人肝细胞癌中转移抑制基因nm23编码蛋白的表达
第二军医大学 1病理解剖学教研室 2长海医院肝胆外科研究所 上海市 200433
陈晓东，男，1966-06-26生，辽宁省新民县人，汉族.1989及1995年分别于第二军医大学军医系本科及病理学研究生毕业，医学硕士,助教，研究方向：人肝细胞癌发生及转移的机理
项目负责人 陈晓东,200433 上海市翔殷路800号,上海市,第二军医大学
Tel: 021- 25070279收搞日期 1995-12-28
Expression of metastasis suppressor gene nm23 protein in human hepatocellular carcinoma
, http://www.100md.com
Xiao-Dong Chen1, Yi-Min Dai1, Jia-Mei Yang2, Jian-Zhong Bao1, Wen-Ming Cong2, Jian-Jun Wang1, Can-Rong Ni1 and Ni Jin1
1Department of Pathology, 2Institute of Hepatobiliary Surgery, Changhai Hospital, Second Military Medical University,Shanghai 200433 China
Abstract
, 百拇医药
AIMS To investigate the relationship between the expression of nm23 protein and metastatic potential in human hepatocellular carcinoma.
METHODS The nm23 proteins were detected in 24 patients with hepatocellular carcinoma by immunogold silver staining method. The specific antibody was rabbit antihuman NDPK (Chain A,B) antibody.
RESULTS NDPK level does not statistically correlate with both metastatic potential and some other clinicopathologic factors such as tumor size, number and the background liver diseases(P>0.05).
, 百拇医药
CONCLUSIONS The combined products expression of nm23 gene (NDPK-A,B) does not relate to the metastatic potential in human hepatocellular carcinoma.
Subject headings liver neoplasms/genetics carcinoma, hepatocellular/genetics transcription factors/analysis
Chen XD, Dai YM, Yang JM, Bao JZ,Cong WM, Wang JJ , Ni CR and Jin N.Expression of metastasis suppressor gene nm23 protein in human hepatocellular carcinoma.Chin J New Gastroenterol,19964(8):438-439
, 百拇医药
摘要
目的 探讨nm23基因编码蛋白表达与肝细胞癌转移的相关性.
方法 采用免疫胶体金银法，用兔抗人核苷二磷酸激酶(NDPK)混合型抗体检测24例人肝细胞癌.
结果 NDPK阳性表达与肝细胞癌转移倾向无关(P>0.05)；NDPK阳性表达与某些临床病理指标，如肿瘤数目、肿瘤大小、肝病背景等，也无关(P>0.05).
结论 NDPK混合产物表达不能很好反映它与转移的相关性.
主题词 肝肿瘤/遗传学;癌，肝细胞/遗传学;转录因子/分析
, 百拇医药
陈晓东,戴益民,杨甲梅,宝建中,丛文铭,王建军,倪灿荣,金妮.人肝细胞癌中转移抑制基因nm23编码蛋白的表达.
新消化病学杂志，1996；4(8)：438-439
1988年美国Steeg等[1]应用差别筛选技术(differential screening of cDNA libraries)首次从鼠黑色素瘤k-1735细胞株中分离得到了能抑制癌细胞转移的cDNA克隆Pnm23.人基因组中存在着2个nm23基因，即nm23-H1和nm23-H2.它们均编码17000的蛋白质，且分别为核苷二磷酸激酶(nucleoside diphosphate kinase, NDPK)的A，B亚基.多数报道支持nm23作为转移抑制基因的最佳代表，但也有相反观点[2].国内的研究刚起步，作者对nm23基因作初步研究如下.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 人肝细胞癌标本24例，均为新鲜手术标本，并有病理检查报告证实.凡符合分组标准两项或具备标准①，②之一者，归类于转移高危组.分组标准：①肝门淋巴结有转移；②门静脉有癌栓；③肝内肿瘤数目≥2个；④癌周多个卫星结节形成.依此分组标准，转移高危组7例，转移低危组17例.
1.2 试剂 主要试剂为兔抗人核苷二磷酸激酶混合型抗体，能特异地识别nm23/NDPK(A，B亚基)蛋白，购自Oncor公司.葡萄球菌A蛋白(SPA)为Sigma公司产品.氯化金酸等为上海试剂一厂产品.
1.3 免疫胶体金银法[3] 常规石蜡切片，切片厚约5μm(载玻片经白胶处理)脱蜡至水.用0.05mol/L TBS洗(pH 7.4)；微波抗原修复；1%卵蛋白室温下作用10min后，滴加兔抗人NDPK混合型抗体，抗体工作浓度0.125μg/ml，室温下2h；TBS洗；1%卵蛋白作用20min；1：20的金标记葡萄球菌A蛋白复合物(10nm)，室温下1h；4%多聚甲醛固定；双蒸水洗；1%明胶洗;，银显影液避光显影；双蒸水洗；1%戊二醛固定；温水(约40-50℃)洗；核固红衬染；吹干、封片.
, http://www.100md.com
1.4 对照组设置 分别用TBS和正常兔血清取代兔抗人NDPK混合型抗体，结果为阴性；用已知表达NDPK的乳腺组织做阳性对照.
1.5 结果判定分析 阳性物质呈黑色或黑褐色颗粒分布于胞浆内，胞核经核固红衬染为淡红色.染色强度与癌周正常组织相似为阴性(-)；比癌周正常组织稍强为弱阳性(+)；明显强于癌周正常组织者为强阳性(++).数据的统计学处理用Ridit方法，以P<0.05为相关显著.
2 结果
人肝细胞癌24例染色结果及统计学处理结果表1，2.阴性染色、强阳性染色图1，2.
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表1 免疫组化染色结果与转移倾向相关性
P>0.05，转移低危组与高危组间比较.
表2 IGSS结果与某些临床病理指标的相关性
, 百拇医药
P>0.05，与单发性、≤5、慢性肝炎、≤100比较.
图1 癌结节呈阴性染色×66
图2 癌结节呈强阳性染色，阳性颗粒位于胞浆内×66
3 讨论
自nm23基因公开发表后，国外学者从多个角度对它进行了深入的研究.但是，nm23基因是否就是转移抑制基因，能否将其编码蛋白作为临床检测的指标以指导治疗方案的选择和对预后的判断等，似乎尚无定论.作者初步研究结果表明，在人肝细胞癌中，nm23基因编码的蛋白核苷二磷酸激酶(NDPK)的表达与肿瘤转移倾向无关.当今多数学者认为：nm23基因包括nm23-H1和nm23-H2两个基因，它们编码的蛋白质分别为NDPK-A和NDPK-B亚基.nm23-H1被认为与肿瘤发生转移关系密切，而nm23-H2与转移无关[2，4，5].所以，从理论上讲，NDPK-A的表达与转移倾向应呈负相关性.但由于本文所采用的特异性抗体为混合型，即抗NDPK-A，B亚基抗体，因此结果显示nm23基因编码蛋白(NDPK-A，B)的表达与转移倾向无关可能是由于混合型抗体中抗NDPK-B抗体部分掩盖了NDPK-A与转移倾向的相关性；本文作者亦对文中24例标本进行了原位杂交的检测研究(待发表资料)，结果表明用地高辛标记的nm23-H1反义cRNA探针检测nm23-H1基因表达与转移倾向呈负相关性(P<0.01).提示：如果应用抗nm23-H1编码蛋白的NDPK-A抗体进行免疫组织化学研究，可能会获得更理想的结果，从而使抗NDPK-A抗体检测结果作为临床判断预后、指导治疗的指标之一.用抗NDPK-A抗体的进一步研究工作尚待进行.
, http://www.100md.com
另外，本文中抗NDPK(A，B)抗体阳性染色主要为胞浆型，NDPK(A，B)表达与肿瘤数目、大小、肝病背景、血清甲胎蛋白浓度等均无相关性，与现在多数报道相符，此处不再赘述.
4 参考文献
1 Steeg PS, Bevilacqua G, Kopper L, et al. Evidence for a novel gene associated with low tumor metastatic potential.
J Natl Cancer Inst, 1988;80(3):200-204
2 Tokunaga Y, Urano T, Eurukawa K, et al. Reduced expression of nm23-H1, but not of nm23-H2, is concordant with the frequency
, 百拇医药
of lymph-node metastasis of human breast cancer. Int J Cancer, 1993;55(1):66-71
3 倪灿荣.免疫组织化学实验新技术及应用.北京：北京科学技术出版社，1993：144-163
4 黎怀星，傅继良.nm23基因与肿瘤转移.国外医学分子生物学分册，1994；16(2)：73-78
5 Caligo MA, Grammatico P, Cipollini G, et al. A low nm23-H1 gene expression identifying high malignancy human melanomas.
Melanoma Res, 1994;4(3):179-184, 百拇医药(陈晓东1 戴益民1 杨甲梅2 宝建中1 丛文铭2 王建军1 倪灿荣1 金妮1)
陈晓东，男，1966-06-26生，辽宁省新民县人，汉族.1989及1995年分别于第二军医大学军医系本科及病理学研究生毕业，医学硕士,助教，研究方向：人肝细胞癌发生及转移的机理
项目负责人 陈晓东,200433 上海市翔殷路800号,上海市,第二军医大学
Tel: 021- 25070279收搞日期 1995-12-28
Expression of metastasis suppressor gene nm23 protein in human hepatocellular carcinoma
, http://www.100md.com
Xiao-Dong Chen1, Yi-Min Dai1, Jia-Mei Yang2, Jian-Zhong Bao1, Wen-Ming Cong2, Jian-Jun Wang1, Can-Rong Ni1 and Ni Jin1
1Department of Pathology, 2Institute of Hepatobiliary Surgery, Changhai Hospital, Second Military Medical University,Shanghai 200433 China
Abstract
, 百拇医药
AIMS To investigate the relationship between the expression of nm23 protein and metastatic potential in human hepatocellular carcinoma.
METHODS The nm23 proteins were detected in 24 patients with hepatocellular carcinoma by immunogold silver staining method. The specific antibody was rabbit antihuman NDPK (Chain A,B) antibody.
RESULTS NDPK level does not statistically correlate with both metastatic potential and some other clinicopathologic factors such as tumor size, number and the background liver diseases(P>0.05).
, 百拇医药
CONCLUSIONS The combined products expression of nm23 gene (NDPK-A,B) does not relate to the metastatic potential in human hepatocellular carcinoma.
Subject headings liver neoplasms/genetics carcinoma, hepatocellular/genetics transcription factors/analysis
Chen XD, Dai YM, Yang JM, Bao JZ,Cong WM, Wang JJ , Ni CR and Jin N.Expression of metastasis suppressor gene nm23 protein in human hepatocellular carcinoma.Chin J New Gastroenterol,19964(8):438-439
, 百拇医药
摘要
目的 探讨nm23基因编码蛋白表达与肝细胞癌转移的相关性.
方法 采用免疫胶体金银法，用兔抗人核苷二磷酸激酶(NDPK)混合型抗体检测24例人肝细胞癌.
结果 NDPK阳性表达与肝细胞癌转移倾向无关(P>0.05)；NDPK阳性表达与某些临床病理指标，如肿瘤数目、肿瘤大小、肝病背景等，也无关(P>0.05).
结论 NDPK混合产物表达不能很好反映它与转移的相关性.
主题词 肝肿瘤/遗传学;癌，肝细胞/遗传学;转录因子/分析
, 百拇医药
陈晓东,戴益民,杨甲梅,宝建中,丛文铭,王建军,倪灿荣,金妮.人肝细胞癌中转移抑制基因nm23编码蛋白的表达.
新消化病学杂志，1996；4(8)：438-439
1988年美国Steeg等[1]应用差别筛选技术(differential screening of cDNA libraries)首次从鼠黑色素瘤k-1735细胞株中分离得到了能抑制癌细胞转移的cDNA克隆Pnm23.人基因组中存在着2个nm23基因，即nm23-H1和nm23-H2.它们均编码17000的蛋白质，且分别为核苷二磷酸激酶(nucleoside diphosphate kinase, NDPK)的A，B亚基.多数报道支持nm23作为转移抑制基因的最佳代表，但也有相反观点[2].国内的研究刚起步，作者对nm23基因作初步研究如下.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 人肝细胞癌标本24例，均为新鲜手术标本，并有病理检查报告证实.凡符合分组标准两项或具备标准①，②之一者，归类于转移高危组.分组标准：①肝门淋巴结有转移；②门静脉有癌栓；③肝内肿瘤数目≥2个；④癌周多个卫星结节形成.依此分组标准，转移高危组7例，转移低危组17例.
1.2 试剂 主要试剂为兔抗人核苷二磷酸激酶混合型抗体，能特异地识别nm23/NDPK(A，B亚基)蛋白，购自Oncor公司.葡萄球菌A蛋白(SPA)为Sigma公司产品.氯化金酸等为上海试剂一厂产品.
1.3 免疫胶体金银法[3] 常规石蜡切片，切片厚约5μm(载玻片经白胶处理)脱蜡至水.用0.05mol/L TBS洗(pH 7.4)；微波抗原修复；1%卵蛋白室温下作用10min后，滴加兔抗人NDPK混合型抗体，抗体工作浓度0.125μg/ml，室温下2h；TBS洗；1%卵蛋白作用20min；1：20的金标记葡萄球菌A蛋白复合物(10nm)，室温下1h；4%多聚甲醛固定；双蒸水洗；1%明胶洗;，银显影液避光显影；双蒸水洗；1%戊二醛固定；温水(约40-50℃)洗；核固红衬染；吹干、封片.
, http://www.100md.com
1.4 对照组设置 分别用TBS和正常兔血清取代兔抗人NDPK混合型抗体，结果为阴性；用已知表达NDPK的乳腺组织做阳性对照.
1.5 结果判定分析 阳性物质呈黑色或黑褐色颗粒分布于胞浆内，胞核经核固红衬染为淡红色.染色强度与癌周正常组织相似为阴性(-)；比癌周正常组织稍强为弱阳性(+)；明显强于癌周正常组织者为强阳性(++).数据的统计学处理用Ridit方法，以P<0.05为相关显著.
2 结果
人肝细胞癌24例染色结果及统计学处理结果表1，2.阴性染色、强阳性染色图1，2.
, http://www.100md.com
表1 免疫组化染色结果与转移倾向相关性
| 肿瘤转移倾向 | 染 色 结 果 (例) | ||
| - | + | ++ | |
| 转移低危组 | 4 | 5 | 8 |
| 转移高危组 | 3 | 2 | 2 |
P>0.05，转移低危组与高危组间比较.
表2 IGSS结果与某些临床病理指标的相关性
| 临 床 资 料 | 染 色 结 果 (例) | ||
| - | + | ++ | |
| 肿瘤数目 | |||
| 单发性 | 6 | 4 | 10 |
| 多发性 | 3 | 1 | 0 |
| 肿瘤大小(cm) | |||
| ≤5 | 2 | 3 | 4 |
| >5 | 5 | 4 | 6 |
| 肝病背景 | |||
| 慢性肝炎 | 2 | 5 | 4 |
| 肝 硬 变 | 4 | 6 | 9 |
| 血清AFP(μg/L) | |||
| ≤100 | 3 | 3 | 7 |
| >100 | 4 | 4 | 3 |
, 百拇医药
P>0.05，与单发性、≤5、慢性肝炎、≤100比较.
图1 癌结节呈阴性染色×66
图2 癌结节呈强阳性染色，阳性颗粒位于胞浆内×66
3 讨论
自nm23基因公开发表后，国外学者从多个角度对它进行了深入的研究.但是，nm23基因是否就是转移抑制基因，能否将其编码蛋白作为临床检测的指标以指导治疗方案的选择和对预后的判断等，似乎尚无定论.作者初步研究结果表明，在人肝细胞癌中，nm23基因编码的蛋白核苷二磷酸激酶(NDPK)的表达与肿瘤转移倾向无关.当今多数学者认为：nm23基因包括nm23-H1和nm23-H2两个基因，它们编码的蛋白质分别为NDPK-A和NDPK-B亚基.nm23-H1被认为与肿瘤发生转移关系密切，而nm23-H2与转移无关[2，4，5].所以，从理论上讲，NDPK-A的表达与转移倾向应呈负相关性.但由于本文所采用的特异性抗体为混合型，即抗NDPK-A，B亚基抗体，因此结果显示nm23基因编码蛋白(NDPK-A，B)的表达与转移倾向无关可能是由于混合型抗体中抗NDPK-B抗体部分掩盖了NDPK-A与转移倾向的相关性；本文作者亦对文中24例标本进行了原位杂交的检测研究(待发表资料)，结果表明用地高辛标记的nm23-H1反义cRNA探针检测nm23-H1基因表达与转移倾向呈负相关性(P<0.01).提示：如果应用抗nm23-H1编码蛋白的NDPK-A抗体进行免疫组织化学研究，可能会获得更理想的结果，从而使抗NDPK-A抗体检测结果作为临床判断预后、指导治疗的指标之一.用抗NDPK-A抗体的进一步研究工作尚待进行.
, http://www.100md.com
另外，本文中抗NDPK(A，B)抗体阳性染色主要为胞浆型，NDPK(A，B)表达与肿瘤数目、大小、肝病背景、血清甲胎蛋白浓度等均无相关性，与现在多数报道相符，此处不再赘述.
4 参考文献
1 Steeg PS, Bevilacqua G, Kopper L, et al. Evidence for a novel gene associated with low tumor metastatic potential.
J Natl Cancer Inst, 1988;80(3):200-204
2 Tokunaga Y, Urano T, Eurukawa K, et al. Reduced expression of nm23-H1, but not of nm23-H2, is concordant with the frequency
, 百拇医药
of lymph-node metastasis of human breast cancer. Int J Cancer, 1993;55(1):66-71
3 倪灿荣.免疫组织化学实验新技术及应用.北京：北京科学技术出版社，1993：144-163
4 黎怀星，傅继良.nm23基因与肿瘤转移.国外医学分子生物学分册，1994；16(2)：73-78
5 Caligo MA, Grammatico P, Cipollini G, et al. A low nm23-H1 gene expression identifying high malignancy human melanomas.
Melanoma Res, 1994;4(3):179-184, 百拇医药(陈晓东1 戴益民1 杨甲梅2 宝建中1 丛文铭2 王建军1 倪灿荣1 金妮1)