汉防己甲素对大鼠实验性肝纤维化的防治作用
项目负责人:孙自勤，1958年9月生。消化内科主治医师，硕士学位。主要研究课题有急性肝损伤的机制与治疗，肝纤维化的诊断、防治等实验与临床研究。[山东省济南市师范路98号(250031)， 电话：552171 转69616]
摘要目的：汉防己甲素(Tet) 为中药粉防己根的提取物。本研究的目的为评价其抗肝纤维作用。
方法：用40% CCl4 1.2mL/kg体重皮下注射，2次/wk，共12wk，诱发SD大鼠肝纤维化。于初次注射开始，用Tet(治疗组)或盐水(对照组)灌胃，隔日1次共12wk。分别于4,8, 12, 14wk处死动物测定血清I型前胶原(PC)、肝及血清透明质酸(HA)、胶原、储脂细胞(FSC)及其细胞器。
结果：Tet可使血清PC, HA及肝HA降低，肝内胶原沉积减少。治疗结束时，血清PC为61.8μg/L±21.0μg/L，而对照组为270.2μg/L±46.1μg/L(P<0.01)；血清HA分别为204.0μg/L±70.8μg/L与565.2μg/L±161.9μg/L(P<0.01)；肝组织HA为86.9μg/g±15.3μg/g与186.5μg/g±46.2μg/g(P<0.01)。FSC及其内织网与线粒体受抑。
结论：我们的实验结果显示Tet能抑制肝内胶原的沉积，可用于治疗慢性肝病之肝纤维化。
主题词 肝纤维化 汉防己甲素 型前胶原 透明质酸 储脂细胞 治疗
孙自勤, 王要军, 权启镇, 刘晓峰, 潘雪, 江学良.汉防己甲素对大鼠实验性肝纤维化的防治作用.新消化病学杂志,1994;2(1):19-20
AIM The effect of tetrandrine (Tet), a purified extract from Chinese herb Stephania tetrandra S Moore, on experimental liver fibrosis in rats was studied.
METHODS Hepatofibrosis model was induced in SD rats, by 40% CCl4, 1.2mL/kg body weight, subscut aneously,twice a week for 12 weeks From the first injection of CCl4 on, 30mg of Tet (treatment group) or saline (control group)was given by stomach every 2 days for 12 weeks. The animals were sacrificed at4, 8, 12 and 14 weeks respectively Serum procollagen type (PC), liver and serum hyaluronate (HA) were detected.The liver collagen,number of fat-storing cells (FSC) and its oranganelles were examined.
RESULTS Tet could reduce the level of serum PC and HA and liver HA,and the deposition of liver collagen. At the end of the treatment, serum PC was 61.8μg/L±21.0μg/L in Tet-treated rats and 270.2μg/L±46.1μg/L in the control ones (P<0.01); serum HA was 204.0μg/g±70.8μg/g vs 565.2μg/L±161.9μg/L (P<0.01);liver HA was 86.9μg/L±15.3μg/L vs 186.5μg/g±46.2g/g (P<0.01). FSC and its endoplasmic reticulum and mitochondria were inhibited.
CONCLUSIONS Tet is able to inhibit the deposition of collagen in the liver and it may be used as an antifibrostic agent in chronicliver diseases.
KEYWORDS Liver fibrosis tetrandrine procollagen typeⅢ hyaluronate fat-storing cell
Sun ZQ, Wang YJ, Quan QZ, Liu XF, Pan X, Jiang XL. Prevention and treatmentaction of tetrandrine on experimental liver fibrosis in rats.
XinXiaohuabingxue Zazhi,1994;2(1):19-20
肝纤维化是诸多慢性肝病向肝硬变发展的必经病理过程，但此期是可以逆转的。阻止和逆转肝纤维化的发展，促进肝纤维化的逐步分解吸收，不仅能减轻肝脏损害程度，而且能防止肝硬变的发生，改善肝脏疾病的预后，因而治疗肝纤维化是防治肝硬变的关键。然而，目前所使用的抗肝纤维化药物均不尽人意，不是效果欠佳，就是毒副作用过大。为此，寻找安全有效的抗肝纤维化药物是治疗慢性肝病的当务之急。本文用汉防己甲素(Tet)对四氯化碳(CCl4)诱导的肝纤维化大鼠进行治疗，观察了其对肝纤维化的预防作用及逆转作用。
1 材料和方法
1.1 动物 Wistar雄性大鼠，体重283g±39g，由山东省医科院提供。
1.2 主要试剂及药品 CCl4，济南化工厂生产；Tet，浙江金华制药厂生产；透明质酸(HA)试剂盒， 海军医学研究所提供；Ⅲ型前胶原肽(PC)试剂盒，由重庆医科大学提供。
1.3 肝纤维化模型制备 临用前用精制花生油将CCl4配成40% CCl4花生油溶液，按1.2mL/kg体重给Wistar大鼠皮下注射，2次/wk，共12wk。正常动物对照组则用同样方法皮下注射花生油1.2mL/kg体重。
1.4 实验经过及疗效观察 将72只Wistar大鼠随机分为3组，每组各24只。A组为正常对照组。B组于初次注射CCl4后生理盐水灌胃，每次2mL，3次/wk，共14wk。C组于初次注射CCl4后开始用Tet水溶液灌胃，30mg/kg体重，方法同B组。于wk4, wk8, wk12, wk14随机分批处死动物,取血及肝组织测定：血清PC(放免法，按试剂盒说明书进行)；肝组织及血清HA(放免法，按试剂盒说明书进行)；肝组织HE及VG染色，检查组织病理学及肝胶原纤维变化；2%戊二醛固定肝标本，行透射电镜及扫描电镜检查，以观察储脂细胞(FSC)的变化。
2 结果
2.1 于注射CCl 4后wk4开始，血清PC含量即明显高于正常(P<0.01)，随肝纤维化加深，PC水平进一步升高。Tet治疗组PC水平则明显低于未治组。见表1。
表1 血清PCⅢ含量变化
A-正常对照 B-纤维化未治疗 C-Tet治疗组
*为B组与A组比P<0.01
**为C组与B组比P<0.01
2.2 肝组织及血清HA水平于wk4, wk8, wk12, wk14均显著高于正常，而治疗组血清及肝组织HA均明显低于未治组。见表2，3。
表2 肝组织HA含量变化
*为B组与A组比P<0.01
**代表C组与B组比P<0.05
**为C组与B组比P<0.01
表3 血清HA含量变化
*为B组与A组比P<0.01
**为C组与B组比P<0.01
2.3 肝组织病理学观察 wk4，未治组全小叶肝细胞均有明显的变性，尤以中央静脉周围呈空泡变性，超过12肝小叶，个别细胞可见核固缩、崩解现象，外围及近界板处肝细胞明显嗜酸变性，散在肝细胞嗜酸坏死。汇管区有炎症细胞浸润。此时无肝纤维化，但汇管区胶原纤维增多。Tet治疗组肝细胞空泡变性较未治组明显减轻，不足14肝小叶，外围肝细胞浊肿变性，无嗜酸性坏死，汇管区炎细胞浸润较未治组为轻，且未见明显胶原纤维形成。wk8，未治组中央静脉周围变性坏死范围扩大，常达23肝小叶以上，并见汇管区及中央静脉周围胶原明显增多，汇管区淋巴细胞及单核细胞浸润明显。胶原沿界板延伸，呈细纤维隔状，尚无完整分隔形成。Tet治疗组中央静脉周围空泡变性基本消失,中央静脉壁及汇管区少量胶原沉积，但无纤维隔状胶原延伸现象。汇管区炎细胞浸润较少。wk12，未治组肝纤维化继续加重，肝小叶间有完整纤维隔，包绕肝小叶，并可见纤维伸至小叶内。Tet治疗组肝小叶间仅少量胶原纤维，未形成完整分隔。wk14，未治组见个别假小叶形成，而Tet治疗组中央静脉及汇管区仅少量胶原纤维沉积。
2.4 FSC检查 wk4，未治组肝窦内FSC增生活跃，呈梭形或卵圆形，内含多量脂肪滴。Tet治疗组较未治组少。wk8除见到上述形态的FSC外，还可见到部分FSC胞质丰富，脂滴较少，内含大量粗面内织网、线粒体和高尔基体。细胞表面有少量胶原纤维。Tet治疗则很少见到这种形态的FSC。wk12，未治组仍见较多的FSC，线粒体、粗面内织网及高尔基体均较丰富。Tet 治疗组FSC数量较少，且线粒体及粗面内织网等细胞器均不及未治组发达。
3 讨论
本模型采用较小剂量CCl4诱导产生肝纤维化，动物无死亡，便于动态观察。血清PC能较好地反映肝纤维化的早期病变，并可作为肝纤维化活动及动态变化的观察指标之一[1]。本研究发现，治疗组血清PCⅢ明显低于对照组。HA是一种氨基多糖，是细胞外基质的重要组成部分。目前的研究表明，血清HA是一个能更好地反应肝脏病变与肝纤维化程度的指标，优于P-P，其敏感性与特异性均较高[2]。本文结果表明，肝纤维化时HA水平显著高于正常，其动态变化过程与血清PCⅢ及肝胶原变化一致。经Tet治疗后，肝组织及血清HA明显降低。HE及VG染色显示，在CCl4诱导早期，肝内病变主要以细胞变性、坏死及汇管区炎症细胞浸润为主，以后则胶原纤维不断沉积，最后形成明显肝纤维化。而Tet治疗组细胞变性、坏死、炎细胞浸润及胶原纤维沉积程度均明显低于对照组。 透射电镜检查发现，随肝纤维化进展，FSC数目增加，胞质丰富，线粒体、内质网及高尔基体发达。研究表明，正常状态下，FSC、肝细胞及肝窦内皮细胞合成胶原。在肝纤维化时，过量的胶原纤维主要由FSC产生[3,4]。原位杂交技术表明，I、II、IV型胶原的基因表达增强主要分布在FSC内[4]，且其他细胞外基质成分如蛋白聚糖(PG)、纤维连结蛋白(FN)、层粘连蛋白(LN)等的表达也增加[4,5-7]，这些研究进一步从分子水平上证明了肝纤维化时FSC是细胞外基质成分的主要来源。在肝纤维化时，FSC在一系列细胞因子的作用下，转化为肌纤维母细胞 样细胞，后者具有分泌I、II、IV型胶原及FN, LN, PG等的作用。因此，FSC在肝纤维化形成和发展中起中心作用。我们的实验证实在肝纤维化时增生活跃，用Tet治疗可使FSC数目减少，粗面内织网、线粒体、高尔基体等产生与分泌胶原的细胞器均受到抑制。推测Tet抗肝纤维化作用部分可能归功于其抑制FSC增生及向肌纤维母细胞转化过渡的结果。 本研究表明，Tet对肝纤维化具有确实可靠的防治效果。其作用机制有待于进一步阐明。
4 参考文献1 李伟道，刘兴明，林丁，等. 人型前胶原的提取、纯化与抗血清的制备应用于肝纤维化的诊断.
胃肠病学与肝病学杂志，1992；1(1)：44-46
2 孙自勤, 权启镇. 肝纤维化血清学诊断进展. 临床肝胆病杂志，1993；9(4)：184-186
3 Friedman SL, Roll FJ, Boyles J, et al. Hepatic lipocytes: the principalcollagen-producing cells
of normal rat liver. Proc Natl Acad Sci USA,1985;82:8681-8685
4 Ballardini G. Correlation between Ito cells and fibrogenesis in experimentalmodel of hepatic
fibrosis: A sequential stereological study. Liver,1983;1(1):58
5 Hendriks HFJ, Bosma A, Brouwer A. Fat-storing cells. Hyper-and hypovitaminosis A and the
relationships with liver fibrosis. Semi Liver Dis,1993;13(1):72-80
6 王要军，于峻基. 储脂细胞与肝纤维化. 临床肝胆病杂志，1993；9(4)：182-184
7 Schafer S, Zerbe O, Gressner AM. The synthesis of proteoglycans in fat storing cells
of rat liver.Hepatology,1987;7(4):680-687, 百拇医药
摘要目的：汉防己甲素(Tet) 为中药粉防己根的提取物。本研究的目的为评价其抗肝纤维作用。
方法：用40% CCl4 1.2mL/kg体重皮下注射，2次/wk，共12wk，诱发SD大鼠肝纤维化。于初次注射开始，用Tet(治疗组)或盐水(对照组)灌胃，隔日1次共12wk。分别于4,8, 12, 14wk处死动物测定血清I型前胶原(PC)、肝及血清透明质酸(HA)、胶原、储脂细胞(FSC)及其细胞器。
结果：Tet可使血清PC, HA及肝HA降低，肝内胶原沉积减少。治疗结束时，血清PC为61.8μg/L±21.0μg/L，而对照组为270.2μg/L±46.1μg/L(P<0.01)；血清HA分别为204.0μg/L±70.8μg/L与565.2μg/L±161.9μg/L(P<0.01)；肝组织HA为86.9μg/g±15.3μg/g与186.5μg/g±46.2μg/g(P<0.01)。FSC及其内织网与线粒体受抑。
结论：我们的实验结果显示Tet能抑制肝内胶原的沉积，可用于治疗慢性肝病之肝纤维化。
主题词 肝纤维化 汉防己甲素 型前胶原 透明质酸 储脂细胞 治疗
孙自勤, 王要军, 权启镇, 刘晓峰, 潘雪, 江学良.汉防己甲素对大鼠实验性肝纤维化的防治作用.新消化病学杂志,1994;2(1):19-20
AIM The effect of tetrandrine (Tet), a purified extract from Chinese herb Stephania tetrandra S Moore, on experimental liver fibrosis in rats was studied.
METHODS Hepatofibrosis model was induced in SD rats, by 40% CCl4, 1.2mL/kg body weight, subscut aneously,twice a week for 12 weeks From the first injection of CCl4 on, 30mg of Tet (treatment group) or saline (control group)was given by stomach every 2 days for 12 weeks. The animals were sacrificed at4, 8, 12 and 14 weeks respectively Serum procollagen type (PC), liver and serum hyaluronate (HA) were detected.The liver collagen,number of fat-storing cells (FSC) and its oranganelles were examined.
RESULTS Tet could reduce the level of serum PC and HA and liver HA,and the deposition of liver collagen. At the end of the treatment, serum PC was 61.8μg/L±21.0μg/L in Tet-treated rats and 270.2μg/L±46.1μg/L in the control ones (P<0.01); serum HA was 204.0μg/g±70.8μg/g vs 565.2μg/L±161.9μg/L (P<0.01);liver HA was 86.9μg/L±15.3μg/L vs 186.5μg/g±46.2g/g (P<0.01). FSC and its endoplasmic reticulum and mitochondria were inhibited.
CONCLUSIONS Tet is able to inhibit the deposition of collagen in the liver and it may be used as an antifibrostic agent in chronicliver diseases.
KEYWORDS Liver fibrosis tetrandrine procollagen typeⅢ hyaluronate fat-storing cell
Sun ZQ, Wang YJ, Quan QZ, Liu XF, Pan X, Jiang XL. Prevention and treatmentaction of tetrandrine on experimental liver fibrosis in rats.
XinXiaohuabingxue Zazhi,1994;2(1):19-20
肝纤维化是诸多慢性肝病向肝硬变发展的必经病理过程，但此期是可以逆转的。阻止和逆转肝纤维化的发展，促进肝纤维化的逐步分解吸收，不仅能减轻肝脏损害程度，而且能防止肝硬变的发生，改善肝脏疾病的预后，因而治疗肝纤维化是防治肝硬变的关键。然而，目前所使用的抗肝纤维化药物均不尽人意，不是效果欠佳，就是毒副作用过大。为此，寻找安全有效的抗肝纤维化药物是治疗慢性肝病的当务之急。本文用汉防己甲素(Tet)对四氯化碳(CCl4)诱导的肝纤维化大鼠进行治疗，观察了其对肝纤维化的预防作用及逆转作用。
1 材料和方法
1.1 动物 Wistar雄性大鼠，体重283g±39g，由山东省医科院提供。
1.2 主要试剂及药品 CCl4，济南化工厂生产；Tet，浙江金华制药厂生产；透明质酸(HA)试剂盒， 海军医学研究所提供；Ⅲ型前胶原肽(PC)试剂盒，由重庆医科大学提供。
1.3 肝纤维化模型制备 临用前用精制花生油将CCl4配成40% CCl4花生油溶液，按1.2mL/kg体重给Wistar大鼠皮下注射，2次/wk，共12wk。正常动物对照组则用同样方法皮下注射花生油1.2mL/kg体重。
1.4 实验经过及疗效观察 将72只Wistar大鼠随机分为3组，每组各24只。A组为正常对照组。B组于初次注射CCl4后生理盐水灌胃，每次2mL，3次/wk，共14wk。C组于初次注射CCl4后开始用Tet水溶液灌胃，30mg/kg体重，方法同B组。于wk4, wk8, wk12, wk14随机分批处死动物,取血及肝组织测定：血清PC(放免法，按试剂盒说明书进行)；肝组织及血清HA(放免法，按试剂盒说明书进行)；肝组织HE及VG染色，检查组织病理学及肝胶原纤维变化；2%戊二醛固定肝标本，行透射电镜及扫描电镜检查，以观察储脂细胞(FSC)的变化。
2 结果
2.1 于注射CCl 4后wk4开始，血清PC含量即明显高于正常(P<0.01)，随肝纤维化加深，PC水平进一步升高。Tet治疗组PC水平则明显低于未治组。见表1。
表1 血清PCⅢ含量变化
| time(week) | Serum PC (x-±s, μg/L) | ||
| A | B | C | |
| 4 | 52.5±6.7 | 135.7±29.0* | 101.0±33.9 |
| 8 | 42.7±10.0 | 268.2±53.9* | 90.6±30.5** |
| 12 | 43.0±5.3 | 290.7±81.7* | 63.2±24.1** |
| 14 | 62.5±7.1 | 270.2±46.1* | 61.8±21.0** |
A-正常对照 B-纤维化未治疗 C-Tet治疗组
*为B组与A组比P<0.01
**为C组与B组比P<0.01
2.2 肝组织及血清HA水平于wk4, wk8, wk12, wk14均显著高于正常，而治疗组血清及肝组织HA均明显低于未治组。见表2，3。
表2 肝组织HA含量变化
| time(week) | Liver HA (x-±s, μg/g) | ||
| A | B | C | |
| 4 | 49.0±17.7 | 110.0±39.4* | 92.7±32.3 |
| 8 | 55.9±16.4 | 130.8±44.5* | 97.2±15.4** |
| 12 | 62.8±13.6 | 167.7±46.7* | 105.6±20.1** |
| 14 | 52.8±16.9 | 186.5±46.2* | 86.9±15.3** |
*为B组与A组比P<0.01
**代表C组与B组比P<0.05
**为C组与B组比P<0.01
表3 血清HA含量变化
| time(week) | Serum HA (x-±s, μg/L) | ||
| A | B | C | |
| 4 | 65.2±10.5 | 372.3±48.1* | 172.2±41.8** |
| 8 | 57.6±19.3 | 440.0±111.2* | 192.3±44.5** |
| 12 | 70.4±16.9 | 614.2±123.9* | 216.8±58.9** |
| 14 | 58.4±17.7 | 565.2±161.9* | 204.0±70.8** |
*为B组与A组比P<0.01
**为C组与B组比P<0.01
2.3 肝组织病理学观察 wk4，未治组全小叶肝细胞均有明显的变性，尤以中央静脉周围呈空泡变性，超过12肝小叶，个别细胞可见核固缩、崩解现象，外围及近界板处肝细胞明显嗜酸变性，散在肝细胞嗜酸坏死。汇管区有炎症细胞浸润。此时无肝纤维化，但汇管区胶原纤维增多。Tet治疗组肝细胞空泡变性较未治组明显减轻，不足14肝小叶，外围肝细胞浊肿变性，无嗜酸性坏死，汇管区炎细胞浸润较未治组为轻，且未见明显胶原纤维形成。wk8，未治组中央静脉周围变性坏死范围扩大，常达23肝小叶以上，并见汇管区及中央静脉周围胶原明显增多，汇管区淋巴细胞及单核细胞浸润明显。胶原沿界板延伸，呈细纤维隔状，尚无完整分隔形成。Tet治疗组中央静脉周围空泡变性基本消失,中央静脉壁及汇管区少量胶原沉积，但无纤维隔状胶原延伸现象。汇管区炎细胞浸润较少。wk12，未治组肝纤维化继续加重，肝小叶间有完整纤维隔，包绕肝小叶，并可见纤维伸至小叶内。Tet治疗组肝小叶间仅少量胶原纤维，未形成完整分隔。wk14，未治组见个别假小叶形成，而Tet治疗组中央静脉及汇管区仅少量胶原纤维沉积。
2.4 FSC检查 wk4，未治组肝窦内FSC增生活跃，呈梭形或卵圆形，内含多量脂肪滴。Tet治疗组较未治组少。wk8除见到上述形态的FSC外，还可见到部分FSC胞质丰富，脂滴较少，内含大量粗面内织网、线粒体和高尔基体。细胞表面有少量胶原纤维。Tet治疗则很少见到这种形态的FSC。wk12，未治组仍见较多的FSC，线粒体、粗面内织网及高尔基体均较丰富。Tet 治疗组FSC数量较少，且线粒体及粗面内织网等细胞器均不及未治组发达。
3 讨论
本模型采用较小剂量CCl4诱导产生肝纤维化，动物无死亡，便于动态观察。血清PC能较好地反映肝纤维化的早期病变，并可作为肝纤维化活动及动态变化的观察指标之一[1]。本研究发现，治疗组血清PCⅢ明显低于对照组。HA是一种氨基多糖，是细胞外基质的重要组成部分。目前的研究表明，血清HA是一个能更好地反应肝脏病变与肝纤维化程度的指标，优于P-P，其敏感性与特异性均较高[2]。本文结果表明，肝纤维化时HA水平显著高于正常，其动态变化过程与血清PCⅢ及肝胶原变化一致。经Tet治疗后，肝组织及血清HA明显降低。HE及VG染色显示，在CCl4诱导早期，肝内病变主要以细胞变性、坏死及汇管区炎症细胞浸润为主，以后则胶原纤维不断沉积，最后形成明显肝纤维化。而Tet治疗组细胞变性、坏死、炎细胞浸润及胶原纤维沉积程度均明显低于对照组。 透射电镜检查发现，随肝纤维化进展，FSC数目增加，胞质丰富，线粒体、内质网及高尔基体发达。研究表明，正常状态下，FSC、肝细胞及肝窦内皮细胞合成胶原。在肝纤维化时，过量的胶原纤维主要由FSC产生[3,4]。原位杂交技术表明，I、II、IV型胶原的基因表达增强主要分布在FSC内[4]，且其他细胞外基质成分如蛋白聚糖(PG)、纤维连结蛋白(FN)、层粘连蛋白(LN)等的表达也增加[4,5-7]，这些研究进一步从分子水平上证明了肝纤维化时FSC是细胞外基质成分的主要来源。在肝纤维化时，FSC在一系列细胞因子的作用下，转化为肌纤维母细胞 样细胞，后者具有分泌I、II、IV型胶原及FN, LN, PG等的作用。因此，FSC在肝纤维化形成和发展中起中心作用。我们的实验证实在肝纤维化时增生活跃，用Tet治疗可使FSC数目减少，粗面内织网、线粒体、高尔基体等产生与分泌胶原的细胞器均受到抑制。推测Tet抗肝纤维化作用部分可能归功于其抑制FSC增生及向肌纤维母细胞转化过渡的结果。 本研究表明，Tet对肝纤维化具有确实可靠的防治效果。其作用机制有待于进一步阐明。
4 参考文献1 李伟道，刘兴明，林丁，等. 人型前胶原的提取、纯化与抗血清的制备应用于肝纤维化的诊断.
胃肠病学与肝病学杂志，1992；1(1)：44-46
2 孙自勤, 权启镇. 肝纤维化血清学诊断进展. 临床肝胆病杂志，1993；9(4)：184-186
3 Friedman SL, Roll FJ, Boyles J, et al. Hepatic lipocytes: the principalcollagen-producing cells
of normal rat liver. Proc Natl Acad Sci USA,1985;82:8681-8685
4 Ballardini G. Correlation between Ito cells and fibrogenesis in experimentalmodel of hepatic
fibrosis: A sequential stereological study. Liver,1983;1(1):58
5 Hendriks HFJ, Bosma A, Brouwer A. Fat-storing cells. Hyper-and hypovitaminosis A and the
relationships with liver fibrosis. Semi Liver Dis,1993;13(1):72-80
6 王要军，于峻基. 储脂细胞与肝纤维化. 临床肝胆病杂志，1993；9(4)：182-184
7 Schafer S, Zerbe O, Gressner AM. The synthesis of proteoglycans in fat storing cells
of rat liver.Hepatology,1987;7(4):680-687, 百拇医药