性。该转化因子被认为是形成Ewin g肉瘤的关键。FLI1基因与EWS/FLI1融合基因的产物被证明可与c- myc癌基因的启动子结合，从而激活c-myc基因，增加c-myc癌基 因的表达。
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Ewing肉瘤中第二种常见的染色体易位是21号与22号t(21;22),因 而导致了EWS与ERG基因的重排。ERG基因与FIL1基因相似，其产物 也是一个转化因子。EWS基因、ERG基因重排后，增强了后者的转 化活性，导致了Ewing肉瘤的发生。
在染色体水平上，约86%的Ewing肉瘤可被检测到有11号和22 号染色体的相互易位。应用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)的 方法，90%左右的Ewing肉瘤可被检测到有EWS/FLI1的融合基因的转 录(RNA)，另外约有5%～10%的Ewing肉瘤有EWS/ERG的融合基因 的转录。因而应用RT-PCR的检测方法，95%以上的Ewing肉瘤或PN ET可得到准确诊断。由于EWS和FLI1基因的断裂点位置的差别， 由此形成EWS/FLI1融合基因的亚型(亚型I～Ⅶ)。最近的研究证 实，不同融合基因亚型的Ewing肉瘤具有不同的预后，因而EWS/F LI1融合基因的检测不但具有诊断意义，而且具有评价预后的意 义。
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(四)横纹肌肉瘤
通过比较胚胎样横纹肌肉瘤的DNA与正常体细胞的DNA发现， 该肿瘤细胞具有染色体11p15.5的异常。基因图分析显示，该部 位存在胰岛素样生长因子(IGF-2)基因。进一步的研究发现, 无论是在胚胎样横纹肌肉瘤，还是腺泡样横纹肌肉瘤中都有IG F-2mRNA的高表达，而且这种高表达只存在于肿瘤细胞内，肿 瘤细胞周围的基质细胞中没有IGF-2的表达。因而认为IGF-2基 因的异常，可能与横纹肌肉瘤的发生有关。然而IGF-2是一个 癌基因，研究发现在11p15.5的区域存在有基因的丢失，所以在 该部位存在一个抗癌基因。h19是位于11p15.5部位的一个抗癌基 因。h19基因的突变或缺失或许是IGF-2高表达的原因。深入的 研究仍在进行中。
虽然胚胎样横纹肌肉瘤与人的胚胎骨骼肌相象，但是腺泡 样横纹肌肉瘤是一种高度恶性的小圆细胞肿瘤。腺泡样横纹肌 肉瘤经常发生转移，且有时可与Ewing肉瘤、原发性神经外胚瘤 及淋巴瘤等相混淆。细胞遗传学研究发现80%以上的腺泡样横 纹肌肉瘤细胞存在2号与13号染色体的相互易位t(2;13)。分子生 物学的研究显示由于染色体的易位导致了位于2号染色体上的P AX3基因与位于13号染色体上的FKHR基因发生重排。PAX3基因被认 为是早期神经、肌肉分化的重要转录调节因子。而FKHR基因的 产物是一个转化因子。PAX3基因与FKHR基因的融合基因产物被认 为是导致腺泡样横纹肌肉瘤发生的原因。
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(五)粘液性脂肪肉瘤
脂肪肉瘤是仅次于恶性纤维组织细胞瘤的第二好发的软组 织恶性肿瘤。粘液性脂肪肉瘤是脂肪肉瘤中最常见的亚型，约 占脂肪肉瘤的40%～50%。肿瘤由增殖活跃的脂肪细胞与粘液 基质组成。粘液性脂肪肉瘤具有12号与16号染色体相互易位t(12 ;16)的特征。CHOP基因是位于12号染色体12q13.1-q13.2部位的一个 基因。CHOP基因的正常激活与脂肪细胞的分化有密切关系，并 控制脂肪细胞的增殖。TLS基因位于16号染色体16p11。TLS基因产 物与EWS基因产物相似，是一个RNA结合蛋白。TLS基因与CHOP基因 重排所产生的融合蛋白不仅失去对脂肪细胞增殖的控制，且干 扰了CHOP基因的正常功能。因而认为TLS/CHOP基因的重排导致了 粘液样脂肪肉瘤的发生。
(六)滑膜肉瘤
典型的滑膜肉瘤好发于青年人，位于关节周围。肿瘤包含 有上皮性和/或梭形肿瘤细胞,因而肿瘤被分为双相或单相分化 两种类型。90%以上的滑膜肉瘤是有X和18号染色体的相互易位 t(X;18)，由此产生的X染色体上的SSX与18号染色体上的SYT基因 的重排。RT-PCR方法可检测到95%以上的滑膜肉瘤有SSX/SYT融合 基因的转录(mRNA)。单相或双相分化的两种滑膜肉瘤都可检 测到有SSX/SYT融合基因的表达。普遍认为SSX/SYT基因的重排是滑 膜肉瘤发生的遗传学基础。与Ewing肉瘤一样，由于SSX和SYT基因断裂点的不同可产生不同的SSX/S YT融合基因的亚型。最新的研究提示不同的SSX和SYT亚型可能具 有提示预后的意义。
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(七)骨与软组织肿瘤分子诊断方法
恶性骨与软组织肿瘤的诊断经常遇到困难，检测肿瘤特异 的染色体易位为某些困难的病例提供了有益的鉴别诊断方法。 同时，在有些肿瘤这种染色体易位还具有提示预后的意义。 例如小圆细胞肉瘤中可包括Ewing肉瘤、原发神经外胚瘤、网状 细胞肉瘤、小圆细胞型骨肉瘤、淋巴瘤、腺泡状横纹肌肉瘤等 ，因而存在诊断上的困难。然而，通过细胞或分子遗传学的 方法，可检测肿瘤是否存有特异的染色体易位或特异的融合基 因(如Ewing肉瘤和原发神经外胚瘤的EWS/FLI、EWS/ERG融合基因， 腺泡状横纹肌肉瘤的PAX3/FKHR)。常见的分子诊断方法:
1.反转录PCR(RT-PCR):RT-PCR是检查融合基因转录的主要方 法。该方法是通过在两个基因融合点的前后，各设计一个引 物(primer)，该引物的DNA序列与两个融合基因处于融合点附近的 cDNA序列互补。通过PCR方法可扩增该融合部位的cDNA(mRNA序列)。 因而可确定这种细胞是否存在这种融合基因。另外，通过定量 RT-PCR方法，还可以检测出这种融合基因表达水平的高低。对 研究融合基因表达水平与肿瘤分化程度的关系有重要意义。 通过RT-PCR方法检测融合基因是骨与软组织肿瘤分子病理诊断 的最常用手段。
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2.染色体原位杂交(FISH):这种方法主要是应用不同的染色 体特异性DNA片断(探针)来检查染色体的易位、基因重排。该方 法的优点是无需制备细胞分裂中期染色体，细胞处于分裂间 期也可检查。最近的研究显示，即使是石蜡包埋的肿瘤组织， 也能成功地检测出特异性的基因重排。
3.DNA分子杂交(southern blot):该方法是通过提取肿瘤细胞的DNA ，用特异性的DNA基因片断(探针)与肿瘤细胞的DNA进行杂交， 来检测相关基因是否完整，是否有基因的丢失、重排或扩增 。如在Ewing肉瘤中，95%以上的肿瘤可检测到EWS基因的重排。
参考文献
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(收稿日期:1999-08-01), 百拇医药
单位：北京大学人民医院骨肿瘤科 100044
关键词：
中华骨科杂志00zk09
1997年国际分子医学大会的召开，预示21世纪的医学将是分 子医学。骨与软组织肿瘤的发生、发展以及临床诊治，涉及分 子和细胞生物学的多方面。为此，本文概述了骨与软组织肿 瘤的分子及细胞生物学研究进展，为骨肿瘤科医生提供有关的 基础知识。
一、肿瘤形成的基础知识
肿瘤是因控制细胞增殖的基因发生变异或突变而诱导生成 的细胞群系(克隆)。基因突变由DNA损伤造成，正常细胞恶变 与DNA损伤程度平行。肿瘤细胞抗拒正常细胞周期的调控信号 ，而失去正常细胞、组织的功能。
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从分子生物学的观点来看，人类恶性肿瘤(包括骨肿瘤) 可分为两种类型。一种类型的肿瘤存在特定的分子生物学(基 因)改变，并由此导致肿瘤的发生。另一类肿瘤则存在多种 分子生物学上的改变，后者被认为是由于细胞经受多次打击而 形成。人类肿瘤发生的分子生物学机制，包括以下几点:
1.抗癌或抑癌基因的突变或丢失，如Rb、p53基因。
2.癌基因的激活或转录增强，如MDM2、CDK4。
3.两种基因由于染色体易位而导致融合，形成恶性转化因 子，如FLI1/EWS、ERG/EWS。
4.DNA转录修复基因的活性丧失，如p53。
近年结肠癌的研究表明，正常细胞恶变需要通过两个相当 复杂的但不偶联的途径:(1)促进DNA转录、翻译和复制，并且这 一过程不恰当地持续下去；(2)细胞增殖的控制或抑制失效。
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有数以百计的参与细胞生长的基因，如果它们有质量或数 量异常，或是功能亢进，就成为癌基因(oncogenes)。癌基因启 动后的产物(蛋白)能活跃细胞接受、转导(transduction)信号， 从而引起细胞核的一系列活动。癌基因等位基因之一的突变 能支配细胞的转(恶)变，它是显性基因。
上述的第二个途径是控制细胞增殖基因(抑癌基因)的突变 。例如:第一个被确定为抑制生长的蛋白，即视网膜母细胞瘤( retinoblastoma)蛋白(pRB-1)能起抑制基因表达作用，它的突变导致 无限制的细胞增生，见于视网膜母细胞瘤和一些骨肉瘤。另 一个抑癌蛋白p53能阻止细胞进入S期，p53基因的突变，丧失原 有功能，见于恶性(尤其是晚期)肿瘤，如骨肉瘤、软骨肉瘤 。
抑癌基因是隐性基因，一对等位基因必须都突变，才能出 现表型(phenotype)而发生肿瘤。突变的抑癌基因可以遗传，如 家族性视网膜母细胞瘤综合征(RB-1)基因及Li-Fraumeni综合 征，即家族性早期乳腺癌合并有软组织肉瘤及其他肿瘤(p53) 基因。如在这些家族中，父体或母体的性细胞遗传给子女一 个对位基因，如果传自另一亲体的相关对位基因随后也发生突 变，即出现肿瘤发生(tumorigenesis)。
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在人体内细胞的分化程度和范围是不同的，虽然成人细胞 不保留分化成任何一种或各种细胞的能力。结缔组织中的原始 间充质细胞，称为干细胞，能分化为某一特异细胞，如果情 况要求这样调控。骨髓、血液及骨膜的多潜能干细胞能成为骨 母细胞、纤维母细胞、软骨母细胞，它取决于局部及全身的 刺激。DNA的变化是肿瘤形成的另外一种机制，如果一个已经完 全分化的细胞表达正常时不表达的部分DNA，即可被刺激而继 续这种细胞复制周期，从而形成肿瘤，这一机制成为渐成或后 成发生(epigenesis)，它与突变(引发突变)发生不同，后者 细胞的DNA有一定的改变。若渐成发生的子细胞，继续读出这一 限区DNA，就形成肿瘤细胞产生肿瘤。临床上，渐成发生机制 很可能解释良性侵袭性肿瘤形成，而不是恶性肿瘤产生的方式 。然而，恶性肿瘤产生与良性肿瘤同一起源，可产生与起源 细胞正常功能不同的蛋白和酶，渐成发生机制可能说明这一现象。
二、细胞周期及其控制
正常细胞周期分为五期:
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1.G0期(静止期):细胞处于静止状态。
2.G1期:细胞分裂自此开始，首先有一定量核DNA增加而进入 下期。
3.S期:DNA含量增加，接近倍增。
4.G2期:DNA量为正常的一倍。
5.M期:细胞一分为二。
随后，分裂的细胞进入静止G0期或G1期而重复细胞周期。精 子或卵子DNA含量是测定细胞DNA的基准，称为单倍体(haploid) ，它是正常细胞DNA的一半，正常细胞DNA含量为二倍体(diploid )或称为2CDNA，S期及M期细胞DNA含量是四倍体或4C。
, 百拇医药 细胞进入和完成一个周期，是处于严格控制的，启动因素 是细胞外刺激，它向细胞发出需要同类细胞的信号(信号的实 质目前尚不清楚)。信号被核DNA读出之后，就产生周期素(C yclin)激酶(磷酸根转移酶-Kinase)和其他的蛋白及酶，刺激 细胞分裂。如果不需要更多的细胞，信息通过DNA传回给细胞， 分裂终止。细胞分裂过程持续存在于各个器官，例如，骨折 时骨母细胞大量增殖，直至骨折愈合。
良性及恶性肿瘤的形成，存在着失控的(病理性)细胞分 裂，即瘤细胞无论需要与否，一直繁殖下去。这是由异常刺激 (癌基因)或是限制细胞分裂的蛋白(抑癌基因)的缺失所 决定的。
这种失控可因DNA负责细胞分裂的部分或是负责产生刺激细 胞分裂因子(生长因子)的部分机能不良(异常)，两者中哪 一种机制或两种协同起作用，尚不清楚。大多数学者认为，细胞分裂失控是整个细胞周期的 功能失常，而不仅限于分裂期，是DNA的改变导致肿瘤发生。
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癌基因一词是指任何以显性方式支配肿瘤发生的DNA异常改 变。这种改变常常很小，仅是核苷酸的一个或几个序列的改变 ，称为点突变(point mutation)，是80年代才发现的，迅速扩展了 对癌基因及其功能的认识。近年发现了许多个癌基因，至少有 几个位于DNA控制细胞周期的部分，有一些位于担当产生刺激 细胞增生蛋白(生长因子)的部分，还有一些其功能尚未明确 。癌基因作用于细胞膜的受体，或于细胞内一个转导体，或 直接作用于胞核的转录因子，导致细胞分裂失控形成肿瘤。
近年的研究表明抑癌基因直接作用于控制细胞周期的结构 。细胞周期素(Cyclins目前已发现三种)和激酶(磷酸根转移酶 -Kinase)直接控制细胞周期，作用于不同时间，以控制细胞周 期。目前认为p53，正常(所谓野生型)作用于周期素阻滞细 胞周期而抑制其增殖。如果p53缺失或突变，则导致细胞周期无 约束的继续。
癌基因或突变型抑癌基因仅存在于肿瘤细胞内，称为体细 胞缺陷(somatic defect)，它被看作是最常见的导致肿瘤形成的DNA 改变。当DNA复制时，出现错误，就产生这种缺陷(突变)。致 癌物质和放射线照射损害DNA，从而增加上述DNA突变，被传到 子细胞而形成肿瘤，但不传给后代。细胞分裂时，DNA出现变动 可能是经常发生的，大部分有下列转归:(1)不改变该细胞的行 为；(2)阻碍细胞繁殖；(3)被DNA修复机制修复。
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当癌基因或突变型抑癌基因存在于某一个体的每一细胞时 ，它被称作胚细胞系缺陷(germetic defect)。它可通过配子传至后 代，胚细胞系突变经常是抑癌基因(属于隐性基因)。因此， 除非另一(第二个)对位基因有突变，不然不会发生肿瘤。
研究最多的肌骨系统肿瘤的抑癌基因突变是视网膜母细胞 瘤(RB-1)基因，原是在家族性视网膜母细胞瘤(retinoblastoma，RB)中发现的，当初认为此基因对RB是特异的，但 后来发现其与数种与RB无关的肿瘤有联系，包括骨肉瘤。
RB可以是散在的或在家族内发生。家族型RB在13号染色体上 有改变，RB患者的胚细胞中有一个Rb等位基因的异常，本身不 能产生RB，它们需要附加的体细胞缺陷共同作用而致癌。患者 自一个亲体经遗传获得带有Rb基因的胚细胞系缺陷，并自另一 个亲体获得正常的DNA。只要亲体一条染色体的DNA是正常的，抑 癌作用就存在，而细胞表现正常行为。若是后一条链上的对 位基因也不正常，即两个等位基因都不正常，就成为首发的RB 细胞。非家族性RB，Rb基因的突变是散发的，所以RB的发生率 少得多。
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家族性RB患者中，骨肉瘤的发生率增高是已知的事实。80年 代中期发现骨肉瘤细胞中，可有Rb基因异常。目前认为Rb基因 异常至少是形成骨肉瘤的机制之一。虽然近年发现更多的家族 性恶性肿瘤，但认为骨-肌细胞系统的肿瘤更多是体细胞的 突变。
Wilm瘤(由肾胚胎成分构成，发展迅速的恶性肿瘤)及神经 母细胞瘤(神经系统的恶性肿瘤)，也以家族形式发生。家 族性肿瘤的瘤细胞的形成，必须有胚系细胞缺陷附加有体细胞 缺陷，后者在DNA复制时发生，多种突变原(mutagen)如放射性 物质射线、化学物质氮芥、环磷酰胺(烷化剂)、多环芳香碳 氢化合物与之有关。致癌物质(carcinogen)近年认为也是突变 原。继Rb基因之后，另一与骨肌肿瘤有关的突变型抑癌基因p53 被发现，它位于17号染色体，见于骨肉瘤、软骨肉瘤和乳腺癌 、结肠癌、肺癌。正常(野生型)p53在细胞周期中阻止细胞分 裂，包括受损伤的细胞。这样，正常机制能使受损细胞DNA得 到修复，而不传至子细胞。当p53缺失或突变，受损的细胞DNA继 续复制传至子细胞繁殖而形成肿瘤。
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近年在探讨肿瘤如何形成中有意义的进展是认识瘤细胞在 它们复制DNA时可发生的体系基因缺陷，改变瘤子细胞的行为与 性能，这是与原亲代瘤细胞相比较而言的，这可能解释良性 肿瘤可变为恶性肿瘤的原因，如神经纤维瘤转化为神经纤维肉 瘤。这种机制也可能解释一种不寻常的肿瘤自然缓释现象， 最多见的是神经母细胞瘤转化为良性的神经节瘤。它不象是简 单的细胞系死亡，而是瘤细胞在其复制DNA的过程中丢失其恶 性潜能，包括转移的能力；另一种解释是，恶性细胞死亡，遗 留下良性细胞。
三、骨与软组织肿瘤的细胞遗传学研究
本世纪初德国Boveri首先提出肿瘤可能是染色体平衡失调的 结果。50年代细胞遗传学技术的发展，确定了人类染色体的准 确数目。70年代显带技术的发现，才能识别每一条染色体及其 细微异常，使肿瘤染色体的分析有了可靠的基础。近年癌基因 的发现及其在人类染色体的定位，以及癌基因转化激活学说 的提出，进一步促进了肿瘤染色体的研究。
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许多癌基因的位点，恰好是某些肿瘤染色体畸变的频发部 位。1984年Aurias首先发现Ewing肉瘤11、12号染色体有特异的易位 即t(11;12)(q24;12)。Turc-Carel等(1988)报告85例Ewing肉瘤染色体 分析，80%有上述异常。然而，该畸变不仅发生在Ewing肉瘤， 相同的畸变，也可发生于原始神经外胚瘤、感觉神经细胞瘤及 小细胞型骨肉瘤，说明这些肿瘤之间可能具有相关性。在一 部分前述肿瘤中t(11;12)是唯一的异常，说明它属于原发畸变， 而在多数肿瘤，除此以外，还有更多的继发畸变如Ewing肉瘤中 有8号染色体三体型(Trisonmy8)，衍生性16号(der16)(q10;p10)，1 号与16号染色体易位t(1,16)。
特异性的染色体畸变也见于其他骨与软组织肿瘤如横纹肌 肉瘤的t(2;13)(q37;q14)，滑膜肉瘤的t(X；18)(p11.2;q11.2)，粘液性脂 肪肉瘤的t(12；16)(q13;p11)(表1)。
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表1 肉瘤中染色体的改变
肿瘤
染色体改变
滑膜细胞肉瘤
t(X;18)(p11.2;q11.2)
Ewing肉瘤
t(11;22)(q24;q12)
原始神经外胚瘤
t(11;22)(q24;q12)
小细胞型骨肉瘤
t(11;22)(q24;q12)
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神经母细胞瘤
der(1)(p32;p36)
脂肪肉瘤(粘液性)
t(12;16)(q13;q11)
视网膜母细胞瘤
der(13)(q37;q14)
横纹肌肉瘤(腺泡型)
t(2;13)(q37;q14)
骨外粘液性软骨肉瘤
t(9;15;22) (q31;q25;q12.2)
感觉神经母细胞瘤
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t(11;22) (q24;q12)
多数骨肉瘤有较高的染色体数目和复杂的畸变。畸变主要 是缺失、易位标记(Marker)染色体，以13号染色体单体或部分 丢失较为常见(HovigE,1991;Sxhwartz,HS1992)。郭卫(1993)分析2 例骨肉瘤染色体中，有一例有58条及XY，A组+2，B组+2，C组- 3，D组-1，E组+3，F组+2，G组+2，5号有标志染色体，7号及 12号染色体缺长臂。
骨巨细胞瘤是介于良、恶性之间的潜在恶性骨肿瘤，其染 色体畸变相对的简单，主要为染色体末端缺失、端端易位形成 双着丝粒染色体、环状染色体等。Bridge(1992)报告，最常受累 的染色体是11p、13p、15p、18p、19p和21p。数目异常表现为亚二倍体及多倍 体。Schwartz(1989,1991)和Bardi(1991)分别报告最常受累的断裂点为1 9q、20q及15p。郭卫(1993)在13例骨巨细胞瘤中，发现8例出现双 着丝粒染色体(60.5%)，较多受累的染色体有4q、8q、5q、17p 、18p及22p；有6例出现多倍体核型，几乎所有病例都可出现亚 二倍体核型；其他可见的结构畸变有环状染色体、双微体、易 位，倒位及标记染色体，后者占半数以上；有2例未发现染色 体异常，3例有克隆性改变。Bridge认为有染色体畸变的病例组 中复发率高。以上所见，充分说明骨巨细胞瘤的潜在恶性。
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在恶性纤维组织细胞瘤(MFH)中已经发现一些非随机性的 断裂点，常出现在1、3、11、19号染色体，末端缺失及双着丝粒 染色体在MFH中也是常见的(Mandahl,1988,1989)。良性肿瘤也会有 规律性的染色体改变，不过较为简单。
肿瘤多种复杂性的染色体畸变，可以说明有细胞遗传学的 差异，它与肿瘤中存在多个细胞克隆有关。
Ewing肉瘤近年的病理组织学分类归属于骨小圆细胞肿瘤( 包括小细胞肉瘤、骨淋巴瘤、原始神经外胚瘤)。然而，Ewing 肉瘤、原始神经外胚瘤(primitive neuroectodermal tumor,PNET)和感觉 神经母细胞瘤有相同的染色体相互易位，提示后述三种肿瘤 有相似的产生机制或有接近的甚至相同的起源，也说明肿瘤分 类今后会随着细胞分子生物学的发展而更新，其趋向于着重 基因的点突变而不限于染色体的大体缺失。
四、与骨和软组织肉瘤发生有关的癌基因及抗癌基因(表2 )
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表2 人类骨骼肌肉系统肿瘤相关基因及其染色体定位
基因
染色体定位
肿瘤类型
癌基因
SAS
12q13-14
恶性纤维组织细胞瘤、骨肉瘤、软组织肉瘤
MDM2
多种组织类型肉瘤
(与p53蛋白结合使失活)
骨肉瘤(与发展转移有关)
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c-mye
8q24
Burkitt淋巴瘤、骨肉瘤
(可伴有Rb基因位点结构改变)
ras
不同染色体
骨肉瘤；关系街定
c-fos
14q21-31
骨肉瘤
抑癌基因
P16多种肿瘤抑制因子
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9p21
骨肉瘤(p16蛋白与CDK4特异性
结合蛋白，使失活)
P53(野生型)
17p13
小细胞肺癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、食管癌、骨肉瘤中发现突变
RB
13p14
视网膜母细胞瘤、骨肉瘤、胃癌、小细胞肺癌、导管型乳腺癌
WT
11p
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Wilm瘤、横纹肌肉瘤、乳腺癌、卵巢癌
DCC
18q
结肠癌(骨肉瘤多在18号
染色体有变异)
NF
多发性神经纤维瘤
(一)癌基因
1.SAS(sarcoma amplified sequance)基因，最初从恶性组织细胞瘤( MFH)分离出来，定位于染色体12q13-14，编码蛋白(TM4SF)。Ta rkkanen(1996)用互补基因组杂交法检测11例人骨肉瘤，8例有SAS扩 增。SAS基因与肿瘤的生长、转移高度恶性有关，在人的软组织 肉瘤中可有某些扩增。
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2.MDM2(murine double minute2)基因，是从含有双微体(double minute,DMS)的自发转化的鼠BALA/C3T3细胞株中分离出来的。该株 细胞具有多种转化细胞特性，裸鼠接种能致癌。每个细胞有20 ～30个DMS。用重组DNA文库分离DNA序列，证实基因扩增序列位于 DMS。有3个不同的基因即MDM1～3，位于鼠10号染色体，只有MDM2 能致癌。
Oliner等(1992)成功地克隆人的MDM2基因，定位于人的12q13- 14，转录5.5kb的mRNA，编码的蛋白相对分子质量为90×103。MDM 2蛋白是一种锌脂蛋白，半衰期为30min。
Hinds(1990)证实MDM2基因产物是p90蛋白，此蛋白既能与野生型 p53蛋白结合，又能与突变型p53蛋白结合，形成p53-p90蛋白结合 物。MDM2基因的表达能抑制p53基因的反式激活作用，因而对p53 功能起负调节作用。
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突变型p53基因与MDM2蛋白结合，则可提高MDM2表达水平，增 强恶性转化，这可解释为什么在恶性肿瘤中p53基因的错意突变 (Misesense mutation)比失功能突变(nonsense mutation)更为常见，因 为突变的p53蛋白比不表达的更具有致瘤性(Wolf等，1984)。
最近的研究已经表明，MDM2是p53介导的基因调节靶之一，MD M2含有一个顺作用元件，MDM2与p53蛋白结合从而调节其转录活动 ，提示在细胞内p53-MDM2自反馈环在维持MDM2/p53比值中起关键 作用(Oliner 1993,Price 1994)。
Oliner(1992)分析一组47例肉瘤组织，29%有MDM2扩增至5～50倍 。Landanyi(1993)在28例高度恶性骨肉瘤中发现4例(14%)有MDM2基 因扩增，3例为肺转移，1例为复发。
王新生等(1995)在24例骨肉瘤中发现2例有MDM2基因扩增， 均为肺转移病例，分别扩增18～20倍。20例骨巨细胞瘤中未见此 基因扩增，上述两种肿瘤均未见此基因重排。
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3.c-myc基因，位于8q24，其活性与细胞生长分裂密切相关。 Schwab(1985)发现c-myc在小鼠SEWA骨肉瘤细胞及其细胞系中有 mRNA表达水平增加。Ozaki(1993)发现人骨肉瘤及其细胞系中有c-m yc扩增，同时有Rb基因位点结构改变，临床上恶性进展迅速， 且有转移倾向，提示c-myc与Rb基因可能有协同作用。
(二)抑癌基因
1.p16基因，又称多种肿瘤抑制因子(MTS-1)或p16/CDKN2基 因，位于9p21区。由148个氨基酸组成CDK相关蛋白，即p16蛋白(S errano等1993)。p16与细胞周期性依赖性激酶4(Cyclin-dependent kinase4，CDK4)特异性结合使后者失活，对细胞周期起反向调节 作用。p16基因缺失在50%的瘤细胞存在，而骨肉瘤细胞系中达 60%(Nobori等，Kamb等，1994)。Miller等(1996)在52例骨肉瘤中 观察8例有p16缺失。
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p16蛋白是直接作用于细胞周期的抑癌因子(区别于p53蛋白 ，它在细胞内起作用，抑制生长)。p16及Rb蛋白和CDK在细胞周 期调控中也相互作用(Yan，1994)。
2.p53基因以其产生的核磷酸蛋白相对分子质量为53×103而 得名，定位于17p13。p53野生型有抑制细胞转化的功能，在调节 细胞生长中起重要作用，主要是阻止细胞在周期中进入S期。 其突变型基因的半衰期远较野生型者长，并与其产生的蛋白存 留在瘤细胞内。突变型p53基因不启动癌变，但促其发展。
Bartek等(1990)发现170例乳腺癌中54%有p53基因蛋白高表达，良性病变则没有。并用28例中3例证实癌蛋白(oncoprotein)的高表达是p53基因突变的结果，只有恶性病变中才发生。
Masuda等(1987)首先报告骨肉瘤中p53基因的重组。Toguchida等 (1989)发现37例中28例的17号染色体在p53基因位点上有杂合子 缺失(包括等位基因缺失)。Chandler等(1992)及Miller等(1990 )有同样的报道。
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郭卫与王新生(p53geneabnormalitiesinosteosarcoma.ChinMedJ，1 996，109:752)报告46例骨肉瘤中27例(58.7%)有p53蛋白高表达， 其细胞DNA含量高于低表达者，DNA指数分别为1.34+0.44及1.21+0 .35，差异有显著性意义。有肺转移者高表达者为75%，而无转 移者为55.5%。DNA(Southern)印迹分析46例骨肉瘤，7例(15.2%)有 结构异变，此百分比较文献上报道偏低，可能是缺乏测定杂 合子的技术与设备有关，同时也与Southern印迹法不能测出点突 变有关。
王新生(1995)用Southern杂交分析24例骨肉瘤标本中4例有p53基 因重排，其中3例出现异常带型，1例有片段的杂合性缺失。在 20例骨巨细胞瘤中，发现1例的原发灶无异常而其复发病变有4. 0kb的纯合性缺失，并在8.0kb多出一条带。
p53基因的改变包括丢失、基因重排、点突变所致失活联合 作用。MDM2基因与p53基因结合，阻止了p53的功能，如MDM2过量， 导致p53完全失活，细胞转化产生肿瘤。
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Chen等(1996)发现MDM2抑制p53对细胞G1期(有学者提出S期) 生长停滞和引起细胞凋亡的功能。
3.Rb基因，是第一个分离克隆出来的抑癌基因(Lee,1987)， 定位于染色体13q14，能产生一种多肽(p105-RB)，是一种磷酸 化的抗癌蛋白(AOP)。抑癌基因通过其AOP与相关的基因DNA结合 起作用，而封闭癌基因，抑制刺激细胞生长的因素。
野生型Rb基因产生的蛋白质，在正常细胞中有抑制细胞过 度增殖的效应，是抑制信号传导通路的组成部分。实验结果证 明Rb基因及其产物的生物学功能丢失后，细胞脱离正常生长抑 制，生长因子产生异常或不适当的激活细胞生长，使肿瘤发 生(Xu等,1994;Qin等,1995)。
Dryja(1986)最先报告Rb基因的突变与骨肉瘤发生的关系，他在 4例骨肉瘤细胞DNA的限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)分析中发现3例出现13号染色体长臂基因的 结合化，使该染色体上的隐性等位基因的表型得到表达。Togu chida(1988)用Rb基因cDNA探针对30例骨肉瘤细胞DNA进行Southern印迹分 析，发现13例(43%)有Rb基因异常，其中7例杂合性缺失，6例 为半合性缺失或重排。RFLP分析表明甚至在Southern杂合无明显R b基因结构异常的骨肉瘤，也有13号染色体特定位点的杂合性缺 失。
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Araki(1991)报告23例骨肉瘤，Southern杂交中8例(35%)Rb基因 结构异常，其中3例为纯合性缺失，5例为杂合性缺失。8例缺失 中7例发生在HindⅢ酶切所得的7.5kb片段上。5例进行Northern杂 交，4例未见Rb基因表达。
Rb基因的改变主要是缺失和微小改变。Feugeas等(1996)发现 Rb基因的杂合性(heterozygosity)缺失，提示骨肉瘤患者预后不 良，同时这可能是骨肉瘤发生的关键因素。
Rb基因的失活在骨肉瘤的发生中起重要作用，将正常人Rb基 因导入有Rb基因缺失的骨肉瘤细胞，可有效地限制其生长。
五、骨与软组织恶性肿瘤的分子生物学异常及其诊断方法 (表3)
表3 骨与软组织肉瘤中主要的特异性染色体易位及受累基因
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肿瘤类型
染色体易位
基因
Ewing肉瘤/原发性神经外胚瘤
t(11;22)(q24;q12)
FLII.EWS
t(21;22)(q22;q12)
ERC,EWS
t(7;22)(p22;q12)
ETV1,EWS
透明细胞性肉瘤
, 百拇医药 t(12;22)(q13;q12)
FTF1,EWS
结缔组织性小圆细胞肉瘤
t(11;22)(p13;q12)
WT1,EWS
粘液性脂肪肉瘤
t(12;16)(q13;p11)
CHOP,TLS
腺泡状横纹肌肉瘤
t(2;13)(q35;q14)
PAX3,FKHR
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t(1;13)(p36;q14)
PAX7,FKHR
滑膜肉瘤
t(X;18)(p11;q11)
SSX;SYT
骨外粘液性软骨肉瘤
t(9;22)(q22;q12)
CHN
(一)骨肉瘤
高度恶性的经典骨肉瘤存在明显的多倍体改变及多发染色 体异常。至今已发现几个重要的基因改变与成骨肉瘤的发生有 关。Rb基因异常是成骨肉瘤发生的第一个线索。Rb基因的改变 是视神经母细胞瘤发生的原因，成骨肉瘤经常继发于视网膜母细胞瘤患者。Rb基因的改变在原发性成骨肉瘤 中也很多见。约有60%～75%的成骨肉瘤存在Rb基因的异常。丢 失一个Rb等位基因的骨肉瘤比带有正常Rb基因的骨肉瘤更具恶 性。在具有p53基因突变的Li-Fraumeni综合征的家族中，骨肉瘤 的发生率明显增高。该现象提示p53基因改变是骨肉瘤发生的另 一重要因素。p53基因的突变约发生于45%的成骨肉瘤中。其它 基因的改变，进一步促成了成骨肉瘤的发生，如c-myc及c-fo s基因的扩增及高表达。MDM2是一个p53基因的调节蛋白。MDM2基因 的扩增可抑制p53基因的活性，使细胞丧失p53基因调节的生长 控制，从而导致肿瘤的发生。已发现MDM2基因的扩增存在于部 分不同类型的肉瘤中，包括成骨肉瘤、纤维肉瘤、脂肪肉瘤等 。
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(二)软骨肉瘤
软骨肉瘤是原发恶性骨肿瘤中仅次于成骨肉瘤的第二好发 肿瘤。基于肿瘤细胞分化的不同，组织学上可分为三级。Ⅰ 级为低度恶性,Ⅲ级为高度恶性，Ⅱ级居两者之间。近来的研 究发现EXT1和EXT2基因的异常与家族遗传性骨软骨瘤有关，因而 认为EXT1和EXT2在继发性软骨肉瘤中起重要作用。许多基因的改 变被证实与其临床生物学行为有关。如同在成骨肉瘤一样，p5 3、Rb及MDM2基因的改变也被发现存在于部分软骨肉瘤中，且与 临床的恶性行为相关。
(三)Ewing肉瘤
Ewing肉瘤是在青少年中仅次于成骨肉瘤的第二好发的原发 性恶性骨肿瘤。Ewing肉瘤是骨的未分化小圆细胞肉瘤。原始神 经外胚瘤(PNET)是原发于软组织中的小圆细胞肉瘤，与Ewing肉 瘤不同的是，PNET具有神经外胚层分化的特点。Ewing肉瘤和原 始神经外胚瘤都具有11号和22号染色体的相互易位t(11;22)或21号 和22号染色体的相互易位t(21;22)。这些染色体的相互易位导致 了EWS基因与FLI1基因或ERG基因的重排。EWS基因位于22号染色体22 q12，其产物是一个RNA结合蛋白。FLI1基因是位于11号染色体上的 一个癌基因，其产物是一个恶性转化因子。Ewing肉瘤中EWS基因 与FLI1基因重排后形成了一个融合基因，其产物比单纯FLI1基因 的产物具有更强大的转化活性。该转化因子被认为是形成Ewin g肉瘤的关键。FLI1基因与EWS/FLI1融合基因的产物被证明可与c- myc癌基因的启动子结合，从而激活c-myc基因，增加c-myc癌基 因的表达。
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Ewing肉瘤中第二种常见的染色体易位是21号与22号t(21;22),因 而导致了EWS与ERG基因的重排。ERG基因与FIL1基因相似，其产物 也是一个转化因子。EWS基因、ERG基因重排后，增强了后者的转 化活性，导致了Ewing肉瘤的发生。
在染色体水平上，约86%的Ewing肉瘤可被检测到有11号和22 号染色体的相互易位。应用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)的 方法，90%左右的Ewing肉瘤可被检测到有EWS/FLI1的融合基因的转 录(RNA)，另外约有5%～10%的Ewing肉瘤有EWS/ERG的融合基因 的转录。因而应用RT-PCR的检测方法，95%以上的Ewing肉瘤或PN ET可得到准确诊断。由于EWS和FLI1基因的断裂点位置的差别， 由此形成EWS/FLI1融合基因的亚型(亚型I～Ⅶ)。最近的研究证 实，不同融合基因亚型的Ewing肉瘤具有不同的预后，因而EWS/F LI1融合基因的检测不但具有诊断意义，而且具有评价预后的意 义。
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(四)横纹肌肉瘤
通过比较胚胎样横纹肌肉瘤的DNA与正常体细胞的DNA发现， 该肿瘤细胞具有染色体11p15.5的异常。基因图分析显示，该部 位存在胰岛素样生长因子(IGF-2)基因。进一步的研究发现, 无论是在胚胎样横纹肌肉瘤，还是腺泡样横纹肌肉瘤中都有IG F-2mRNA的高表达，而且这种高表达只存在于肿瘤细胞内，肿 瘤细胞周围的基质细胞中没有IGF-2的表达。因而认为IGF-2基 因的异常，可能与横纹肌肉瘤的发生有关。然而IGF-2是一个 癌基因，研究发现在11p15.5的区域存在有基因的丢失，所以在 该部位存在一个抗癌基因。h19是位于11p15.5部位的一个抗癌基 因。h19基因的突变或缺失或许是IGF-2高表达的原因。深入的 研究仍在进行中。
虽然胚胎样横纹肌肉瘤与人的胚胎骨骼肌相象，但是腺泡 样横纹肌肉瘤是一种高度恶性的小圆细胞肿瘤。腺泡样横纹肌 肉瘤经常发生转移，且有时可与Ewing肉瘤、原发性神经外胚瘤 及淋巴瘤等相混淆。细胞遗传学研究发现80%以上的腺泡样横 纹肌肉瘤细胞存在2号与13号染色体的相互易位t(2;13)。分子生 物学的研究显示由于染色体的易位导致了位于2号染色体上的P AX3基因与位于13号染色体上的FKHR基因发生重排。PAX3基因被认 为是早期神经、肌肉分化的重要转录调节因子。而FKHR基因的 产物是一个转化因子。PAX3基因与FKHR基因的融合基因产物被认 为是导致腺泡样横纹肌肉瘤发生的原因。
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(五)粘液性脂肪肉瘤
脂肪肉瘤是仅次于恶性纤维组织细胞瘤的第二好发的软组 织恶性肿瘤。粘液性脂肪肉瘤是脂肪肉瘤中最常见的亚型，约 占脂肪肉瘤的40%～50%。肿瘤由增殖活跃的脂肪细胞与粘液 基质组成。粘液性脂肪肉瘤具有12号与16号染色体相互易位t(12 ;16)的特征。CHOP基因是位于12号染色体12q13.1-q13.2部位的一个 基因。CHOP基因的正常激活与脂肪细胞的分化有密切关系，并 控制脂肪细胞的增殖。TLS基因位于16号染色体16p11。TLS基因产 物与EWS基因产物相似，是一个RNA结合蛋白。TLS基因与CHOP基因 重排所产生的融合蛋白不仅失去对脂肪细胞增殖的控制，且干 扰了CHOP基因的正常功能。因而认为TLS/CHOP基因的重排导致了 粘液样脂肪肉瘤的发生。
(六)滑膜肉瘤
典型的滑膜肉瘤好发于青年人，位于关节周围。肿瘤包含 有上皮性和/或梭形肿瘤细胞,因而肿瘤被分为双相或单相分化 两种类型。90%以上的滑膜肉瘤是有X和18号染色体的相互易位 t(X;18)，由此产生的X染色体上的SSX与18号染色体上的SYT基因 的重排。RT-PCR方法可检测到95%以上的滑膜肉瘤有SSX/SYT融合 基因的转录(mRNA)。单相或双相分化的两种滑膜肉瘤都可检 测到有SSX/SYT融合基因的表达。普遍认为SSX/SYT基因的重排是滑 膜肉瘤发生的遗传学基础。与Ewing肉瘤一样，由于SSX和SYT基因断裂点的不同可产生不同的SSX/S YT融合基因的亚型。最新的研究提示不同的SSX和SYT亚型可能具 有提示预后的意义。
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(七)骨与软组织肿瘤分子诊断方法
恶性骨与软组织肿瘤的诊断经常遇到困难，检测肿瘤特异 的染色体易位为某些困难的病例提供了有益的鉴别诊断方法。 同时，在有些肿瘤这种染色体易位还具有提示预后的意义。 例如小圆细胞肉瘤中可包括Ewing肉瘤、原发神经外胚瘤、网状 细胞肉瘤、小圆细胞型骨肉瘤、淋巴瘤、腺泡状横纹肌肉瘤等 ，因而存在诊断上的困难。然而，通过细胞或分子遗传学的 方法，可检测肿瘤是否存有特异的染色体易位或特异的融合基 因(如Ewing肉瘤和原发神经外胚瘤的EWS/FLI、EWS/ERG融合基因， 腺泡状横纹肌肉瘤的PAX3/FKHR)。常见的分子诊断方法:
1.反转录PCR(RT-PCR):RT-PCR是检查融合基因转录的主要方 法。该方法是通过在两个基因融合点的前后，各设计一个引 物(primer)，该引物的DNA序列与两个融合基因处于融合点附近的 cDNA序列互补。通过PCR方法可扩增该融合部位的cDNA(mRNA序列)。 因而可确定这种细胞是否存在这种融合基因。另外，通过定量 RT-PCR方法，还可以检测出这种融合基因表达水平的高低。对 研究融合基因表达水平与肿瘤分化程度的关系有重要意义。 通过RT-PCR方法检测融合基因是骨与软组织肿瘤分子病理诊断 的最常用手段。
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2.染色体原位杂交(FISH):这种方法主要是应用不同的染色 体特异性DNA片断(探针)来检查染色体的易位、基因重排。该方 法的优点是无需制备细胞分裂中期染色体，细胞处于分裂间 期也可检查。最近的研究显示，即使是石蜡包埋的肿瘤组织， 也能成功地检测出特异性的基因重排。
3.DNA分子杂交(southern blot):该方法是通过提取肿瘤细胞的DNA ，用特异性的DNA基因片断(探针)与肿瘤细胞的DNA进行杂交， 来检测相关基因是否完整，是否有基因的丢失、重排或扩增 。如在Ewing肉瘤中，95%以上的肿瘤可检测到EWS基因的重排。
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(收稿日期:1999-08-01), 百拇医药