维拉帕米加化疗药物对人胃癌细胞系的影响
1上海第二医科大学附属新华医院 上海市 200092
2上海第二医科大学附属卫生学校微生物学教研室 200092
葛成华，男，1964-12-24生，江苏省盐城市人，汉族。1987年扬州大学医学院医疗系毕业。现为上海第二医科大学博士研究生。
主要从事胃癌的诊治研究。
项目负责人 葛成华, 200092, 上海市,上海市重庆南路227号，上海第二医科大学附属新华医院. Tel: 021-63286590-356收搞日期 1995-04-03
Cytotoxic effect of chemotherapeutic agents with verapamil on human gastric cancer cells
, http://www.100md.com
Cheng-Hua Ge, Xiu-Ling Wang, Ding-Guo Li, Wei-Ge Huang, He-Ding Gu,Zu-Ming Jiang, Qing-Fang Xu and Han-Ming Lu
Department of Gastroenterology, Xinhua Hospital, Shanghai Second Medical University, Shanghai 200092 China
Abstract
AIMS The effects of verapamil (VPM) with chemotherapeutic agents such as doxorubicin (DOX), 5-fluorouracil (5FU) and vincristine(VCR) on the proliferation of human gastric cancer cell lines in vitro were studied.
, 百拇医药
METHODS The inhibitory rates of the proliferation of antineoplastic agents in various concentrations combined with verapamil in various concertrations on human gastric cancer cell lines were evaluated by using MTT method.
RESULTS IC50 of DOX to MKN28 cells was reduced to 1/5.8 of the orginal concentration when a nontoxic dose of VPM was added. Similar effects were also found in MKN45 and MCG803 cells by the addition of VPM. Likewise, for all tumor cell lines, the VPM in a dose which, when used alone, had little effect on these cells would significantly increase the effect of 5FU and VCR to a degree of 2.4
, 百拇医药
to 7.5 folds.
CONCLUSIONS VPM can enhance antitumor activity of some chemotherapeutic agents like DOX, 5FU and VCR against human gastric cancer cell lines in vitro.
Keywords verapamil chemotherapy stomach neoplasms cells cycle
Ge CH, Wang XL, Li DG, Huang WG, Gu HD, Jiang ZM, Xu QF, Lu HM. Cytotoxic effect of chemotherapeutic agents with verapamil on human gastric cancer cells. Xin Xiaohuabingxue Zazhi, 1996；4(2)：66-68
, 百拇医药
摘要
目的 探讨钙拮抗剂维拉帕米(VPM)与3种化疗药物(阿霉素、5氟脲嘧啶及长春新碱)合用对体外人胃癌细胞系MGC803，MKN45和MKN28增殖的影响.
方法 采用MTT法测定不同浓度的VPM合用不同浓度的各化疗药物对胃癌细胞株的抑制率(IR).
结果 结合应用无毒剂量VPM(1μmol/L)可使阿霉素抑制MKN28细胞增殖的作用比单独应用时增强5.8倍. 对MKN45和MGC803细胞也有不同程度的增强作用. 无毒剂量的VPM也同样增强5-氟脲嘧啶及长春新碱对3种胃腺癌细胞株的细胞毒作用(SRs 2.4-7.5).结论 结果提示VPM能增强化疗药物阿霉素、5-氟脲嘧啶及长春新碱对体外人胃癌细胞的抗癌活性.
, http://www.100md.com
关键词 维拉帕米; 化学疗法; 胃肿瘤; 细胞周期
葛成华, 王秀玲, 李定国, 黄伟革, 顾鹤定, 蒋祖明, 徐芹芳, 陆汉明.维拉帕米加化疗药物对人胃癌细胞系的影响.
新消化病学杂志，1996；4(2)：66-68
近年来，钙拮抗剂(calcium antagonist, CA)与化疗药物联合应用的大量研究资料表明，CA可增加化疗药物对敏感肿瘤细胞的细胞毒作用和/或逆转多药耐药肿瘤细胞的耐药性[1]。我们在体外培养的人胃癌细胞中加入无毒剂量的维拉帕米(verapamil, VPM)，并与3种化疗药物合并应用，旨在观察联合应用的价值，为VPM作为一种化疗增强剂用于胃癌的临床治疗奠定理论基础。
1 材料和方法
, http://www.100md.com
1.1 细胞培养 人胃低分化粘液腺癌细胞株MGC803，由北京市肿瘤防治所提供，置于含10%-15% FBS的EME-Eagle(GIBCO)培养液中；人胃高分化管状腺癌细胞株MKN28及低分化腺癌MKN45，均为上海市消化疾病研究所惠赠，置于含10% FBS的RPMI 1640(Sigma)培养液中。
1.2 试剂和药物 四甲基偶氮唑盐[3-(4,5-dimethythia-zol-z-yl)-2,5-diphenytetrazolium bromide, MTT](Sigma)，按5mg/ml溶解于PBS中；VPM(德国Knoll药厂)，以乙醇溶解；阿霉素(doxorubicin, DOX，意大利爱宝大药厂)、5-氟脲嘧啶(5-fluorouracil, 5FU，上海海普药厂)、长春新碱(vincristine, VCR, 广州明兴药厂)均用细胞培养液稀释至所需浓度。
, 百拇医药
1.3 细胞增殖抑制率的测定 体外药物敏感试验采用Carmichael的MTT法。将无菌收集的对数生长期的肿瘤细胞分为4组，即空白对照组、VPM组、化疗药物组及VPM和化疗药物合用组，各药物浓度的增殖抑制率(inhibitory ratio, IR)计算式为：IR=(1-T/C)×100， 其中T为处理孔吸光度值(OD540)，C为对照孔OD540。根据各药物IR经Probit变换，求出半抑制浓度(inhibitory concentration 50%, IC50)。
2 结果
2.1 VPM加药物对胃癌细胞株增殖的影响 将不同浓度的VPM分别单独处理细胞，培养72h后，发现其抑制胃癌细胞增殖的作用随着其浓度升高而增强，VPM对3种不同肿瘤细胞株的IC50 分别为51±5, 42±3和56±3μmol/L。与对照组比较，各化疗药物单独处理胃癌细胞的所有加药组细胞数均有减少，并与浓度相关(表1)。
, http://www.100md.com
表1 药物与VPM合用时胃癌细胞株的IC50 *
*合用VPM后各细胞株的IC50显示在括号中，并用x-±s表示，aP<0.05， bP<0.01，与单用化疗药物组比较。
2.2 VPM联用化疗药物对胃癌细胞株的影响 在联合用药实验中，选用对胃癌细胞增殖基本无影响的VPM浓度(10μmol/L以下)。分别以0.012，0.04及0.12μg/ml 的DOX单独处理作为对照。对MKN28细胞株，以上浓度的DOX与1μmol/L的VPM合用时，细胞数目显著下降，3种DOX浓度使瘤细胞数分别从单独用药的101%，94%和67%下降至51%，58%和24%。当VPM为10μmol/L时，各DOX浓度的细胞增殖率均降至40%以下，特别是在低浓度(0.012μg/ml)的DOX中，单独和联合用药的细胞增殖率差别更大，对照单独和联合应用VPM时DOX的IC50 值，可见1和10μmol/L两种VPM浓度使DOX的IC50值有不同程度的下降，分别为单独应用DOX组的1/5.8和1/35倍。在MKN45细胞中，合用1μmol/L VPM时，DOX的IC50 值较单独应用时下降3.6倍，与单用DOX组比较，P<0.01(图1)。对MGC803细胞株，合用1μmol/L VPM时其DOX的IC50 值较单独应用DOX下降3.0倍，与单用DOX组比较，P<0.05(图2)。
, 百拇医药
同样可见，当VCR与1μmol/L VPM合用时，VCR对3种胃癌细胞株的IC50 值分别下降2.4-4.7倍；5FU与1μmol/L VPM合用时，对所有3种胃癌细胞株，5FU的IC50 值较单用时均有下降，与对照组比较，均有统计学差异(表1)。
图1 DOX与VPM合用后MKN45细胞的生存率 *与空白对照组比较无显著差别。
图2 VPM单用(□)，DOX单用(■)及VPM与DOX合用(▓)对MGC803细胞的作用 实验中DOX浓度为0.12μg/L。aP>0.05，bP<0.05与单用DOX组比较。
3 讨论
, 百拇医药
DOX、5FU及VCR均为胃癌化疗的临床用药，但胃癌对化疗药物低敏，而且在化疗过程中可发生多方面的严重反应，如脱毛、消化器损害、骨髓抑制及心脏毒性等，因而限制和影响了化疗的应用和效果。我们的实验发现，VPM在1μmol/L时即能增强DOX、5FU及VCR对胃癌细胞株MGC803、MKN28和MKN45的细胞毒作用。应该指出，体外浓度不可与体内浓度直接相比，但我们的实验结果，还是支持VPM的临床应用。以上事实说明有可能以低剂量的化疗药物合并应用VPM获得与单用高剂量的化疗药物的相同疗效，从而减轻对全身的毒副反应。
目前，已有许多报告证实，VPM、尼卡地平(nicardipine)、硫氮卓酮(diltiazem)等CA能增强VCR、DOX及顺铂(cisplatin)等在肿瘤中的积累，并能增强其活性，使IC50下降，延长荷瘤动物的生存时间[2，3]。VPM等增强DOX等化疗药物抗癌活性的机理还不甚清楚。Kaba等[4]认为，加用VPM所致VCR蓄积有以下3种可能：①增加VCR的内流；②抑制细胞内VCR的外流；③增加了细胞内微管与VCR的亲和力。VCR与细胞内靶器亲和力可能受VPM影响，因为小微管功能受VPM和钙调节蛋白所影响。
, 百拇医药
此外，有许多文献报道，某些CA如VPM、尼莫地平(nimodipine)及硝苯啶(nifedipine)等能克服肿瘤细胞的耐药性[5，6]，从而提示加用VPM亦具有克服胃癌细胞对化疗药物DOX，VCR及5FU等产生耐药性的潜在意义[7，8]。
4 参考文献
1 Leyand-Jones B, Dalton W, Fisher GA, et al. Reversal of multidrug resistance to cancer chemotherapy.
Cancer, 1993;72(Suppl):3484-3488
, http://www.100md.com
2 Woodcock BG, Abdel-Rahman MS, Wosch F, et al. Effect of D, L-verapamil, verapamil enantiomers and verapamil metabolites on
the binding of vincristine to alphal-acid glycoprotein. Eur J Cancer, 1993;29A(4):559-561
3 Mross K, Hamm K, Hossfeld DK. Effects of verapamil on the pharmacokinetics and metabolism of epirubicin.
Cancer Chemother Pharmacol, 1993;31(5):369-375
, 百拇医药
4 Merry S, Hamilton TG, Flanigan P, et al. Circuvention of pleiotropic drug resistance in subcutanceous tumours in vivo with
verapamil and clomipramine. Eur J Cancer, 1991;27(1):31-34
5 Perez V, Pierre A, Leonce S, et al. Effect of duration of exposure to S9788, cyclosporin A or verapamil on sensitivity of
multidrug resistant cells to vincristine or doxorubicin. Anticancer Res, 1993;13(4):985-990
, 百拇医药
6 Scheithauer W, Schenk T, Czejka M. Pharmacokinetic interaction between epirubicin and the multidrug resistance recerting
agent D-verapamil. Br J Cancer, 1993;68(1):8-9
7 Piontek M, Hengels KJ. Effect of calcium-modifying agents on the growth of human gastric carcinoms cells in vitro.
Anticancer Res, 1992;12(5):1559-1563
8 Wallner J, Depisch D. Gsue A, et al. MDR1 gene expression and its clinical relevance in primary gastric carcinoma.
Cancer, 1993;71(3):667-671, 百拇医药(葛成华1, 王秀玲1,李定国1, 黄伟革2, 顾鹤定1,蒋祖明1, 徐芹芳1, 陆汉明1)
2上海第二医科大学附属卫生学校微生物学教研室 200092
葛成华，男，1964-12-24生，江苏省盐城市人，汉族。1987年扬州大学医学院医疗系毕业。现为上海第二医科大学博士研究生。
主要从事胃癌的诊治研究。
项目负责人 葛成华, 200092, 上海市,上海市重庆南路227号，上海第二医科大学附属新华医院. Tel: 021-63286590-356收搞日期 1995-04-03
Cytotoxic effect of chemotherapeutic agents with verapamil on human gastric cancer cells
, http://www.100md.com
Cheng-Hua Ge, Xiu-Ling Wang, Ding-Guo Li, Wei-Ge Huang, He-Ding Gu,Zu-Ming Jiang, Qing-Fang Xu and Han-Ming Lu
Department of Gastroenterology, Xinhua Hospital, Shanghai Second Medical University, Shanghai 200092 China
Abstract
AIMS The effects of verapamil (VPM) with chemotherapeutic agents such as doxorubicin (DOX), 5-fluorouracil (5FU) and vincristine(VCR) on the proliferation of human gastric cancer cell lines in vitro were studied.
, 百拇医药
METHODS The inhibitory rates of the proliferation of antineoplastic agents in various concentrations combined with verapamil in various concertrations on human gastric cancer cell lines were evaluated by using MTT method.
RESULTS IC50 of DOX to MKN28 cells was reduced to 1/5.8 of the orginal concentration when a nontoxic dose of VPM was added. Similar effects were also found in MKN45 and MCG803 cells by the addition of VPM. Likewise, for all tumor cell lines, the VPM in a dose which, when used alone, had little effect on these cells would significantly increase the effect of 5FU and VCR to a degree of 2.4
, 百拇医药
to 7.5 folds.
CONCLUSIONS VPM can enhance antitumor activity of some chemotherapeutic agents like DOX, 5FU and VCR against human gastric cancer cell lines in vitro.
Keywords verapamil chemotherapy stomach neoplasms cells cycle
Ge CH, Wang XL, Li DG, Huang WG, Gu HD, Jiang ZM, Xu QF, Lu HM. Cytotoxic effect of chemotherapeutic agents with verapamil on human gastric cancer cells. Xin Xiaohuabingxue Zazhi, 1996；4(2)：66-68
, 百拇医药
摘要
目的 探讨钙拮抗剂维拉帕米(VPM)与3种化疗药物(阿霉素、5氟脲嘧啶及长春新碱)合用对体外人胃癌细胞系MGC803，MKN45和MKN28增殖的影响.
方法 采用MTT法测定不同浓度的VPM合用不同浓度的各化疗药物对胃癌细胞株的抑制率(IR).
结果 结合应用无毒剂量VPM(1μmol/L)可使阿霉素抑制MKN28细胞增殖的作用比单独应用时增强5.8倍. 对MKN45和MGC803细胞也有不同程度的增强作用. 无毒剂量的VPM也同样增强5-氟脲嘧啶及长春新碱对3种胃腺癌细胞株的细胞毒作用(SRs 2.4-7.5).结论 结果提示VPM能增强化疗药物阿霉素、5-氟脲嘧啶及长春新碱对体外人胃癌细胞的抗癌活性.
, http://www.100md.com
关键词 维拉帕米; 化学疗法; 胃肿瘤; 细胞周期
葛成华, 王秀玲, 李定国, 黄伟革, 顾鹤定, 蒋祖明, 徐芹芳, 陆汉明.维拉帕米加化疗药物对人胃癌细胞系的影响.
新消化病学杂志，1996；4(2)：66-68
近年来，钙拮抗剂(calcium antagonist, CA)与化疗药物联合应用的大量研究资料表明，CA可增加化疗药物对敏感肿瘤细胞的细胞毒作用和/或逆转多药耐药肿瘤细胞的耐药性[1]。我们在体外培养的人胃癌细胞中加入无毒剂量的维拉帕米(verapamil, VPM)，并与3种化疗药物合并应用，旨在观察联合应用的价值，为VPM作为一种化疗增强剂用于胃癌的临床治疗奠定理论基础。
1 材料和方法
, http://www.100md.com
1.1 细胞培养 人胃低分化粘液腺癌细胞株MGC803，由北京市肿瘤防治所提供，置于含10%-15% FBS的EME-Eagle(GIBCO)培养液中；人胃高分化管状腺癌细胞株MKN28及低分化腺癌MKN45，均为上海市消化疾病研究所惠赠，置于含10% FBS的RPMI 1640(Sigma)培养液中。
1.2 试剂和药物 四甲基偶氮唑盐[3-(4,5-dimethythia-zol-z-yl)-2,5-diphenytetrazolium bromide, MTT](Sigma)，按5mg/ml溶解于PBS中；VPM(德国Knoll药厂)，以乙醇溶解；阿霉素(doxorubicin, DOX，意大利爱宝大药厂)、5-氟脲嘧啶(5-fluorouracil, 5FU，上海海普药厂)、长春新碱(vincristine, VCR, 广州明兴药厂)均用细胞培养液稀释至所需浓度。
, 百拇医药
1.3 细胞增殖抑制率的测定 体外药物敏感试验采用Carmichael的MTT法。将无菌收集的对数生长期的肿瘤细胞分为4组，即空白对照组、VPM组、化疗药物组及VPM和化疗药物合用组，各药物浓度的增殖抑制率(inhibitory ratio, IR)计算式为：IR=(1-T/C)×100， 其中T为处理孔吸光度值(OD540)，C为对照孔OD540。根据各药物IR经Probit变换，求出半抑制浓度(inhibitory concentration 50%, IC50)。
2 结果
2.1 VPM加药物对胃癌细胞株增殖的影响 将不同浓度的VPM分别单独处理细胞，培养72h后，发现其抑制胃癌细胞增殖的作用随着其浓度升高而增强，VPM对3种不同肿瘤细胞株的IC50 分别为51±5, 42±3和56±3μmol/L。与对照组比较，各化疗药物单独处理胃癌细胞的所有加药组细胞数均有减少，并与浓度相关(表1)。
, http://www.100md.com
表1 药物与VPM合用时胃癌细胞株的IC50 *
| 化疗药物 | 各细胞株IC50 | ||
| MKN28 | MGC803 | MKN45 | |
| Doxorubicin (μg/L) | 269 | 179 | 172 |
| (91±9)a | (30±7)a | (48±6)b | |
| Vincristine (μmol/L) | 23.1 | 36.8 | 33.3 |
| (9.7±2.1)a | (9.1±0.9)a | (7.1±0.9)a | |
| 5-Fluorouracil , http://www.100md.com (mg/L) | 8.87 | 5.91 | 6.19 |
| (2.49±0.11)a | (0.79±0.39)a | (1.31±0.11)a |
*合用VPM后各细胞株的IC50显示在括号中，并用x-±s表示，aP<0.05， bP<0.01，与单用化疗药物组比较。
2.2 VPM联用化疗药物对胃癌细胞株的影响 在联合用药实验中，选用对胃癌细胞增殖基本无影响的VPM浓度(10μmol/L以下)。分别以0.012，0.04及0.12μg/ml 的DOX单独处理作为对照。对MKN28细胞株，以上浓度的DOX与1μmol/L的VPM合用时，细胞数目显著下降，3种DOX浓度使瘤细胞数分别从单独用药的101%，94%和67%下降至51%，58%和24%。当VPM为10μmol/L时，各DOX浓度的细胞增殖率均降至40%以下，特别是在低浓度(0.012μg/ml)的DOX中，单独和联合用药的细胞增殖率差别更大，对照单独和联合应用VPM时DOX的IC50 值，可见1和10μmol/L两种VPM浓度使DOX的IC50值有不同程度的下降，分别为单独应用DOX组的1/5.8和1/35倍。在MKN45细胞中，合用1μmol/L VPM时，DOX的IC50 值较单独应用时下降3.6倍，与单用DOX组比较，P<0.01(图1)。对MGC803细胞株，合用1μmol/L VPM时其DOX的IC50 值较单独应用DOX下降3.0倍，与单用DOX组比较，P<0.05(图2)。
, 百拇医药
同样可见，当VCR与1μmol/L VPM合用时，VCR对3种胃癌细胞株的IC50 值分别下降2.4-4.7倍；5FU与1μmol/L VPM合用时，对所有3种胃癌细胞株，5FU的IC50 值较单用时均有下降，与对照组比较，均有统计学差异(表1)。
图1 DOX与VPM合用后MKN45细胞的生存率 *与空白对照组比较无显著差别。
图2 VPM单用(□)，DOX单用(■)及VPM与DOX合用(▓)对MGC803细胞的作用 实验中DOX浓度为0.12μg/L。aP>0.05，bP<0.05与单用DOX组比较。
3 讨论
, 百拇医药
DOX、5FU及VCR均为胃癌化疗的临床用药，但胃癌对化疗药物低敏，而且在化疗过程中可发生多方面的严重反应，如脱毛、消化器损害、骨髓抑制及心脏毒性等，因而限制和影响了化疗的应用和效果。我们的实验发现，VPM在1μmol/L时即能增强DOX、5FU及VCR对胃癌细胞株MGC803、MKN28和MKN45的细胞毒作用。应该指出，体外浓度不可与体内浓度直接相比，但我们的实验结果，还是支持VPM的临床应用。以上事实说明有可能以低剂量的化疗药物合并应用VPM获得与单用高剂量的化疗药物的相同疗效，从而减轻对全身的毒副反应。
目前，已有许多报告证实，VPM、尼卡地平(nicardipine)、硫氮卓酮(diltiazem)等CA能增强VCR、DOX及顺铂(cisplatin)等在肿瘤中的积累，并能增强其活性，使IC50下降，延长荷瘤动物的生存时间[2，3]。VPM等增强DOX等化疗药物抗癌活性的机理还不甚清楚。Kaba等[4]认为，加用VPM所致VCR蓄积有以下3种可能：①增加VCR的内流；②抑制细胞内VCR的外流；③增加了细胞内微管与VCR的亲和力。VCR与细胞内靶器亲和力可能受VPM影响，因为小微管功能受VPM和钙调节蛋白所影响。
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此外，有许多文献报道，某些CA如VPM、尼莫地平(nimodipine)及硝苯啶(nifedipine)等能克服肿瘤细胞的耐药性[5，6]，从而提示加用VPM亦具有克服胃癌细胞对化疗药物DOX，VCR及5FU等产生耐药性的潜在意义[7，8]。
4 参考文献
1 Leyand-Jones B, Dalton W, Fisher GA, et al. Reversal of multidrug resistance to cancer chemotherapy.
Cancer, 1993;72(Suppl):3484-3488
, http://www.100md.com
2 Woodcock BG, Abdel-Rahman MS, Wosch F, et al. Effect of D, L-verapamil, verapamil enantiomers and verapamil metabolites on
the binding of vincristine to alphal-acid glycoprotein. Eur J Cancer, 1993;29A(4):559-561
3 Mross K, Hamm K, Hossfeld DK. Effects of verapamil on the pharmacokinetics and metabolism of epirubicin.
Cancer Chemother Pharmacol, 1993;31(5):369-375
, 百拇医药
4 Merry S, Hamilton TG, Flanigan P, et al. Circuvention of pleiotropic drug resistance in subcutanceous tumours in vivo with
verapamil and clomipramine. Eur J Cancer, 1991;27(1):31-34
5 Perez V, Pierre A, Leonce S, et al. Effect of duration of exposure to S9788, cyclosporin A or verapamil on sensitivity of
multidrug resistant cells to vincristine or doxorubicin. Anticancer Res, 1993;13(4):985-990
, 百拇医药
6 Scheithauer W, Schenk T, Czejka M. Pharmacokinetic interaction between epirubicin and the multidrug resistance recerting
agent D-verapamil. Br J Cancer, 1993;68(1):8-9
7 Piontek M, Hengels KJ. Effect of calcium-modifying agents on the growth of human gastric carcinoms cells in vitro.
Anticancer Res, 1992;12(5):1559-1563
8 Wallner J, Depisch D. Gsue A, et al. MDR1 gene expression and its clinical relevance in primary gastric carcinoma.
Cancer, 1993;71(3):667-671, 百拇医药(葛成华1, 王秀玲1,李定国1, 黄伟革2, 顾鹤定1,蒋祖明1, 徐芹芳1, 陆汉明1)