胃癌导向药物免疫活性监控的探讨
第四军医大学西京医院消化科 陕西省西安市 710032
蔡学君，女，湖北省武汉市人，1964年5月生，1986年获第四军医大学学士学位，1991年获硕士学位，现正在本校消化内科攻读博士学位.
项目负责人：蔡学君
收稿日期 1992-11-24
摘 要本文从检测抗体活性方面探讨导向药物的质控方法，利用氯胺T法标记MGb2和MGb2-PAD-DNR*,根据Lindmo线性外推法分别测定其免疫活性分数为60.5%和46.34%，两者比较P>0.05，说明两种抗体活性无显著差别. 交联对抗体的损伤不大. 它们与靶细胞的结合释放试验表明，交联后抗体仍保留原有的结合特征. 结论：Lindmo线性外推法可准确评估导向药物的差异，适合作导向药物的质控方法，可用于判断交联方法的可行性及探讨交联物与肿瘤作用方式的研究.
, 百拇医药
主题词 抗体，单克隆；胃肿瘤/治疗；免疫活性
Subject headings antibodies, monoclonal; stomach neoplasms/therapy; immunocompetence
蔡学君,陈希陶,胡家露,张学庸,樊代明.胃癌导向药物免疫活性监控的探讨.新消化病学杂志,1993;1(2):71-73
0 引言
单抗与杀伤肿瘤细胞的活性物质连接，可以把杀伤药物选择性地运送到肿瘤部位，增强抗肿瘤效果，减少全身用药所造成的毒副作用[1]. 迄今已在临床实验中显示出令人鼓舞的结果，但在临床应用中仍存在一些问题，其中之一免疫交联物的质量控制[2]，即如何交联使单抗携带足够的“弹头”药物，保留良好的结合活性，并比较各次实验中导向药物的差异. 本文采用抗原抗体结合的线性外推法定量检测抗体的免疫活性的损伤程度及对抗体与靶细胞结合特征的影响.
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1 材料和方法
1.1 单克隆抗体的纯化及鉴定 鼠抗人胃癌单抗MGb2由本室制备，含MGb2单抗的BALB/C小鼠腹水经50%硫酸铵盐析，用DEAE-52离子交换层析得到IgG1亚型，SDS-PAGE电泳，激光光密度计扫描检测抗体纯度.
1.2 MGb2-PAD-DNR交联制备 按汪森明[7]方法制备，计算各成分克分子比值.
1.3 单抗的125I标记 取50μg纯化MGb2置反应瓶，加0.5mciNa125Ⅰ混匀，加氯胺T20μg并使之混匀，室温下反应40s，偏重亚硫酸钠终止，sephadexG-25柱层析收集首峰，同样方法标记MGb2-PAD-DNR.
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1.4 抗体的免疫活性测定 取20支试管分为结合组(B)和非特异结合组(NB)，每组分5点，每点设复管. 各管加3%FCS 37℃下封闭1h倒净，分别加100μL Hank′s 1%BSA悬浮细胞，B管加Hank′s-1%BSA液90μL,NB管加80μL同液及10μL10倍过量非标抗体，混匀置4℃下30min. 各管分别加10000cpm的碘标抗体10μL，37℃下孵育30min，冰Hank′s液终止反应，2000rpm离心5min，沉淀用Hank′s液洗涤两次，离心后测定细胞上放射性，Lindmo“双倒数”作图法计算抗体免疫活性分数.
1.5 结合试验 同上分组和加入人胃癌细胞SGC-7901，NB管加10倍过量非标抗体后混匀置4℃ 30min以封闭特异结合位点，然后各管分别加入20000cpm的标记抗体，置4℃或37℃下孵育，在0，30，60，90，120和150min加冰Hank′s液终止，离心洗涤后测定细胞摄取的放射性.各加1mL 0.05M pH2.8甘氨酸盐酸缓冲液，室温下20min，离心后用Hank′s液洗涤三次，测定细胞内的放射性.
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1.6 释放试验 同前分组及封闭特异性结合位点，各管加20000cpM的标记抗体，置4℃或37℃下孵育，2h后离心，沉淀用细胞培养液洗涤两次后再用0.4mL培养液悬浮，4℃或37℃下继续孵育，分别在0，6，24，72h终止反应，同前述测定细胞摄取放射性及细胞内存留的放射性.
2 结果
2.1 抗体的纯度鉴定 MGb2抗体纯化后经SDS-PAGE鉴定，电泳显示两条染色带，分子量约为2.3万和5.7万，激光光密度计扫描见两组成分占94.7%和5.3%，可见纯化后抗体已达到电泳纯.
2.2 MGb2-PAD-DNR制备结果 纯化后MGb2-PAD-DNR，测定各成分克分子比为MGb2∶PAD∶DNR=1∶2∶44.
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2.3 抗体的免疫活性分数测定结果 胃癌细胞系SGC-7901悬浮液2×107/mL，倍比稀释4次，呈5个细胞浓度，加入10000cpM标记抗体反应后，以细胞浓度的倒数为横座标，每管总放射性与特异性结合放射性之比为纵座标作图.当细胞浓度无限大时，纵座标截距的倒数为抗体的免疫活性分数，见图1所示.结果显示MGb2标记125I后60.5%的抗体具有免疫活性，而MGb2-PAD-DNR中46.34%的抗体保留免疫活性，其中部分抗体(14.16%)是由于MGb2交联PAD-DNR造成，但这种降低无显著差异(P>0.05)说明交联对抗体的免疫活性损伤不大.
2.4 与靶细胞的结合方式 MGb2交联PAD-DNR前后与胃癌细胞系SGC-7901结合的方式没有明显改变，如图2所示. 从图中可以看出它们与靶细胞的结合随时间延长逐渐增多，在4℃时的结合高于37℃时，这种结合经pH 2.8等渗液处理消失，表明它们很少进入SGC-7901细胞.
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2.5 从靶细胞上释放的方式 MGb2-PAD-DNR与靶细胞SGC-7901结合后，从细胞上释放下来的特征与MGb2相似.如图3所示.MGb2和MGb2-PAD-DNR与靶细胞结合2h后，37℃时的结合较4℃时低，但释放较4℃时快，经72h释放后，存留在细胞上的抗体量较4℃时低.
图1 线性外推法“双倒数”作图测定抗体免疫活性.
图2 MGb2交联前后与靶细胞的结合. A.MGb2与靶细胞结合；B.MGb2—PAD—DNR与靶细胞结合. 0—04℃时的结合：x—x37℃时的结合. 0……04℃时内化抗体量；x……x37℃时内化抗体量.
图3 抗体从靶细胞上释放方式(图标同图2).
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3 讨论
柔红霉素具有广谱和强效的抗癌作用，在肿瘤化疗中居重要地位[4,6,7]，然而其选择性较低，对正常组织尤其是心脏产生严重毒性，治疗中常因患者不能耐受而中断. 用特异性较高的抗肿瘤单抗导向柔红霉素能明显提高其抗癌作用，减少毒副因素[5,8,9].本实验室已成功制备了以葡聚糖T40为中间体的MGb2-PAD-DNR交联物. 目前国内学者多采用间接免疫荧光法检测抗体活性[10,11]. 该法简便，可以直观地观察交联物和靶细胞的结合能力，但只能定性分析，而且敏感性较差. 细胞ELISA简单易行，但所检测到的无论是滴度还是含量都是相对值，在每次实验中变异很大，即使在同一次实验中，不同的抗体表现亦大不相同[2]. 单克隆抗体和药物联结后，交联物中抗体免疫活性的保留程度，是评价偶联方法可行性及新制备的交联物是否具有应用价值的一个重要指标. 因此准确而客观地检测免疫交联物中抗体免疫活性十分重要. Lindmo线性外推法很好地解决了这一难题[3]. 其基本原理是质量作用定律：[B]=ka[F][T-B]. 若具免疫活性的抗体为 则[B]=ka[F][[WTBZ] T-B].[T][B]=1+1Ka[F]，当[F]无限大时，[T]B]=1，以[T] [B]为纵坐标，1[F]为横坐标，纵轴截距的倒数即为抗体的免疫活性分数.这种评估方法是建立在抗原浓度无限过量假设上，并且与所用的抗原浓度，反应时间以及抗体与抗原浓度的比值无关，因而比较准确，客观. 同时也比较简便，快速. 可用于每次实验中导向药物的质量比较. 本文采用抗原抗体结合的线性外推法测定MGb2-PAD-DNR中有46.34%的MGb2具有免疫活性，由此看来，该方法确实能准确抗体的免疫活性，比较不同批号免疫交联物的抗体活性，控制实验中导向药物的差异，从而为临床应用提供稳定可靠的治疗用药. 此外，在相同条件下标记和测定游离抗体的免疫活性，并与交联物中抗体活性比较，可观察交联对抗体活性损伤的程度，因而可评价交联方法是否恰当[3]. 本实验通过葡聚糖T40氧化为多醛基葡聚糖PAD，利用其醛基和柔红霉素及单抗MGb2上的氨基以schiff′s键联接，减少或避免了柔红霉素与抗体进行多位点结合以及药物分子对抗体的空间位阻效应.MGb2在交联前后免疫活性下降14.16%(P>0.05)，而且仍保留原有的结合特征，表明这种交联方法及条件适合制备免疫交联物用于肿瘤导向治疗. 总之，测定抗体的免疫活性分数可准确而客观地评估单抗与化疗药物、毒素、放射性核素联结后的质量，评估交联方法的可行性. 同时结合着抗体与靶细胞的结合释放试验，更能全面地了解导向药物的结合特性，探讨其在体内可能的作用方式.
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4 参考文献1 Embleton MJ. Drugtargeting by monoclonal antibodies.Br J Cancer,1987;55(3):227
2 万文徽，董志伟. 单克隆抗体制品质量控制中的若干方法学问题. 单克隆抗体通讯，1991；7(3)：14
3 Lindmo T, Boven E, Cuttitta F,et al. Determination of the immunoreactive iraction of radiolabeled
monoclonal antibodies by linear extrapolation to binding at infinite antigen excess.
J Immunol Methods, 1984;72:14
, 百拇医药
4 Jones ES，et al. Management of the lympnomas in: current concepts in theuse of doxorubicin chemtherapy.
ed.by Jones ES. Milan:Formitia carlo Erba, P103-105,1982
5 Levry R, Hurwitz E, Maron R,et al. The specific cytotoxic of daunomycinconjugates to antitumor
antibodies. Cancer Res, 1975;35(5):1182
6 Warring MJ，et al. Drug which affect the structure and function DNA.
, 百拇医药
Nature (London),1986;219(5161):1320
7 Peterson C, Baurain R, Trouet A. The mechanism for cellular uptake;storge and release of daunorubicin.
Biochem Pharmacol,1980;29(12):1687
8 Hurwitz E，et al.Daunomycin-immunoglobulins conjugates uptake and activity in vitro.
Eur J Cancer,1978;14:1213
9 Aron R, Sela M,et al. In vitro and in vivo efficacy of conjugates of dannomycin with antitumor
antibodies.Immunol Rev, 1982;62:5
10 赵跃然，李辉. 大肠癌单克隆抗体阿霉素结合物的体内外抗肿瘤作用. 中华微生物和免疫学杂志，1986；8(6)：357
11 汪森明，陈希陶，张学庸. 胃癌单克隆抗体一阿霉素结合物的制备及其细胞毒试验.癌症，1990；9(3)：216, 百拇医药
蔡学君，女，湖北省武汉市人，1964年5月生，1986年获第四军医大学学士学位，1991年获硕士学位，现正在本校消化内科攻读博士学位.
项目负责人：蔡学君
收稿日期 1992-11-24
摘 要本文从检测抗体活性方面探讨导向药物的质控方法，利用氯胺T法标记MGb2和MGb2-PAD-DNR*,根据Lindmo线性外推法分别测定其免疫活性分数为60.5%和46.34%，两者比较P>0.05，说明两种抗体活性无显著差别. 交联对抗体的损伤不大. 它们与靶细胞的结合释放试验表明，交联后抗体仍保留原有的结合特征. 结论：Lindmo线性外推法可准确评估导向药物的差异，适合作导向药物的质控方法，可用于判断交联方法的可行性及探讨交联物与肿瘤作用方式的研究.
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主题词 抗体，单克隆；胃肿瘤/治疗；免疫活性
Subject headings antibodies, monoclonal; stomach neoplasms/therapy; immunocompetence
蔡学君,陈希陶,胡家露,张学庸,樊代明.胃癌导向药物免疫活性监控的探讨.新消化病学杂志,1993;1(2):71-73
0 引言
单抗与杀伤肿瘤细胞的活性物质连接，可以把杀伤药物选择性地运送到肿瘤部位，增强抗肿瘤效果，减少全身用药所造成的毒副作用[1]. 迄今已在临床实验中显示出令人鼓舞的结果，但在临床应用中仍存在一些问题，其中之一免疫交联物的质量控制[2]，即如何交联使单抗携带足够的“弹头”药物，保留良好的结合活性，并比较各次实验中导向药物的差异. 本文采用抗原抗体结合的线性外推法定量检测抗体的免疫活性的损伤程度及对抗体与靶细胞结合特征的影响.
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1 材料和方法
1.1 单克隆抗体的纯化及鉴定 鼠抗人胃癌单抗MGb2由本室制备，含MGb2单抗的BALB/C小鼠腹水经50%硫酸铵盐析，用DEAE-52离子交换层析得到IgG1亚型，SDS-PAGE电泳，激光光密度计扫描检测抗体纯度.
1.2 MGb2-PAD-DNR交联制备 按汪森明[7]方法制备，计算各成分克分子比值.
1.3 单抗的125I标记 取50μg纯化MGb2置反应瓶，加0.5mciNa125Ⅰ混匀，加氯胺T20μg并使之混匀，室温下反应40s，偏重亚硫酸钠终止，sephadexG-25柱层析收集首峰，同样方法标记MGb2-PAD-DNR.
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1.4 抗体的免疫活性测定 取20支试管分为结合组(B)和非特异结合组(NB)，每组分5点，每点设复管. 各管加3%FCS 37℃下封闭1h倒净，分别加100μL Hank′s 1%BSA悬浮细胞，B管加Hank′s-1%BSA液90μL,NB管加80μL同液及10μL10倍过量非标抗体，混匀置4℃下30min. 各管分别加10000cpm的碘标抗体10μL，37℃下孵育30min，冰Hank′s液终止反应，2000rpm离心5min，沉淀用Hank′s液洗涤两次，离心后测定细胞上放射性，Lindmo“双倒数”作图法计算抗体免疫活性分数.
1.5 结合试验 同上分组和加入人胃癌细胞SGC-7901，NB管加10倍过量非标抗体后混匀置4℃ 30min以封闭特异结合位点，然后各管分别加入20000cpm的标记抗体，置4℃或37℃下孵育，在0，30，60，90，120和150min加冰Hank′s液终止，离心洗涤后测定细胞摄取的放射性.各加1mL 0.05M pH2.8甘氨酸盐酸缓冲液，室温下20min，离心后用Hank′s液洗涤三次，测定细胞内的放射性.
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1.6 释放试验 同前分组及封闭特异性结合位点，各管加20000cpM的标记抗体，置4℃或37℃下孵育，2h后离心，沉淀用细胞培养液洗涤两次后再用0.4mL培养液悬浮，4℃或37℃下继续孵育，分别在0，6，24，72h终止反应，同前述测定细胞摄取放射性及细胞内存留的放射性.
2 结果
2.1 抗体的纯度鉴定 MGb2抗体纯化后经SDS-PAGE鉴定，电泳显示两条染色带，分子量约为2.3万和5.7万，激光光密度计扫描见两组成分占94.7%和5.3%，可见纯化后抗体已达到电泳纯.
2.2 MGb2-PAD-DNR制备结果 纯化后MGb2-PAD-DNR，测定各成分克分子比为MGb2∶PAD∶DNR=1∶2∶44.
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2.3 抗体的免疫活性分数测定结果 胃癌细胞系SGC-7901悬浮液2×107/mL，倍比稀释4次，呈5个细胞浓度，加入10000cpM标记抗体反应后，以细胞浓度的倒数为横座标，每管总放射性与特异性结合放射性之比为纵座标作图.当细胞浓度无限大时，纵座标截距的倒数为抗体的免疫活性分数，见图1所示.结果显示MGb2标记125I后60.5%的抗体具有免疫活性，而MGb2-PAD-DNR中46.34%的抗体保留免疫活性，其中部分抗体(14.16%)是由于MGb2交联PAD-DNR造成，但这种降低无显著差异(P>0.05)说明交联对抗体的免疫活性损伤不大.
2.4 与靶细胞的结合方式 MGb2交联PAD-DNR前后与胃癌细胞系SGC-7901结合的方式没有明显改变，如图2所示. 从图中可以看出它们与靶细胞的结合随时间延长逐渐增多，在4℃时的结合高于37℃时，这种结合经pH 2.8等渗液处理消失，表明它们很少进入SGC-7901细胞.
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2.5 从靶细胞上释放的方式 MGb2-PAD-DNR与靶细胞SGC-7901结合后，从细胞上释放下来的特征与MGb2相似.如图3所示.MGb2和MGb2-PAD-DNR与靶细胞结合2h后，37℃时的结合较4℃时低，但释放较4℃时快，经72h释放后，存留在细胞上的抗体量较4℃时低.
图1 线性外推法“双倒数”作图测定抗体免疫活性.
图2 MGb2交联前后与靶细胞的结合. A.MGb2与靶细胞结合；B.MGb2—PAD—DNR与靶细胞结合. 0—04℃时的结合：x—x37℃时的结合. 0……04℃时内化抗体量；x……x37℃时内化抗体量.
图3 抗体从靶细胞上释放方式(图标同图2).
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3 讨论
柔红霉素具有广谱和强效的抗癌作用，在肿瘤化疗中居重要地位[4,6,7]，然而其选择性较低，对正常组织尤其是心脏产生严重毒性，治疗中常因患者不能耐受而中断. 用特异性较高的抗肿瘤单抗导向柔红霉素能明显提高其抗癌作用，减少毒副因素[5,8,9].本实验室已成功制备了以葡聚糖T40为中间体的MGb2-PAD-DNR交联物. 目前国内学者多采用间接免疫荧光法检测抗体活性[10,11]. 该法简便，可以直观地观察交联物和靶细胞的结合能力，但只能定性分析，而且敏感性较差. 细胞ELISA简单易行，但所检测到的无论是滴度还是含量都是相对值，在每次实验中变异很大，即使在同一次实验中，不同的抗体表现亦大不相同[2]. 单克隆抗体和药物联结后，交联物中抗体免疫活性的保留程度，是评价偶联方法可行性及新制备的交联物是否具有应用价值的一个重要指标. 因此准确而客观地检测免疫交联物中抗体免疫活性十分重要. Lindmo线性外推法很好地解决了这一难题[3]. 其基本原理是质量作用定律：[B]=ka[F][T-B]. 若具免疫活性的抗体为 则[B]=ka[F][[WTBZ] T-B].[T][B]=1+1Ka[F]，当[F]无限大时，[T]B]=1，以[T] [B]为纵坐标，1[F]为横坐标，纵轴截距的倒数即为抗体的免疫活性分数.这种评估方法是建立在抗原浓度无限过量假设上，并且与所用的抗原浓度，反应时间以及抗体与抗原浓度的比值无关，因而比较准确，客观. 同时也比较简便，快速. 可用于每次实验中导向药物的质量比较. 本文采用抗原抗体结合的线性外推法测定MGb2-PAD-DNR中有46.34%的MGb2具有免疫活性，由此看来，该方法确实能准确抗体的免疫活性，比较不同批号免疫交联物的抗体活性，控制实验中导向药物的差异，从而为临床应用提供稳定可靠的治疗用药. 此外，在相同条件下标记和测定游离抗体的免疫活性，并与交联物中抗体活性比较，可观察交联对抗体活性损伤的程度，因而可评价交联方法是否恰当[3]. 本实验通过葡聚糖T40氧化为多醛基葡聚糖PAD，利用其醛基和柔红霉素及单抗MGb2上的氨基以schiff′s键联接，减少或避免了柔红霉素与抗体进行多位点结合以及药物分子对抗体的空间位阻效应.MGb2在交联前后免疫活性下降14.16%(P>0.05)，而且仍保留原有的结合特征，表明这种交联方法及条件适合制备免疫交联物用于肿瘤导向治疗. 总之，测定抗体的免疫活性分数可准确而客观地评估单抗与化疗药物、毒素、放射性核素联结后的质量，评估交联方法的可行性. 同时结合着抗体与靶细胞的结合释放试验，更能全面地了解导向药物的结合特性，探讨其在体内可能的作用方式.
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4 参考文献1 Embleton MJ. Drugtargeting by monoclonal antibodies.Br J Cancer,1987;55(3):227
2 万文徽，董志伟. 单克隆抗体制品质量控制中的若干方法学问题. 单克隆抗体通讯，1991；7(3)：14
3 Lindmo T, Boven E, Cuttitta F,et al. Determination of the immunoreactive iraction of radiolabeled
monoclonal antibodies by linear extrapolation to binding at infinite antigen excess.
J Immunol Methods, 1984;72:14
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4 Jones ES，et al. Management of the lympnomas in: current concepts in theuse of doxorubicin chemtherapy.
ed.by Jones ES. Milan:Formitia carlo Erba, P103-105,1982
5 Levry R, Hurwitz E, Maron R,et al. The specific cytotoxic of daunomycinconjugates to antitumor
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6 Warring MJ，et al. Drug which affect the structure and function DNA.
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Nature (London),1986;219(5161):1320
7 Peterson C, Baurain R, Trouet A. The mechanism for cellular uptake;storge and release of daunorubicin.
Biochem Pharmacol,1980;29(12):1687
8 Hurwitz E，et al.Daunomycin-immunoglobulins conjugates uptake and activity in vitro.
Eur J Cancer,1978;14:1213
9 Aron R, Sela M,et al. In vitro and in vivo efficacy of conjugates of dannomycin with antitumor
antibodies.Immunol Rev, 1982;62:5
10 赵跃然，李辉. 大肠癌单克隆抗体阿霉素结合物的体内外抗肿瘤作用. 中华微生物和免疫学杂志，1986；8(6)：357
11 汪森明，陈希陶，张学庸. 胃癌单克隆抗体一阿霉素结合物的制备及其细胞毒试验.癌症，1990；9(3)：216, 百拇医药