培养胎肝细胞上清对暴发性肝衰竭小鼠存活率的影响
第三军医大学西南医院全军传染病中心 四川省重庆市 630038
项目负责人:王英杰
收稿日期:1995-11-25 接受日期:1995-12-25
Effects of supernatant from fetal hepatocyte culture on the mice surv ival fulminant hepatic failure
Ying-Jie Wang, Xiao-Hong Wang, Yu-Ming Wang, Meng-Dong Li and Jian Ding
Centre of Infectious Diseases, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 630038, Sichuan Province, China
, 百拇医药
Abstract
AIM To study the mechanism of human fetal hepatocyte (hFH) for the treatment of severe liver diseases and evaluate the possibility of supernatant from fetal hepatocyte culture(FHCS) to take the place of hFH.
METHODS The protective effects of FHCS on the mice fulminant hepatic failure (FHF) model induced by D_galactosamine (D_galn) and lipopolysacharide (LPS) were observed.
, 百拇医药
RESULTS After the treatment of FHCS, the survival of FHF mice was prolonged (P<0.01), and the serum aminotransferase wa s decreased (P<0.05). The morphological obervation showed that the hepatic necrosis was slight and the liver regeneration was clear.
CONCLUSION FHCS has a marked protective and therapeutic effects, which could open a new way for the hFH therapy.
, http://www.100md.com
Subject headings Liver extracts/therapeutic use;Liver failure, acute/therapy;Cells, cultured;Liver/embryology
Wang YJ, Wang XH, Wang YM, Li MD,Ding J.Effects of supernatant from fetalhepatocyte culture on the mice survival fulminant hepatic failure.XinXiaohuabingxue Zazhi,1997；5(2)：77-78
摘要
目的 探讨胎肝细胞悬液治疗严重肝病的机理以及使用培养胎肝细胞分泌上清(FHCS)替代的可能性.
, http://www.100md.com
方法 采用D_氨基半乳糖(D_galn)/内毒素(LPS)诱发小鼠暴发性肝衰竭(FHF)，观察FHCS的保护作用.
结果 FHCS能显著提高FHF小鼠的存活率(P<0.01)，降低血清转氨酶(P<0.05)，减轻肝细胞坏死程度，并促进肝细胞再生.
结论 FHCS对FHF有较好的保护与治疗作用，可望为已被迫放弃的胎肝细胞悬液输注疗法开辟新的途径.
主题词 肝提取物/治疗应用;肝功能衰竭，急性/治疗;细胞，培养的;肝/胚胎学
王英杰,王小红,王宇明,李梦东,丁健.培养胎肝细胞上清对暴发性肝衰竭小鼠存活率的影响.新消化病学杂志 , 1997；5(2)：77-78
, 百拇医药
胎肝细胞悬液治疗重型肝炎的存活率达60%～70%[1]，后因故渐被放弃.为探讨该疗法的可能机理，并为其另避蹊经，我们选用D_氨基半乳糖(D_galn)和内毒素(LPS)建立的小鼠暴发性肝衰竭(FHF)模型，研究培养胎肝细胞上清(FHCS)的保护作用.
1 材料和方法
1.1 FHCS的制备 按我科建立的体外简易两步灌流法[2]分离14周龄～20周龄水囊引产的人胎儿肝细 胞，经台盼兰染色，存活率90%以上，按2×105/ml接种于RPMI 1640条件培养液中，常规 条件下培养，每24h换液1次，收集培养第2天～4天的上清，超滤浓缩后用于实验.
1.2 小鼠FHF模型 8周龄～12周龄昆明鼠135只，雄雌兼用，由本校实验动物中心提供，在本实验室饲养1周， 实验前禁食12h，不禁水.以D_galn(日本Dacaai fesque公司产品)800mg/kg体重及LPS( 美国Sigma公司产品)60μg/kg体重腹腔注射.3h时后随机分成3组(各45只)，第1组为模 型对照组(NS组)，予腹腔1次注射生理盐水1ml/只；第2组为细胞培养液对照组(RPMI组)，每只腹腔注射用于胎肝细胞培养的RPMI 1640条件培养液1ml；第3组为FHCS治疗组(FHCS组)，每只腹腔注射FHCS 1ml.
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1.3 观测指标 ①存活率：分组实验开始记录各组(19只)小鼠的存活情况，时限为48h.血清ALT：分组实验后12，24h分别取8只小鼠活杀取血，12h内分离血清，改良金氏法检测ALT.肝脏病理检查：实验3组共30只小鼠于12h～24h取肝组织，常规切片，HE染色，观察病理改变按Minuk的标准[3]分级：级：肝细胞变性但无坏死；Ⅱ级：肝细胞呈点状或灶性坏死；Ⅲ级：肝细胞大片坏死，但仍可见较多活肝细胞；Ⅳ级：肝细胞大片坏死，仅能在肝小叶周边见到少许存活肝细胞.
2 结果
2.1 存活率 表1.
表1 FHF小鼠的存活率
, http://www.100md.com
aP<0.05，bP<0.01，分别与NS组、RPMI组比较.
2.2 血清ALT FHCS组ALT水平显著低于NS组及RPMI组(P<0.01，表2).
表2 FHF小鼠ALT变化
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bP<0.01，与其它两组比较.
2.3 肝脏病理 NS组和RPMI组肝损害均较重，以片状融合性坏死为主，病理III，IV级改变分别占81.8%(9/11)和70%(7/10)，而FHCS组病理III，IV级改变为33.3%(3/9)，统计处理显示与NS组间有显著性差异(P<0.05，表3).此外，FHCS组不仅病理改变轻，而且见有明显的肝细胞再生现象.
表3 FHF小鼠肝脏病理检查结果
, 百拇医药
3 讨论
虽然用胎肝细胞治疗FHF动物及患者均取得了满意的结果，但其机理尚未充分阐明.本世纪80年代初期，国外学者曾注意到，输注肝细胞匀浆、匀浆提取液及肝细胞液等凡含肝细胞内液的成份均能提高化学性肝衰竭模型大鼠的存活率，而分离出的肝细胞膜碎片无此作用.以后进一步发现体外培养肝细胞的培养液亦能增加肝衰动物的存活率，因此推断，在胎肝细胞治疗FHF的过程中，发挥治疗作用的并不是活细胞，而是细胞的有效成份.本文研究显示，培养人胎肝细胞的分泌上清液能显著提高D_galn/LPS所致FHF小鼠的存活率，降低其血清转氨酶水平，减轻肝细胞坏死程度，并促进肝细胞的再生，从而为上述观点提供了新的实验依据.早有学者提出，当肝细胞受损或人为分离时，肝细胞之间存在的正常接触抑制因失去细胞表面调节因子而被解除，通过一系列反馈效应产生出各种肝细胞再生物质，促进肝细胞再生与修复，该理论正日益受到重视，成为肝再生的重要机理.因此不难理解，早期的胎肝细胞悬液输注法用机械研磨已使肝细胞普遍受损、活力下降，但仍有较好的疗效.由此可推测，本文所分离、培养的胎肝细胞分泌上清中必定富含促肝细胞生长因子类物质，从而对FHF起更好的保护和治疗作用. 在国外，肝细胞移植治疗FHF一直是热门研究课题之一，其中不乏有用人胎肝细胞治疗FHF的近期临床报道[4].我国本世纪80年代后期风靡一时的胎肝细胞悬液疗法被迫中止的原因，除主要因不少单位滥用而遭到国际舆论的指责外，制备工艺粗糙、制剂中细胞活力丧失、混杂其它不利成份以及易引起不良反应等也是重要的原因.相比之下，采用目前常用的体外灌流法分离胎肝细胞并加以条件培养，不仅避免了上述弊端，而且大大减少了对人胎儿的依赖性，因此可望为胎肝细胞治疗重型肝炎开避新的途径.
, http://www.100md.com
4 参考文献1 陈成伟，费瑞高，李继强，等.人胎肝细胞治疗重症肝炎7例报告.中华消化杂志，1987；7(2)：84-86
2 王宇明，陈国致，董家鸿，等.分离肝细胞的体外灌流法及其应用.中华实验外科杂志，1994；11(增刊)：117-118
3 Minuk GY, Sherman TA, Shaffer EA, et al. A comparative study of the effects of insulin/glucagon
infusions, parenteral amino acids and high dose corticosteroids on survival in a rabbit model of
acute fulminant hepatitis.Hepatology, 1986;6(1):73-78
4 Habibullah CM, Syed IH, Qamar A, et al. Human fetal hepatocyte transplantation in patients
with fulminant hepatic failure. Transplantation, 1994;58(8):951-952, http://www.100md.com
项目负责人:王英杰
收稿日期:1995-11-25 接受日期:1995-12-25
Effects of supernatant from fetal hepatocyte culture on the mice surv ival fulminant hepatic failure
Ying-Jie Wang, Xiao-Hong Wang, Yu-Ming Wang, Meng-Dong Li and Jian Ding
Centre of Infectious Diseases, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 630038, Sichuan Province, China
, 百拇医药
Abstract
AIM To study the mechanism of human fetal hepatocyte (hFH) for the treatment of severe liver diseases and evaluate the possibility of supernatant from fetal hepatocyte culture(FHCS) to take the place of hFH.
METHODS The protective effects of FHCS on the mice fulminant hepatic failure (FHF) model induced by D_galactosamine (D_galn) and lipopolysacharide (LPS) were observed.
, 百拇医药
RESULTS After the treatment of FHCS, the survival of FHF mice was prolonged (P<0.01), and the serum aminotransferase wa s decreased (P<0.05). The morphological obervation showed that the hepatic necrosis was slight and the liver regeneration was clear.
CONCLUSION FHCS has a marked protective and therapeutic effects, which could open a new way for the hFH therapy.
, http://www.100md.com
Subject headings Liver extracts/therapeutic use;Liver failure, acute/therapy;Cells, cultured;Liver/embryology
Wang YJ, Wang XH, Wang YM, Li MD,Ding J.Effects of supernatant from fetalhepatocyte culture on the mice survival fulminant hepatic failure.XinXiaohuabingxue Zazhi,1997；5(2)：77-78
摘要
目的 探讨胎肝细胞悬液治疗严重肝病的机理以及使用培养胎肝细胞分泌上清(FHCS)替代的可能性.
, http://www.100md.com
方法 采用D_氨基半乳糖(D_galn)/内毒素(LPS)诱发小鼠暴发性肝衰竭(FHF)，观察FHCS的保护作用.
结果 FHCS能显著提高FHF小鼠的存活率(P<0.01)，降低血清转氨酶(P<0.05)，减轻肝细胞坏死程度，并促进肝细胞再生.
结论 FHCS对FHF有较好的保护与治疗作用，可望为已被迫放弃的胎肝细胞悬液输注疗法开辟新的途径.
主题词 肝提取物/治疗应用;肝功能衰竭，急性/治疗;细胞，培养的;肝/胚胎学
王英杰,王小红,王宇明,李梦东,丁健.培养胎肝细胞上清对暴发性肝衰竭小鼠存活率的影响.新消化病学杂志 , 1997；5(2)：77-78
, 百拇医药
胎肝细胞悬液治疗重型肝炎的存活率达60%～70%[1]，后因故渐被放弃.为探讨该疗法的可能机理，并为其另避蹊经，我们选用D_氨基半乳糖(D_galn)和内毒素(LPS)建立的小鼠暴发性肝衰竭(FHF)模型，研究培养胎肝细胞上清(FHCS)的保护作用.
1 材料和方法
1.1 FHCS的制备 按我科建立的体外简易两步灌流法[2]分离14周龄～20周龄水囊引产的人胎儿肝细 胞，经台盼兰染色，存活率90%以上，按2×105/ml接种于RPMI 1640条件培养液中，常规 条件下培养，每24h换液1次，收集培养第2天～4天的上清，超滤浓缩后用于实验.
1.2 小鼠FHF模型 8周龄～12周龄昆明鼠135只，雄雌兼用，由本校实验动物中心提供，在本实验室饲养1周， 实验前禁食12h，不禁水.以D_galn(日本Dacaai fesque公司产品)800mg/kg体重及LPS( 美国Sigma公司产品)60μg/kg体重腹腔注射.3h时后随机分成3组(各45只)，第1组为模 型对照组(NS组)，予腹腔1次注射生理盐水1ml/只；第2组为细胞培养液对照组(RPMI组)，每只腹腔注射用于胎肝细胞培养的RPMI 1640条件培养液1ml；第3组为FHCS治疗组(FHCS组)，每只腹腔注射FHCS 1ml.
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1.3 观测指标 ①存活率：分组实验开始记录各组(19只)小鼠的存活情况，时限为48h.血清ALT：分组实验后12，24h分别取8只小鼠活杀取血，12h内分离血清，改良金氏法检测ALT.肝脏病理检查：实验3组共30只小鼠于12h～24h取肝组织，常规切片，HE染色，观察病理改变按Minuk的标准[3]分级：级：肝细胞变性但无坏死；Ⅱ级：肝细胞呈点状或灶性坏死；Ⅲ级：肝细胞大片坏死，但仍可见较多活肝细胞；Ⅳ级：肝细胞大片坏死，仅能在肝小叶周边见到少许存活肝细胞.
2 结果
2.1 存活率 表1.
表1 FHF小鼠的存活率
| 分组 | n | 存活数 | 存活率(%) | ||
| 12h | 24h | 48h | |||
| NS组 | 19 | 15 | 3 | 2 | 10.5 |
| RPMI组 | 19 | 16 | 5 | 3 | 15.8 |
| FHCS组 | 19 | 18 | 10 | 10 | 52.6a.b |
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aP<0.05，bP<0.01，分别与NS组、RPMI组比较.
2.2 血清ALT FHCS组ALT水平显著低于NS组及RPMI组(P<0.01，表2).
表2 FHF小鼠ALT变化
| 分组 | n | ALT | |
| 12h | 24h | ||
| NS组 | 8 | 207.2±41.3 | 367.8±56.6 |
| RPMI组 | 8 | 188.4±52.6 | 339.1±44.7 |
| FHCS组 | 8 | 92.5±28.7b | 143.6±32.8b |
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bP<0.01，与其它两组比较.
2.3 肝脏病理 NS组和RPMI组肝损害均较重，以片状融合性坏死为主，病理III，IV级改变分别占81.8%(9/11)和70%(7/10)，而FHCS组病理III，IV级改变为33.3%(3/9)，统计处理显示与NS组间有显著性差异(P<0.05，表3).此外，FHCS组不仅病理改变轻，而且见有明显的肝细胞再生现象.
表3 FHF小鼠肝脏病理检查结果
| 分组 | n | 病理分 | |||
| Ⅳ | Ⅲ | Ⅱ | Ⅰ | ||
| NS组 | 11 | 3 | 6 | 2 | |
| RPMI组 | 10 | 3 | 4 | 3 | |
| FHCS组 | 9 | 3 | 4 | 2 |
, 百拇医药
3 讨论
虽然用胎肝细胞治疗FHF动物及患者均取得了满意的结果，但其机理尚未充分阐明.本世纪80年代初期，国外学者曾注意到，输注肝细胞匀浆、匀浆提取液及肝细胞液等凡含肝细胞内液的成份均能提高化学性肝衰竭模型大鼠的存活率，而分离出的肝细胞膜碎片无此作用.以后进一步发现体外培养肝细胞的培养液亦能增加肝衰动物的存活率，因此推断，在胎肝细胞治疗FHF的过程中，发挥治疗作用的并不是活细胞，而是细胞的有效成份.本文研究显示，培养人胎肝细胞的分泌上清液能显著提高D_galn/LPS所致FHF小鼠的存活率，降低其血清转氨酶水平，减轻肝细胞坏死程度，并促进肝细胞的再生，从而为上述观点提供了新的实验依据.早有学者提出，当肝细胞受损或人为分离时，肝细胞之间存在的正常接触抑制因失去细胞表面调节因子而被解除，通过一系列反馈效应产生出各种肝细胞再生物质，促进肝细胞再生与修复，该理论正日益受到重视，成为肝再生的重要机理.因此不难理解，早期的胎肝细胞悬液输注法用机械研磨已使肝细胞普遍受损、活力下降，但仍有较好的疗效.由此可推测，本文所分离、培养的胎肝细胞分泌上清中必定富含促肝细胞生长因子类物质，从而对FHF起更好的保护和治疗作用. 在国外，肝细胞移植治疗FHF一直是热门研究课题之一，其中不乏有用人胎肝细胞治疗FHF的近期临床报道[4].我国本世纪80年代后期风靡一时的胎肝细胞悬液疗法被迫中止的原因，除主要因不少单位滥用而遭到国际舆论的指责外，制备工艺粗糙、制剂中细胞活力丧失、混杂其它不利成份以及易引起不良反应等也是重要的原因.相比之下，采用目前常用的体外灌流法分离胎肝细胞并加以条件培养，不仅避免了上述弊端，而且大大减少了对人胎儿的依赖性，因此可望为胎肝细胞治疗重型肝炎开避新的途径.
, http://www.100md.com
4 参考文献1 陈成伟，费瑞高，李继强，等.人胎肝细胞治疗重症肝炎7例报告.中华消化杂志，1987；7(2)：84-86
2 王宇明，陈国致，董家鸿，等.分离肝细胞的体外灌流法及其应用.中华实验外科杂志，1994；11(增刊)：117-118
3 Minuk GY, Sherman TA, Shaffer EA, et al. A comparative study of the effects of insulin/glucagon
infusions, parenteral amino acids and high dose corticosteroids on survival in a rabbit model of
acute fulminant hepatitis.Hepatology, 1986;6(1):73-78
4 Habibullah CM, Syed IH, Qamar A, et al. Human fetal hepatocyte transplantation in patients
with fulminant hepatic failure. Transplantation, 1994;58(8):951-952, http://www.100md.com