肝癌特异性转移因子对杀伤细胞活性及T细胞亚群的影响
项目负责人:彭贵勇, 630038, 重庆市第三军医大学西南医院
摘要目的：研究肝癌特异性转移因子对肝癌患者NK及LAK细胞活性和T细胞亚群的影响。
方法：用免疫山羊的淋巴组织经匀浆透析法制备抗肝癌特异性转移因子，并在体外观察其对20例肝癌患者NK、LAK活性及T细胞亚群的影响。
结果：肝癌特异性转移因子能明显增加肝癌患者及正常人的NK及LAK活性和肝癌患者的T4/T8比值，但对正H薚细胞亚群无影响。正常转移因子能增加正常人NK活性、LAK活性及肝癌患者的LAK活性，但对肝癌患者及正常人T细胞亚群无影响。
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结论：特异性转移因子既有非特异性又有特异性作用。这可能是特异性转移因子的抗肿瘤机制之一，临床应用特异性转移因子效果更好。
主题词 肝肿瘤;转移因子;NK细胞;LAK细胞;T细胞亚群
彭贵勇, 袁爱力, 蔡景修.肝癌特异性转移因子对杀伤细胞活性及T细胞亚群的影响.新消化病学杂志,1994;2(3):154-155
AIM Effects of hepatocellular carcinomaspecific transfer factor (HCC-STF) on NK and LAK activities and T lymphocyte subsets in patients with HCC were studied.
, 百拇医药
METHODS HCC-STF was extracted from lymphoid tissues of goats immunized with HCC cell suspension. The effects of HCC-STF on NK and LAK activities and T cell subsets in 20 patients with HCC were studied in vitro.
RESULTS NK and LAK activities in both HCC patients and normal subjects and CD+4/CD+8 ratio in the patients but not in normal subjects were increased by HCC-STF. The NK and LAK activities in normal subjects and LAK activity in HCC patients were increased by normal- transfer factor (N-TF).But T cell subsets in both patients and healthy donors weren't increased by N-TF.
, 百拇医药
CONCLUSIONS The effects of HCC-STF are both nonspecific and specific. This may be one of the anti-tumor mechanisms of HCC-STF. It is sugge sted that HCC-STF may be better than N-TF in immunotherapy of human tumors.
Keywords hepatocellular carcinoma;transfer factor;natural killer;T cell subsets
Pen GY, Yuan AL, Cai JX. Effects of hepatocellular carcinoma-specific transfer factor on NK and LAK activities and T lymphocyte subsets. XinXiaohuabingxue Zazhi,1994;2(3):154-155
, 百拇医药
NK细胞及LAK细胞具有直接杀伤肿瘤细胞的功能，在肿瘤免疫中起着重要作用，T细胞亚群也是细胞免疫的重要指标。迄今研究表明肝癌患者NK活性、LAK活性及T4/T8比值明显下降[1，2]。如何提高患者的免疫功能是肿瘤免疫治疗的重要方面。转移因子可调节细胞免疫功能，现己用于多种肿瘤辅助治疗。但其抗肿瘤机制尚不十分明确。本文观察肝癌特异性转移因子(HCC-STF)和正常转移因子(N-TF)对肝癌患者NK活性、LAK活性及T细胞亚群的体外影响，以期进一步探讨转移因子的作用机制。
1 对象和方法
1.1 对象 原发性肝癌患者20例，男17例，女3例；年龄33岁～69岁，平均46.7岁；均经病理或临床确诊。正常人30例，均为健康献血员，男22例，女8例；年龄27岁～46岁，平均33.7岁。
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1.2 主要材料及仪器 3H-TdR(中国原子能研究所产品，比度814GBq/mmol), rIL-2(中国科学院上海生物化学研究所产品)、CD3, CD4, CD8单克隆抗体(武汉生物制品研究所产品)、ABC药盒(华美公司产品)、K562细胞及Raji细胞(我校免疫学教研室提供)、液体闪烁计数仪(LKB1217，瑞典)。
1.3 方法
1.3.1 HCC-STF及N-TF的制备 按余贺方法免疫山羊，采用匀浆透析法制备HCC-STF及N-TF[3]。并规定以紫外吸收最高峰处8.0ABS为1U。
1.3.2 靶细胞标记 取生长良好的K562细胞或Raji细胞配成1×106/mL浓度，取1mL细胞悬液加入3H-TdR 370 kBq,置于37水浴箱中温育，20min振荡1次，标记4h，细胞用Hanks液洗2次，RPMI 1640完全培养液洗1次，配成1×105/mL细胞悬液。
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1.3.3 效应细胞制备 采用Ficoll-Hypaque法分离外周血淋巴细胞。实验分对照组及HCC-STF组和N-TF实验组。每孔取淋巴细胞5×106/1mL，加入16孔培养板中。NK细胞：实验组分别加HCC-STF或N-TF各2.5×10-2U/孔，于37，5% CO2孵箱中培养4h，收集细胞为NK活性。LAK细胞：各组加入rIL 2200U/孔。实验组分别再加入HCC-STF或N-TF2.5×10-2U/孔，同法培养72h，收集细胞为LAK细胞。
1.3.4 3H-TdR释放法微量细胞毒试验 参照谢琪et al[4]方法操作。效/靶=25.1。K562细胞为NK活性靶细胞，Raji细胞为LAK活性靶细胞。按下列公式计算NK及LAK活性。NK及LAK活性(%)=(1-实验组cpm 靶细胞自然释放组cpm )×100%.
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1.3.5 T细胞亚群检测 取外周血淋巴细胞1×106/1mL放入24孔板中，加入HCC-STF或N-TF 5×10-3U/孔，在37，5%CO2孵箱中培养18h,细胞用Hanks液洗2次后涂片。采用ABC方法按文献[3]方法操作。
表1 HCC-STF及N-TF对NK及LAK活性的影响 (x -±s)
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aP<0.01，bP<0.05, vs 正常人；cP>0.05, vs 正常人+N-TF；dP>0.05, eP<0.01，vs HCC；fP<0.05, gP<0.01, vs HCC+N-TF。
2 结果
2.1 HCC-STF及N-TF对肝癌患者及正常人NK活性和LAK活性的影响 肝癌患者NK活性及LAK活性与正常人比明显低下(P<0.01)。 HCC-STF及N-TF均能显著地增加正常人NK及LAK活性(P<0.01及<0.05)，两组相比无明显差异(P>0.05)。HCC-STF能显著增加肝癌患者NK及LAK活性(P<0.01)，N-TF也能明显增加肝癌患者的LAK活性，但其增加幅度不如HCC-STF明显(P<0.05)，N-TF对肝癌患者NK活性无影响，见表1。
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2.2 HCC-STF及N-TF对肝癌患者及正常人T细胞亚群的影响 与正常人相比，肝癌患者外周血T3, T4细胞百分率明显降低，T8细胞升高，T4/T8比值下降(P<0.01)。加入HCC-STF后正常人T细胞亚群无明显变化，肝癌患者T3, T4细胞明显增加(P<0.01)，T8细胞下降(P<0.05)，T4/T8比值升高(P<0.01)。N-TF无此作用，见表2。
表2 HCC-STF及N-TF对T细胞亚群的影响 (x -±s)
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aP>0.05，vs 正常人；bP>0.05, cP<0.01, dP<0.05,vs HCC。
3 讨论
恶性肿瘤的免疫治疗已取得较大进展，其一是过继免疫治疗，即输给肿瘤宿主具有抗肿瘤活性的细胞毒淋巴细胞，如NK细胞、LAK细胞及肿瘤浸润淋巴细胞等。其二是多种细胞因子的应用，如肿瘤坏死因子、干扰素、白介素Ⅱ等。转移因子是细胞因子之一，现己用于多种肿瘤的辅助治疗，并取得了一定效果，但对其抗肿瘤机制仍不十分明确，初步认为有：①直接抑制或杀伤肿瘤细胞；②增加机体对肿瘤细胞的免疫功能；③诱生多种细胞因子。本文显示转移因子可明显增加NK及LAK活性，这可能是转移因子抗肿瘤浦弧N颐腔贡?较了HCC-STF与N-TF的作用，结果显示HCC-STF除具有N-TF的非特异性作用外，还具有特异性增加肝癌患者NK及LAK活性的作用。目前对转移因子增加NK及LAK活性的机制尚不清楚，本文推测可能是通过增加NK及LAK前体细胞变为NK及LAK细胞或增加NK及LAK细胞内淋巴因子的释放所致。根据分化抗原不同，通常可将人T细胞分为T4和T8两个主要亚群，T4和T8细胞亚群百分率及二者比值的变化反映了机体免疫调节功能的变化。本文结果显示HCC-STF能显著增加肝癌患者的T细胞数量和T4百分率，降低T8百分率，增加T4/T8比值，对正常人T细胞亚群无明显影响。N-TF无此作用。提示S-TF能调节异常的T细胞亚群，但对正常人T细胞亚群无影响。进一步证明S-TF能特异性地提高肿瘤患者的细胞免疫功能，提示S-TF对肿瘤的治疗效果明显优于N-TF。
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4 参考文献1 Chuang WL, Liu HW, Chang WY. Natural killer cell activity in patients with hepatocellular carcinoma
relative to early development and tumor invasion.Cancer, 1990;65(4)：926-930
2 彭贵勇，袁爱力，蔡景修. 肝癌患者IL-2活性、IL-2R表达及T细胞亚群变化及其影响因素. 四川医学，1993；(8)：464-466
3 彭贵勇，袁爱力，蔡景修. 肝癌特异性转移因子对IL-2活性及IL-2R表达的影响. 中华肿瘤杂志，1993；(6)：435-437
4 谢琪，吴厚生，范行义，et al. 3H-TdR, 51Cr, 125I-UdR释放试验测定NK活性的比较研究.
上海免疫学杂志，1993；(6)：351-352
5 彭贵勇，袁爱力. 转移因子治疗肿瘤现状及展望. 中国民政医学杂志，1993；(3)：111-114, 百拇医药(彭贵勇,袁爱力,蔡景修)
摘要目的：研究肝癌特异性转移因子对肝癌患者NK及LAK细胞活性和T细胞亚群的影响。
方法：用免疫山羊的淋巴组织经匀浆透析法制备抗肝癌特异性转移因子，并在体外观察其对20例肝癌患者NK、LAK活性及T细胞亚群的影响。
结果：肝癌特异性转移因子能明显增加肝癌患者及正常人的NK及LAK活性和肝癌患者的T4/T8比值，但对正H薚细胞亚群无影响。正常转移因子能增加正常人NK活性、LAK活性及肝癌患者的LAK活性，但对肝癌患者及正常人T细胞亚群无影响。
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结论：特异性转移因子既有非特异性又有特异性作用。这可能是特异性转移因子的抗肿瘤机制之一，临床应用特异性转移因子效果更好。
主题词 肝肿瘤;转移因子;NK细胞;LAK细胞;T细胞亚群
彭贵勇, 袁爱力, 蔡景修.肝癌特异性转移因子对杀伤细胞活性及T细胞亚群的影响.新消化病学杂志,1994;2(3):154-155
AIM Effects of hepatocellular carcinomaspecific transfer factor (HCC-STF) on NK and LAK activities and T lymphocyte subsets in patients with HCC were studied.
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METHODS HCC-STF was extracted from lymphoid tissues of goats immunized with HCC cell suspension. The effects of HCC-STF on NK and LAK activities and T cell subsets in 20 patients with HCC were studied in vitro.
RESULTS NK and LAK activities in both HCC patients and normal subjects and CD+4/CD+8 ratio in the patients but not in normal subjects were increased by HCC-STF. The NK and LAK activities in normal subjects and LAK activity in HCC patients were increased by normal- transfer factor (N-TF).But T cell subsets in both patients and healthy donors weren't increased by N-TF.
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CONCLUSIONS The effects of HCC-STF are both nonspecific and specific. This may be one of the anti-tumor mechanisms of HCC-STF. It is sugge sted that HCC-STF may be better than N-TF in immunotherapy of human tumors.
Keywords hepatocellular carcinoma;transfer factor;natural killer;T cell subsets
Pen GY, Yuan AL, Cai JX. Effects of hepatocellular carcinoma-specific transfer factor on NK and LAK activities and T lymphocyte subsets. XinXiaohuabingxue Zazhi,1994;2(3):154-155
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NK细胞及LAK细胞具有直接杀伤肿瘤细胞的功能，在肿瘤免疫中起着重要作用，T细胞亚群也是细胞免疫的重要指标。迄今研究表明肝癌患者NK活性、LAK活性及T4/T8比值明显下降[1，2]。如何提高患者的免疫功能是肿瘤免疫治疗的重要方面。转移因子可调节细胞免疫功能，现己用于多种肿瘤辅助治疗。但其抗肿瘤机制尚不十分明确。本文观察肝癌特异性转移因子(HCC-STF)和正常转移因子(N-TF)对肝癌患者NK活性、LAK活性及T细胞亚群的体外影响，以期进一步探讨转移因子的作用机制。
1 对象和方法
1.1 对象 原发性肝癌患者20例，男17例，女3例；年龄33岁～69岁，平均46.7岁；均经病理或临床确诊。正常人30例，均为健康献血员，男22例，女8例；年龄27岁～46岁，平均33.7岁。
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1.2 主要材料及仪器 3H-TdR(中国原子能研究所产品，比度814GBq/mmol), rIL-2(中国科学院上海生物化学研究所产品)、CD3, CD4, CD8单克隆抗体(武汉生物制品研究所产品)、ABC药盒(华美公司产品)、K562细胞及Raji细胞(我校免疫学教研室提供)、液体闪烁计数仪(LKB1217，瑞典)。
1.3 方法
1.3.1 HCC-STF及N-TF的制备 按余贺方法免疫山羊，采用匀浆透析法制备HCC-STF及N-TF[3]。并规定以紫外吸收最高峰处8.0ABS为1U。
1.3.2 靶细胞标记 取生长良好的K562细胞或Raji细胞配成1×106/mL浓度，取1mL细胞悬液加入3H-TdR 370 kBq,置于37水浴箱中温育，20min振荡1次，标记4h，细胞用Hanks液洗2次，RPMI 1640完全培养液洗1次，配成1×105/mL细胞悬液。
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1.3.3 效应细胞制备 采用Ficoll-Hypaque法分离外周血淋巴细胞。实验分对照组及HCC-STF组和N-TF实验组。每孔取淋巴细胞5×106/1mL，加入16孔培养板中。NK细胞：实验组分别加HCC-STF或N-TF各2.5×10-2U/孔，于37，5% CO2孵箱中培养4h，收集细胞为NK活性。LAK细胞：各组加入rIL 2200U/孔。实验组分别再加入HCC-STF或N-TF2.5×10-2U/孔，同法培养72h，收集细胞为LAK细胞。
1.3.4 3H-TdR释放法微量细胞毒试验 参照谢琪et al[4]方法操作。效/靶=25.1。K562细胞为NK活性靶细胞，Raji细胞为LAK活性靶细胞。按下列公式计算NK及LAK活性。NK及LAK活性(%)=(1-实验组cpm 靶细胞自然释放组cpm )×100%.
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1.3.5 T细胞亚群检测 取外周血淋巴细胞1×106/1mL放入24孔板中，加入HCC-STF或N-TF 5×10-3U/孔，在37，5%CO2孵箱中培养18h,细胞用Hanks液洗2次后涂片。采用ABC方法按文献[3]方法操作。
表1 HCC-STF及N-TF对NK及LAK活性的影响 (x -±s)
| 分组 | n | NK活性(%) | LAK活性(%) |
| 正常人 | 30 | 29.5±10.1 | 29.7±8.4 |
| 正常人+N-TF | 30 | 37.3±13.2a | 37.2±10.4a |
| 正常人+HCC-STF | 30 | 38.2±13.9a,c | 34.8±12.3b,c |
| HCC | 20 | 13.3±6.1 | 12.5±6.3 |
| HCC+N-TF | 20 | 14.4±8.4d | 23.4±9.1e |
| HCC+HCC-STF | 20 | 22.1±8.4e,f | 28.9±7.3e,g |
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aP<0.01，bP<0.05, vs 正常人；cP>0.05, vs 正常人+N-TF；dP>0.05, eP<0.01，vs HCC；fP<0.05, gP<0.01, vs HCC+N-TF。
2 结果
2.1 HCC-STF及N-TF对肝癌患者及正常人NK活性和LAK活性的影响 肝癌患者NK活性及LAK活性与正常人比明显低下(P<0.01)。 HCC-STF及N-TF均能显著地增加正常人NK及LAK活性(P<0.01及<0.05)，两组相比无明显差异(P>0.05)。HCC-STF能显著增加肝癌患者NK及LAK活性(P<0.01)，N-TF也能明显增加肝癌患者的LAK活性，但其增加幅度不如HCC-STF明显(P<0.05)，N-TF对肝癌患者NK活性无影响，见表1。
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2.2 HCC-STF及N-TF对肝癌患者及正常人T细胞亚群的影响 与正常人相比，肝癌患者外周血T3, T4细胞百分率明显降低，T8细胞升高，T4/T8比值下降(P<0.01)。加入HCC-STF后正常人T细胞亚群无明显变化，肝癌患者T3, T4细胞明显增加(P<0.01)，T8细胞下降(P<0.05)，T4/T8比值升高(P<0.01)。N-TF无此作用，见表2。
表2 HCC-STF及N-TF对T细胞亚群的影响 (x -±s)
| 分组 | n | T3 | T4 | T8 | T4/T8 |
| 正常人 | 30 | 74.6±4.4 | 47.8±3.2 | 25.4±2.6 | 1.88±0.12 |
| 正常人+N-TF | 10 | 76.2±5.6a | 46.9±4.7a | 27.2±3.4a | 1.86±0.14a |
| 正常人+HCC-STF | 30 | 75.8±5.1a | 46.5±4.2a | 32.6±2.4a | 1.79±0.13a |
| HCC | 20 | 60.6±4.3 | 31.4±4.4 | 34.3±3.7 | 0.90±0.15 |
| HCC+N-TF | 10 | 62.2±5.6b | 30.6±4.5b | 31.8±4.4b | 0.99±0.11b |
| HCC+HCC-STF | 20 | 67.7±4.6c | 40.5±3.9c | 31.7±4.3d | 1.28±0.14c |
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aP>0.05，vs 正常人；bP>0.05, cP<0.01, dP<0.05,vs HCC。
3 讨论
恶性肿瘤的免疫治疗已取得较大进展，其一是过继免疫治疗，即输给肿瘤宿主具有抗肿瘤活性的细胞毒淋巴细胞，如NK细胞、LAK细胞及肿瘤浸润淋巴细胞等。其二是多种细胞因子的应用，如肿瘤坏死因子、干扰素、白介素Ⅱ等。转移因子是细胞因子之一，现己用于多种肿瘤的辅助治疗，并取得了一定效果，但对其抗肿瘤机制仍不十分明确，初步认为有：①直接抑制或杀伤肿瘤细胞；②增加机体对肿瘤细胞的免疫功能；③诱生多种细胞因子。本文显示转移因子可明显增加NK及LAK活性，这可能是转移因子抗肿瘤浦弧N颐腔贡?较了HCC-STF与N-TF的作用，结果显示HCC-STF除具有N-TF的非特异性作用外，还具有特异性增加肝癌患者NK及LAK活性的作用。目前对转移因子增加NK及LAK活性的机制尚不清楚，本文推测可能是通过增加NK及LAK前体细胞变为NK及LAK细胞或增加NK及LAK细胞内淋巴因子的释放所致。根据分化抗原不同，通常可将人T细胞分为T4和T8两个主要亚群，T4和T8细胞亚群百分率及二者比值的变化反映了机体免疫调节功能的变化。本文结果显示HCC-STF能显著增加肝癌患者的T细胞数量和T4百分率，降低T8百分率，增加T4/T8比值，对正常人T细胞亚群无明显影响。N-TF无此作用。提示S-TF能调节异常的T细胞亚群，但对正常人T细胞亚群无影响。进一步证明S-TF能特异性地提高肿瘤患者的细胞免疫功能，提示S-TF对肿瘤的治疗效果明显优于N-TF。
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4 参考文献1 Chuang WL, Liu HW, Chang WY. Natural killer cell activity in patients with hepatocellular carcinoma
relative to early development and tumor invasion.Cancer, 1990;65(4)：926-930
2 彭贵勇，袁爱力，蔡景修. 肝癌患者IL-2活性、IL-2R表达及T细胞亚群变化及其影响因素. 四川医学，1993；(8)：464-466
3 彭贵勇，袁爱力，蔡景修. 肝癌特异性转移因子对IL-2活性及IL-2R表达的影响. 中华肿瘤杂志，1993；(6)：435-437
4 谢琪，吴厚生，范行义，et al. 3H-TdR, 51Cr, 125I-UdR释放试验测定NK活性的比较研究.
上海免疫学杂志，1993；(6)：351-352
5 彭贵勇，袁爱力. 转移因子治疗肿瘤现状及展望. 中国民政医学杂志，1993；(3)：111-114, 百拇医药(彭贵勇,袁爱力,蔡景修)