双PAP法显示胃肠道促胃液素释放肽细胞
项目负责人:赵荣华，男，1963-10-29生，上海市人，汉族。1986年第二军医大学军医系毕业，临床医学博士，普外科主治医师，讲师。发表论文及综述等8篇。[上海市凤阳路415号，电话(021) 3275997-386，传真(846) 21-275629](1994-09-27 收稿 1994-11-14 修回)
Study on the gastrin-releasing peptide cells in gastrointestinal tractby double PAP staining
Rong-Hua Zhao1, Yuan-He Wang1, Ting-Jun Ye2, Yong-Lian Chen2 and Han Gao1
, http://www.100md.com
1Department of General Surgery,
2Department of Pathology, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200003 China
AbstractAIM To study on the gastrin-releasing peptide (GRP) cells in the mucosas of gastric antrum and duodenum immunocytochemically, and evaluate the quality of double PAP method.
METHODS PAP and double PAP immunocytochemical stianing.
, 百拇医药
RESULTS Most GRP cells located in the middle and lower part of gastric/duodenal adenous tube, and the double PAP method improved the positive staining effect significantly.
CONCLUSION Double PAP immunocytochemical staining is a bettermethod to show the GRP cells in gastrointestinal tract.
Subject headings gastrointestinal hormones; immunocytochemistry; stomach; duodenum
, 百拇医药
Zhao RH, Wang YH, Ye TJ, Chen YL,Gao H.Study on the gastrin-releasing peptidecells in gastrointestinal tract by double PAP staining.Xin XiaohuabingxueZazhi,1995；3(2)：67-68
摘要
目的 研究胃窦及十二指肠粘膜中促胃液素释放肽(GRP)细胞的免疫细胞化学染色方法，并评价其效果。
方法 PAP法及双PAP法。
结果 GRP细胞主要位于胃腺及十二指肠腺管中下部。双PAP法可大大提高染色阳性强度。
, 百拇医药
结论 双PAP法是显示胃肠道GRP细胞的较好方法。
主题词 胃肠激素；免疫细胞化学；胃；十二指肠
赵荣华,王元和,叶挺军,陈咏莲,高瀚.双PAP法显示胃肠道促胃液素释放肽细胞.新消化病学杂志，1995；3(2)：67-68
促胃液素释放肽(GRP)是一个重要的胃肠激素[1]。由于GRP细胞在消化道中含量不多，分布较散，且GRP易遭肽酶分解破坏等原因，用常规PAP法行免疫细胞化学观察常难获得满意结果。我们采用双PAP法对胃窦及十二指肠粘膜中的GRP细胞行免疫细胞化学染色，结果较为理想。
1 材料和方法
1.1 切片制备 手术切除的新鲜胃十二指肠标本4例，分别切取胃窦部及十二指肠球部粘膜各1条(约1cm×3cm)。立即置于4℃，10%中性福尔马林中固定24h，常规脱水。渗腊后低温石蜡包埋。4μm连续切片10张，烤干后，脱腊、水化。分别行PAP(5张)和双PAP(5张)染色。
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1.2 PAP法 ①切片置0.3%H2O2 甲醇中处理30min，室温；②Tris液(pH=7.5)振洗5min(3次)；③1:6小牛血清处理切片30min，室温；④吸去血清，将稀释成1:50，1:100，1:200和1:400的兔抗人GRP抗体(Dako)分别滴加于4张切片，另1张切片加双蒸水作阴性对照，室温下反应18h；⑤同②；⑥加羊抗兔IgG抗体(1:40，上医病解教研室产品)，于37下反应1h；⑦同②；⑧加PAP复合物(1:100，上医病解教研室产品)，37、45min；⑨同②；⑩ DAB-H2O2显色5min；⑾水洗净；⑿苏木素染核；⒀脱水，透明，封片。
1.3 双PAP法 ①同PAP法①-⑨；②同PAP法中③；③同PAP法⑥-⒀。双PAP法中，0.3%H2O2甲醇封闭延长至40min;小牛血清封闭改在37下反应30min；二抗和PAP复合物反应时间分别缩短至30min和25min。
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2 结果
GRP细胞主要位于胃腺及十二指肠腺管中下部，分布呈灶性高密度区。细胞体积大，杯状，富含胞浆；核位于基部，着色较浅。图1和图2分别表示在-抗浓度为1:100时对胃粘膜GRP细胞行PAP和双PAP染色的效果。在不同-抗稀释度下PAP法和双PAP法对胃及十二指肠粘膜GRP细胞的染色评价见表1和表2。可见双PAP法大大提高了阳性染色程度，且所需-抗工作浓度较低，但伴有非特异染色轻度增加。
图1 胃粘膜，GRP阳性细胞染色模糊(PAP法，-抗工作浓度1:100，×20)
图2 胃粘膜，GRP阳性细胞染色清晰(双PAP法，-抗工作浓度1:100，×40)
表1 PAP和双PAP法对胃窦粘膜GRP细胞染色效果比较
, http://www.100md.com
表2 PAP和双PAP法对十二指肠粘膜GRP细胞染色效果比较
3 讨论
双PAP法是对PAP法的重要改进，通过两次连接桥抗体和PAP，在抗原抗体复合物上结合了比PAP法更多的酶分子，使之较PAP法、ABC法更加敏感。故双PAP法适用于常规石蜡切片中微量和抗原性减弱的抗原检测[2]。采用双PAP法，我们成功地显示了在组织中含量较少，且所含抗原(GRP)易遭肽酶破坏、抗原性减弱的GRP阳性细胞。但双PAP法除了存在步骤多、需时长等不足之外[2]，我们发现操作中很容易使非特异染色增加。通过延长过氧化氢封闭时间，在37条件下行小牛血清封闭、多重封闭以及缩短二抗和PAP复合物反应时间等措施，可使非特异染色降至最低限度。此外，严格的对照设置也有利于对阳性细胞的判断。 GRP的主要生理作用是促进促胃液素分泌[1]。对它在胃肠道发生病理生理改变过程中的作用，目前所知甚少。采用双PAP法显示胃肠道中GRP细胞，为研究在胃肠道病变时GRP细胞数量、分布、形态以及分泌状态等方面的改变提供了有效手段。
4 参考文献1 王志钧.胃肠激素.北京：科学出版社，1985：312-332
2 戴益民.免疫组织化学和杂交组织化学.上海：第二军医大学病理教研室，1992：112-143, 百拇医药
Study on the gastrin-releasing peptide cells in gastrointestinal tractby double PAP staining
Rong-Hua Zhao1, Yuan-He Wang1, Ting-Jun Ye2, Yong-Lian Chen2 and Han Gao1
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1Department of General Surgery,
2Department of Pathology, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200003 China
AbstractAIM To study on the gastrin-releasing peptide (GRP) cells in the mucosas of gastric antrum and duodenum immunocytochemically, and evaluate the quality of double PAP method.
METHODS PAP and double PAP immunocytochemical stianing.
, 百拇医药
RESULTS Most GRP cells located in the middle and lower part of gastric/duodenal adenous tube, and the double PAP method improved the positive staining effect significantly.
CONCLUSION Double PAP immunocytochemical staining is a bettermethod to show the GRP cells in gastrointestinal tract.
Subject headings gastrointestinal hormones; immunocytochemistry; stomach; duodenum
, 百拇医药
Zhao RH, Wang YH, Ye TJ, Chen YL,Gao H.Study on the gastrin-releasing peptidecells in gastrointestinal tract by double PAP staining.Xin XiaohuabingxueZazhi,1995；3(2)：67-68
摘要
目的 研究胃窦及十二指肠粘膜中促胃液素释放肽(GRP)细胞的免疫细胞化学染色方法，并评价其效果。
方法 PAP法及双PAP法。
结果 GRP细胞主要位于胃腺及十二指肠腺管中下部。双PAP法可大大提高染色阳性强度。
, 百拇医药
结论 双PAP法是显示胃肠道GRP细胞的较好方法。
主题词 胃肠激素；免疫细胞化学；胃；十二指肠
赵荣华,王元和,叶挺军,陈咏莲,高瀚.双PAP法显示胃肠道促胃液素释放肽细胞.新消化病学杂志，1995；3(2)：67-68
促胃液素释放肽(GRP)是一个重要的胃肠激素[1]。由于GRP细胞在消化道中含量不多，分布较散，且GRP易遭肽酶分解破坏等原因，用常规PAP法行免疫细胞化学观察常难获得满意结果。我们采用双PAP法对胃窦及十二指肠粘膜中的GRP细胞行免疫细胞化学染色，结果较为理想。
1 材料和方法
1.1 切片制备 手术切除的新鲜胃十二指肠标本4例，分别切取胃窦部及十二指肠球部粘膜各1条(约1cm×3cm)。立即置于4℃，10%中性福尔马林中固定24h，常规脱水。渗腊后低温石蜡包埋。4μm连续切片10张，烤干后，脱腊、水化。分别行PAP(5张)和双PAP(5张)染色。
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1.2 PAP法 ①切片置0.3%H2O2 甲醇中处理30min，室温；②Tris液(pH=7.5)振洗5min(3次)；③1:6小牛血清处理切片30min，室温；④吸去血清，将稀释成1:50，1:100，1:200和1:400的兔抗人GRP抗体(Dako)分别滴加于4张切片，另1张切片加双蒸水作阴性对照，室温下反应18h；⑤同②；⑥加羊抗兔IgG抗体(1:40，上医病解教研室产品)，于37下反应1h；⑦同②；⑧加PAP复合物(1:100，上医病解教研室产品)，37、45min；⑨同②；⑩ DAB-H2O2显色5min；⑾水洗净；⑿苏木素染核；⒀脱水，透明，封片。
1.3 双PAP法 ①同PAP法①-⑨；②同PAP法中③；③同PAP法⑥-⒀。双PAP法中，0.3%H2O2甲醇封闭延长至40min;小牛血清封闭改在37下反应30min；二抗和PAP复合物反应时间分别缩短至30min和25min。
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2 结果
GRP细胞主要位于胃腺及十二指肠腺管中下部，分布呈灶性高密度区。细胞体积大，杯状，富含胞浆；核位于基部，着色较浅。图1和图2分别表示在-抗浓度为1:100时对胃粘膜GRP细胞行PAP和双PAP染色的效果。在不同-抗稀释度下PAP法和双PAP法对胃及十二指肠粘膜GRP细胞的染色评价见表1和表2。可见双PAP法大大提高了阳性染色程度，且所需-抗工作浓度较低，但伴有非特异染色轻度增加。
图1 胃粘膜，GRP阳性细胞染色模糊(PAP法，-抗工作浓度1:100，×20)
图2 胃粘膜，GRP阳性细胞染色清晰(双PAP法，-抗工作浓度1:100，×40)
表1 PAP和双PAP法对胃窦粘膜GRP细胞染色效果比较
| 染色 | PAP | 双PAP | ||||||
| 1:50 | 1:100 | 1:200 | 1:400 | 1:50 | 1:100 | 1:200 | 1:400 | |
| 阳性染色 | ++ | + | + | + | +++ | +++ | ++ | + |
| 非特异染色 | ± | ± | ± | ± | + | + | + | ± |
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表2 PAP和双PAP法对十二指肠粘膜GRP细胞染色效果比较
| 染色 | PAP | 双PAP | ||||||
| 1:50 | 1:100 | 1:200 | 1:400 | 1:50 | 1:100 | 1:200 | 1:400 | |
| 阳性染色 | ++ | + | + | + | +++ | +++ | ++ | + |
| 非特异染色 | ± | ± | ± | ± | ++ | + | + | ± |
3 讨论
双PAP法是对PAP法的重要改进，通过两次连接桥抗体和PAP，在抗原抗体复合物上结合了比PAP法更多的酶分子，使之较PAP法、ABC法更加敏感。故双PAP法适用于常规石蜡切片中微量和抗原性减弱的抗原检测[2]。采用双PAP法，我们成功地显示了在组织中含量较少，且所含抗原(GRP)易遭肽酶破坏、抗原性减弱的GRP阳性细胞。但双PAP法除了存在步骤多、需时长等不足之外[2]，我们发现操作中很容易使非特异染色增加。通过延长过氧化氢封闭时间，在37条件下行小牛血清封闭、多重封闭以及缩短二抗和PAP复合物反应时间等措施，可使非特异染色降至最低限度。此外，严格的对照设置也有利于对阳性细胞的判断。 GRP的主要生理作用是促进促胃液素分泌[1]。对它在胃肠道发生病理生理改变过程中的作用，目前所知甚少。采用双PAP法显示胃肠道中GRP细胞，为研究在胃肠道病变时GRP细胞数量、分布、形态以及分泌状态等方面的改变提供了有效手段。
4 参考文献1 王志钧.胃肠激素.北京：科学出版社，1985：312-332
2 戴益民.免疫组织化学和杂交组织化学.上海：第二军医大学病理教研室，1992：112-143, 百拇医药