基因序列分析在麻风分支杆菌分型中的应用
作者：尹跃平 吴勤学 张良芬 余艳华
单位：南京，中国医学科学院 中国协和医科大学皮肤病研究所 210042
关键词：分支杆菌；麻风基因组；细菌基因型
中华皮肤科杂志00zk19
【摘要】目的通过基因序列分析，探讨麻风分支杆菌rpoT基因的多态性以及在麻风分支 杆菌基因分型中的应用。方法对麻风分支杆菌对照菌株以及中国7个地区的分离菌株进行DNA 提取、PCR法扩增rpoT部分基因片段，用自动测序法对该提纯片段进行测序。结果①PCR扩增 结果：13份麻风分支杆菌临床蜡块标本中,有12份标本扩增出rpoT-91/97bpDNA片段，2份扩 增出rpoT-194/200bpDNA片段；②测序结果表明：中国麻风分支杆菌临床分离株rpoT基因含 有3拷贝及4拷贝的GACATC重复序列。结论基因测序分析法可以直观、准确地对麻风杆菌进行 基因分型，是开展麻风流行病学及致病机理等研究的一个非常有效的手段。但测序分析需要 一定长度的DNA片段，在难以通过PCR扩增出较长DNA片段的蜡块标本中的应用受到一定的限 制，所以其方法有待进一步完善。
, http://www.100md.com
Application of Genome Sequencing Analysis for Genotyping of Clinically Isolated Strains of Mycobacterium Leprae
YIN Yueping WU Qinxue ZHANG Liangfen et al
( Institute of Dermatology, Chinese Academy of Medical Sciences ＆ Peking Union Medical College, Nanjing 210042)
【 Abstract】 Objective To genotype the clinically isolated strains of M.leprae by genome sequencing analysis. Methods PCR amplification was used to produce the 200 bp partial rpoT gene fragments from 2 standard strains and the isolated strains of M. leprae isolated from clinical specimens in 7 areas of China. The fragments were sequenced by BigDye Terminator Cycle Sequencing Reaction kit. Results ① 12 rpoT- 91/97bp DNA fragments and 2 rpoT- 194/200 bp DNA fragments were obtained from 13 clinically isolated strains of M. leprae by PCR amplification; ② based upon genome sequencing analysis, a component of 3- copy or 4- copy “ GACATC” repeat sequence was found in the nucleotide sequence of rpoT- 194/200 bp DNA fragment. Conclusion The genome sequencing analysis can be used to objectively and accurately genotype M.leprae, and it is a useful tool for epideiological study on transmission and infection of leprosy. However, the longer DNA fragments are necessary when sequencing analysis is conducted. Therefore this method needsfurther improvement because only the shorter DNA fragments amplified from paraffin- embedded tissue.
, 百拇医药
【 Key words】 Mycobacterium leprae Genome,bacterial Genotype
麻风分支杆菌(Mycobacterium leprae，ML)是引起麻风的病原菌，目前尚未解决其体外培养问题，因而影响了对该病原菌的进一步探讨以及在临床诊断、流行病学研究中的应用。有关ML菌株的筛选研究表明[1]，在鼠足垫中增菌速度不同的临床分离菌株之间，其RNA多聚酶基因(rpoT)间存在差异，即分别表现为由3拷贝和4拷贝的GACATC重复序列构成，并据此建立了应用PCR技术扩增rpoT基因片段的方法，可用于麻风杆菌基因分型等方面的研究[2]。随着分子生物学技术的进一步发展与完善，基因序列分析已成为研究、分析微生物病原体的重要方法，并已成为病原微生物分类手段之一[3]。为进一步探讨基因序列分析在ML菌种分型中的应用，我们通过对其rpoT基因序列进行分析，对中国不同地区麻风临床分离株进行基因分型，现将初步结果报告如下。
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材料和方法
一、麻风杆菌DNA的制备
本研究所用ML对照DNA取自Thai53与Kyoto2对照菌株，分别作为扩增rpoT基因“GACATC”重复序列的3拷贝和4拷贝的靶DNA，临床分离株分别取自贵州、福建、山东、广东、浙江、大连以及黑龙江等7个地区的13个蜡块标本，其DNA制备方法同参考文献[2]。
二、载体与菌株
质粒pGEM-T作为目的DNA片段大量提纯及测序用载体，其感受态细胞大肠杆菌HB101作为质粒转化的宿主菌，均为日本国立感染疾病研究所麻风控制中心冻存备用。
三、主要试剂
蜡块组织DNA提取试剂盒DEXPAT以及琼脂糖凝胶分离DNA回收试剂盒EASYTRAPTM Ver.2均购自日本宝酒造公司；PCR扩增用试剂盒Ampli Taq GoldTM为美国Roche公司产品。
, 百拇医药
四、PCR法扩增DNA片段
根据rpoT基因DNA序列设计2对引物，分别可扩增含GACATC重复序列的91/97bp和194/200bpDNA片段，模板DNA为Thai53和Kyoto2对照菌株DNA以及从7个地区的13个蜡块标本中提取的DNA。扩增反应在ASTECPC-800热循环仪上进行。反应条件为：变性：94℃75s，退火：60℃90s，聚合：72℃90s，共45个循环。反应产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，用DNA回收试剂盒从琼脂糖凝胶回收、提纯PCR扩增的测序用DNA片段。
五、DNA测序
将PCR扩增的200bprpoT基因DNA片段连结到测序用载体质粒pGEM-T上，使其成为重组质粒DNApGEM-T-rpoT，将此pGEM-T-rpoT转化宿主菌感受态细胞大肠杆菌HB101后，分别选取转化宿主菌菌落接种到5mLLB培养液中，37℃振荡培养过夜，用质粒DNA提取试剂盒提纯pGEM-T-rpoTDNA后在按双脱氧DNA测序试剂盒(BigDye Terminator Cycle Sequencing Rraction kit美国)方法，在自动DNA测序5上对制备的5个pGEM-T-rpoTDNA进行测序[4]。
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结果
一、PCR扩增产物
两种引物扩增的结果见表1，用两种引物进行PCR扩增的13份蜡块标本中,有12分标本扩增出rpoT-91/97bpDNA片段，有2份标本扩增出rpoT-194/200bpDNA片段。对照菌株Thai-53及Kyoto2的两种PCR扩增产物均为阳性。
表1 两对引物PCR扩增结果 标本
rpoT基因
标本
rpoT基因
91/97bp
194/200bp
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91/97bp
194/200bp
贵州1
+
+
浙江1
+
+
福建1
+
-
浙江2
+
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福建2
+
-
大连1
+
-
山东1
-
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大连2
+
-
山东2
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+
-
黑龙江1
+
-
广东1
+
-
黑龙江2
+
-
广东2
+
-
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Thai-53
+
+
Kyoto2
+
+
二、rpoTDNA序列
通过对ML对照菌株及临床分离菌株的PCR扩增产物rpoT-194/200 bp DNA片段进行基因测序，其结果见表2，对照菌株Thai53与临床菌株贵州的rpoT基因含有3拷贝的GACATC重复序列，Kyaoto2与临床菌株浙江的rpoT基因则含有4拷贝的GACATC重复序列。表2 ML对照菌株及临床分离菌株的rpoT基因测序结果 菌侏
DNA序列
, 百拇医药
......*
Thai-53
GCCGAACCGGACCTCGACGTTGAGCCCAGCGACG
Kyoto2
GCCGAACCGGACCTCGACGTTGAGCCCAGCGACG
贵州1
GCCGAACCGGACCTCGACGTTGAGCCCAGCGACG
浙江1
GCCGAACCGGACCTCGACGTTGAGCCCAGCGACG
Thai-53
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ACATCGCATCGAAGCCGCCGACCTCGGTCTCGA
Kyoto2
ACATCGCATCGAAGCCGCCGACCTCGGTCTCGA
贵州1
ACATCGCATCGAAGCCGCCGACCTCGGTCTCGA
浙江1
ACATCGCATCGAAGCCGCCGACCTCGGTCTCGA
......
* 相同的DNA序列未列出
讨论
, 百拇医药
基因序列分析作为一种分子生物学技术已广泛应用[5,6]于ML研究的诸领域，如皮试试剂的研制、疫苗的筛选、体外培养等方面亦有探讨[4,7,8]。本研究主要探讨了基因序列分析在ML菌种分型中的应用，结果表明：在中国的ML临床分离菌株的rpoT基因中也分别含有3拷贝及4拷贝的“GACATC”重复序列(表2)，根据此序列的测定可以将ML菌株初步分为2型，其结果与PCR法分型结果一致[2]。因基因测序所用仪器已基本采用全自动法，结果比较准确易读，如果操作熟练，不会出现其它方法可能出现的假阳性/假阴性结果，以及结果难以判定的现象。所以只要有可用于进行基因分型的DNA片段，采用基因测序法将是ML菌株分型的最可靠方法。
随着联合化疗应用于麻风治疗，使得麻风的患病率显著降低。但为了彻底消灭麻风，仍有许多有待解决的难题，比如麻风复发、耐药、麻风菌的致病力以及传播途径等。通过基因测序分析进行ML基因分型为解决这些难题提供了一个新的有效的手段。但进行基因测序的DNA需一定的长度，而本研究中所用ML蜡块标本，因甲醛固定使得DNA片段的完整性收到破坏，所以用PCR法扩增结果，较短片段rpoT-91/97bpDNA扩增结果阳性率为92.3%(12/13)，较长片段rpoT-194/200bpDNA扩增结果阳性率仅为15.3%(2/13)(表2)。因此基因序列分析法的应用范围受到了一定的限制，这将通过对基因测序技术以及条件的改进，使其能够对更短的DNA片段进行序列分析，使基因测序分析技术在ML以及其它病原微生物的分型等领域中得到更广泛的应用。
, 百拇医药
参考文献
1，松岗正典，前田伸司，甲斐雅规，他.麻风菌rpoT基因多态性及其地理分布.日本71回麻 风学会论文集.1998，51.
2，吴勤学，尹跃平，张良芬，等.石蜡包埋组织中麻风菌基因扩增试验初探.中华皮肤科杂 志，2000,33(增刊)：63-64.
3，Young D. Genome Sequencing and its potential applications. Int J Lepr Other Mycobact Dis， 1996， 64(4,Suppl):68s.
4，尹跃平.らぃの菌の(抗原クロ-ニングと大肠菌中での大量发现.日本感染学杂志，199 4,68:1330-1337.
5，Gedaily AEL, Paesold G, Chen CY, et al. Plasmid virulence gene expression induced by short- chain fatty acids in salmonella dublin:identification of rpoS- dependendent and rpo- s- independent mechanisms. J Bacteriol, 1997,179:1409- 1412.
, 百拇医药
6，Head SR, Parikh K, Rogers YH, et al. Solid- phase sequence scanning for drug resistance detection in tuberculosis. Mol Cell Probes,1999,13(2):81- 87.
7，Katoch VM. Molecular techniques for leprosy: present apllications and future perspectives. Indian J Lepr, 1999,71:45-59.
8，Kai M, Matsuoka M, Nakata N, et al. Diaminodiphenylsulfone resistance of Mycobacterium leprae due to mutation in the dihydropteroate synthase gene. FEMS Microbiol. Letters, 1999, 177:231- 235.
(收稿日期：1999-12-10), 百拇医药
单位：南京，中国医学科学院 中国协和医科大学皮肤病研究所 210042
关键词：分支杆菌；麻风基因组；细菌基因型
中华皮肤科杂志00zk19
【摘要】目的通过基因序列分析，探讨麻风分支杆菌rpoT基因的多态性以及在麻风分支 杆菌基因分型中的应用。方法对麻风分支杆菌对照菌株以及中国7个地区的分离菌株进行DNA 提取、PCR法扩增rpoT部分基因片段，用自动测序法对该提纯片段进行测序。结果①PCR扩增 结果：13份麻风分支杆菌临床蜡块标本中,有12份标本扩增出rpoT-91/97bpDNA片段，2份扩 增出rpoT-194/200bpDNA片段；②测序结果表明：中国麻风分支杆菌临床分离株rpoT基因含 有3拷贝及4拷贝的GACATC重复序列。结论基因测序分析法可以直观、准确地对麻风杆菌进行 基因分型，是开展麻风流行病学及致病机理等研究的一个非常有效的手段。但测序分析需要 一定长度的DNA片段，在难以通过PCR扩增出较长DNA片段的蜡块标本中的应用受到一定的限 制，所以其方法有待进一步完善。
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Application of Genome Sequencing Analysis for Genotyping of Clinically Isolated Strains of Mycobacterium Leprae
YIN Yueping WU Qinxue ZHANG Liangfen et al
( Institute of Dermatology, Chinese Academy of Medical Sciences ＆ Peking Union Medical College, Nanjing 210042)
【 Abstract】 Objective To genotype the clinically isolated strains of M.leprae by genome sequencing analysis. Methods PCR amplification was used to produce the 200 bp partial rpoT gene fragments from 2 standard strains and the isolated strains of M. leprae isolated from clinical specimens in 7 areas of China. The fragments were sequenced by BigDye Terminator Cycle Sequencing Reaction kit. Results ① 12 rpoT- 91/97bp DNA fragments and 2 rpoT- 194/200 bp DNA fragments were obtained from 13 clinically isolated strains of M. leprae by PCR amplification; ② based upon genome sequencing analysis, a component of 3- copy or 4- copy “ GACATC” repeat sequence was found in the nucleotide sequence of rpoT- 194/200 bp DNA fragment. Conclusion The genome sequencing analysis can be used to objectively and accurately genotype M.leprae, and it is a useful tool for epideiological study on transmission and infection of leprosy. However, the longer DNA fragments are necessary when sequencing analysis is conducted. Therefore this method needsfurther improvement because only the shorter DNA fragments amplified from paraffin- embedded tissue.
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【 Key words】 Mycobacterium leprae Genome,bacterial Genotype
麻风分支杆菌(Mycobacterium leprae，ML)是引起麻风的病原菌，目前尚未解决其体外培养问题，因而影响了对该病原菌的进一步探讨以及在临床诊断、流行病学研究中的应用。有关ML菌株的筛选研究表明[1]，在鼠足垫中增菌速度不同的临床分离菌株之间，其RNA多聚酶基因(rpoT)间存在差异，即分别表现为由3拷贝和4拷贝的GACATC重复序列构成，并据此建立了应用PCR技术扩增rpoT基因片段的方法，可用于麻风杆菌基因分型等方面的研究[2]。随着分子生物学技术的进一步发展与完善，基因序列分析已成为研究、分析微生物病原体的重要方法，并已成为病原微生物分类手段之一[3]。为进一步探讨基因序列分析在ML菌种分型中的应用，我们通过对其rpoT基因序列进行分析，对中国不同地区麻风临床分离株进行基因分型，现将初步结果报告如下。
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材料和方法
一、麻风杆菌DNA的制备
本研究所用ML对照DNA取自Thai53与Kyoto2对照菌株，分别作为扩增rpoT基因“GACATC”重复序列的3拷贝和4拷贝的靶DNA，临床分离株分别取自贵州、福建、山东、广东、浙江、大连以及黑龙江等7个地区的13个蜡块标本，其DNA制备方法同参考文献[2]。
二、载体与菌株
质粒pGEM-T作为目的DNA片段大量提纯及测序用载体，其感受态细胞大肠杆菌HB101作为质粒转化的宿主菌，均为日本国立感染疾病研究所麻风控制中心冻存备用。
三、主要试剂
蜡块组织DNA提取试剂盒DEXPAT以及琼脂糖凝胶分离DNA回收试剂盒EASYTRAPTM Ver.2均购自日本宝酒造公司；PCR扩增用试剂盒Ampli Taq GoldTM为美国Roche公司产品。
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四、PCR法扩增DNA片段
根据rpoT基因DNA序列设计2对引物，分别可扩增含GACATC重复序列的91/97bp和194/200bpDNA片段，模板DNA为Thai53和Kyoto2对照菌株DNA以及从7个地区的13个蜡块标本中提取的DNA。扩增反应在ASTECPC-800热循环仪上进行。反应条件为：变性：94℃75s，退火：60℃90s，聚合：72℃90s，共45个循环。反应产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，用DNA回收试剂盒从琼脂糖凝胶回收、提纯PCR扩增的测序用DNA片段。
五、DNA测序
将PCR扩增的200bprpoT基因DNA片段连结到测序用载体质粒pGEM-T上，使其成为重组质粒DNApGEM-T-rpoT，将此pGEM-T-rpoT转化宿主菌感受态细胞大肠杆菌HB101后，分别选取转化宿主菌菌落接种到5mLLB培养液中，37℃振荡培养过夜，用质粒DNA提取试剂盒提纯pGEM-T-rpoTDNA后在按双脱氧DNA测序试剂盒(BigDye Terminator Cycle Sequencing Rraction kit美国)方法，在自动DNA测序5上对制备的5个pGEM-T-rpoTDNA进行测序[4]。
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结果
一、PCR扩增产物
两种引物扩增的结果见表1，用两种引物进行PCR扩增的13份蜡块标本中,有12分标本扩增出rpoT-91/97bpDNA片段，有2份标本扩增出rpoT-194/200bpDNA片段。对照菌株Thai-53及Kyoto2的两种PCR扩增产物均为阳性。
表1 两对引物PCR扩增结果 标本
rpoT基因
标本
rpoT基因
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二、rpoTDNA序列
通过对ML对照菌株及临床分离菌株的PCR扩增产物rpoT-194/200 bp DNA片段进行基因测序，其结果见表2，对照菌株Thai53与临床菌株贵州的rpoT基因含有3拷贝的GACATC重复序列，Kyaoto2与临床菌株浙江的rpoT基因则含有4拷贝的GACATC重复序列。表2 ML对照菌株及临床分离菌株的rpoT基因测序结果 菌侏
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随着联合化疗应用于麻风治疗，使得麻风的患病率显著降低。但为了彻底消灭麻风，仍有许多有待解决的难题，比如麻风复发、耐药、麻风菌的致病力以及传播途径等。通过基因测序分析进行ML基因分型为解决这些难题提供了一个新的有效的手段。但进行基因测序的DNA需一定的长度，而本研究中所用ML蜡块标本，因甲醛固定使得DNA片段的完整性收到破坏，所以用PCR法扩增结果，较短片段rpoT-91/97bpDNA扩增结果阳性率为92.3%(12/13)，较长片段rpoT-194/200bpDNA扩增结果阳性率仅为15.3%(2/13)(表2)。因此基因序列分析法的应用范围受到了一定的限制，这将通过对基因测序技术以及条件的改进，使其能够对更短的DNA片段进行序列分析，使基因测序分析技术在ML以及其它病原微生物的分型等领域中得到更广泛的应用。
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参考文献
1，松岗正典，前田伸司，甲斐雅规，他.麻风菌rpoT基因多态性及其地理分布.日本71回麻 风学会论文集.1998，51.
2，吴勤学，尹跃平，张良芬，等.石蜡包埋组织中麻风菌基因扩增试验初探.中华皮肤科杂 志，2000,33(增刊)：63-64.
3，Young D. Genome Sequencing and its potential applications. Int J Lepr Other Mycobact Dis， 1996， 64(4,Suppl):68s.
4，尹跃平.らぃの菌の(抗原クロ-ニングと大肠菌中での大量发现.日本感染学杂志，199 4,68:1330-1337.
5，Gedaily AEL, Paesold G, Chen CY, et al. Plasmid virulence gene expression induced by short- chain fatty acids in salmonella dublin:identification of rpoS- dependendent and rpo- s- independent mechanisms. J Bacteriol, 1997,179:1409- 1412.
, 百拇医药
6，Head SR, Parikh K, Rogers YH, et al. Solid- phase sequence scanning for drug resistance detection in tuberculosis. Mol Cell Probes,1999,13(2):81- 87.
7，Katoch VM. Molecular techniques for leprosy: present apllications and future perspectives. Indian J Lepr, 1999,71:45-59.
8，Kai M, Matsuoka M, Nakata N, et al. Diaminodiphenylsulfone resistance of Mycobacterium leprae due to mutation in the dihydropteroate synthase gene. FEMS Microbiol. Letters, 1999, 177:231- 235.
(收稿日期：1999-12-10), 百拇医药