幽门螺杆菌培养滤液诱导胃粘膜细胞恶性 转化
第三军医大学西南医院消化科 四川省重庆市 630038
梁后杰，男，1964-12-05生，河南省商丘县人，汉族.1983年新乡医学院医疗系毕业，消化内科副主任医师，副教授，医学博士，主要从事胃癌前病变的研究，发表论文20篇.
项目负责人 梁后杰,四川省重庆市沙坪坝区高滩岩正街31号.
Telephone:0811-5318301-42304收搞日期 1996-04-04 接收日期 1996-08-21
Malignant transformation of gastric mucosal cells induced by concentr
ated Helicobacter pylori culture supernatant in vitro
, http://www.100md.com
Hou-Jie Liang, Wei-Wen Liu, Dian-Chun Fang, Wei Liu and Jun-Ru Wang
Department of Gastroenterology,Southwest Hospital,Third Military Medical University,Chongqing 630038 Sichuan Province,China
Abstract
AIM To investigate the transformating effect of concentrated Helicobacter pylori culture supernatant on gastric mucosal cells in vitro.
, http://www.100md.com
METHODS Gastric mucosal cells were stimulated with concentrated Helicobacter pylori culture supernatant and the growth characteristics and ultrastructures were examined.
RESULTS Concentrated Helicobacter pylori culture supernatan t could stimulate cell growth,increase cell saturation density and the expression of ras P21 protein.The transformed cells showed disorganized growth pattern with altered cell morphology and ultrastructure,and could be agglutinated by concanavalin A and had the ability to form colonies in soft_agar medium.
, http://www.100md.com
CONCLUSION Concentrated Helicobacter pylori culture superna tant could induce malignant transformation of gastric mucosal cells in vitro,suggesting that Helicobacter pylori cytotoxin(s) may have potential carcinogenecity.
Subject headings Helicobacter pylori Gastric; mucosa/patholog y; Liver neoplasms/microbiology
Liang HJ, Liu WW, Fang DC, Liu W, Wang JR. Malignant transformation of gastric mucosal cells induced by concentrated Helicobacter pylori culture supernatant in vitro. Xin Xiaohuabingxue Zazhi, 1997；5(4)：213-215
, http://www.100md.com
摘 要
目的 研究浓缩的幽门螺杆菌(Hp)培养滤液体外对胃粘膜细胞的转化作用.
方法 以旋转培养法制备浓缩的Hp培养滤液，与胃粘膜细胞共同孵育后，观察胃粘膜细胞生长特性和细胞结构的变化.
结果 在Hp培养滤液的作用下，胃粘膜细胞增殖加速，饱和密度增加，失去生长的接触性抑制，ras癌基因表达增高，ConA凝集试验阳性，能在软琼脂中集落生长，并有细胞排列紊乱、重叠生长、形态不规则、胞核增大、核膜凹陷、细胞表面微绒毛丰富、长短不一等细胞形态和超微结构的改变.说明在Hp培养滤液的作用下，胃粘膜细胞已获得恶性转化的部分表型特征.
结论 Hp培养滤液体外可诱导胃粘膜细胞的恶性转化，具有潜在的致癌活性.
, 百拇医药
主题词 幽门螺杆菌;胃粘膜/病理学;肝肿瘤/微生物学
梁后杰, 刘为纹, 房殿春, 刘卫, 王俊茹. 幽门螺杆菌培养滤液诱导胃粘膜细胞恶性 转化. 新消化病学杂志, 1997；5(4)：213-215
流行病学资料表明，幽门螺杆菌(Hp)感染可能与胃癌的发生有关，但其确切的作用尚不清楚[1-2].Hp感染常持续存在，但极少直接侵犯胃粘膜上皮细胞，故不少人推测，Hp分泌的某些毒性物质可能在其致病机制中起重要作用.我们参照Leunk等[3]的方法，以旋转培养法制备Hp培养滤液，并以Hp寄居的靶器官——胃粘膜细胞为受试对象，通过观察Hp培养滤液体外对胃粘膜细胞的转化作用，探讨Hp毒素的致癌性.
1 材料和方法
, 百拇医药
1.1 材料 ①Hp培养滤液的制备：从胃粘膜活检标本分离培养Hp，并进行鉴定.参照Leunk等的方法以布氏肉汤于37℃微需氧条件下旋转(120 r/min)培养72h,培养液于12 000g 低温离心30min，上清液经0.22μm微孔滤膜过滤除菌，冷冻浓缩20倍，低温保存备用.以相同方法(不加Hp)制备肉汤滤液作为对照.②胃粘膜细胞的分离培养：水囊引产18周～28周龄的胎胃组织，经机械分离和酶消化法制备单细胞悬液.调细胞浓度为(1～5)×105/ml，培养液采用DMEM Eagle和Ham F12混合培养基.培养箱通5%CO2，95%空气，于37℃培养.
1.2 方法 ①毒性实验：将传代胃粘膜细胞种入20ml培养瓶中，每瓶1000个细胞.在37℃，5%CO2孵箱中培养24h，待细胞贴壁后加入不同浓度的Hp培养滤液(3，6，12，24，48μl/ml)，作用48h,换新鲜培养液，此后每3 d 换液1次，继续培养14d.经甲醇固定，Giemsa染色，计数存活细胞集落.根据Hp培养滤液时细胞集落形成的半数抑制浓度(IC50值)，选择1/3～1 IC50值的浓度用于转化试验.②转化方法：根据细胞毒性实验结果，选择Hp培养滤液浓度为3，6，12μl/ml 3个剂量组用于转化试验，另以12 μ/ml的肉汤滤液作为对照.细胞接种24h 后，换含不同浓度的Hp 培养滤液染毒72h，再换新鲜培养液，于第2周再按上述方法染毒1次，视细胞生长密度，以1∶1，1∶2，1∶3等不同比例分种传代培养.③细胞生长曲线及饱和密度：将细胞以2×105/瓶的密度接种于25ml培养瓶，次日起，每天取3瓶细胞进行计数，取平均值绘制生长曲线，最高峰值为饱和密度.④刀豆素A(Con A)凝集试验：细胞经胰酶消化，用无血清F12培养液吹打成单细胞悬液，浓度为1×105细胞/ml.向多孔板中每孔加细胞液0.1ml，再加不同浓度的Con A 0.1 ml，置微型振荡器上振荡15min，观察凝集情况.⑤软琼脂培养基集落形成试验：平板琼脂浓度为底层0.5%，顶层0.3%，每皿接种1000个细胞，培养21 d，观察细胞在软琼脂中形成的集落.⑥Ha_ras癌基因产物P21蛋白ELISA检测：根据Engvall的方法，将细胞以2.0×104/孔种入多聚赖氨酸预先涂布的96孔板，0.05%冷戊二醛固定10 min,1% Triton 100室温作用10 min，再以1%BSA室温浸泡1h后，加入1000倍稀释的小鼠抗P21蛋白单克隆抗体，室温作用1h，生理盐水洗5遍，加入二抗-辣根过氧化物酶交联的兔抗鼠IgG，室温作用30 min后再以生理盐水洗5遍，以邻苯二胺显色，酶联仪测定492nm处的OD值，求平均值与对照比较.⑦细胞电镜观察：细胞经4%戊二醛和1%饿酸双重固定，环氧树脂618包埋，超薄切片醋酸铀和枸橼酸铅染色，用JEM-2000型电镜观察.
, 百拇医药
2 结果
2.1 细胞生长曲线 如图1所示，实验组细胞生长速度较对照组增加，接种6 d后对照组细胞趋于生长饱和，生长曲线进入平顶期，而实验组细胞(以6μl/ml剂量为例)继续呈指数生长，其饱和密度高于对照组，说明实验组细胞推动了生长的接触性抑制.
2.2 Con A〖HTK〗凝集试验 正常细胞在较高Con A浓度时出现轻微凝集，实验组细胞在较低 Con A浓度时即出现明显的凝集现象.
表1 转化细胞与对照细胞Con A凝集性比较
, http://www.100md.com
2.3 软琼脂培养基中的集落生长 实验组细胞出现旺盛生长时(第5～6代)，我们曾进行此试验，但未获阳性结果.又经4～5次传代(第10代),此试验才呈阳性.在将细胞接种于琼脂的第5天，倒置显微镜下可见细胞已分裂增殖，至10d～12d时已能看到集落形成.2周～3周所有剂量组均出现了细胞集落，且随Hp培养滤液浓度的增加，所形成的集落也较大.
2.4 Ha_ras癌基因产物P21蛋白的表达 细胞受Hp培养滤液作用后，ELISA所测得的OD值逐渐增高，第2代，第5代和第8代细胞的OD值分别为0.89，0.96和1.08，显著高于对照组(OD值为0.35).但第10代后又开始下降，第10代和第12代细胞的OD值分别为0.41和0.38，几乎降至正常水平.
2.5 形态学改变 实验组细胞传至第4～5代时出现旺盛生长，第6代后依Hp培养滤液剂量从高到低各组先后出现细胞转化灶.转化细胞呈圆、椭圆或多边形，密集成簇，并可重叠生长(图2).电镜下观察，见细胞形态不规则，胞核明显增大，核形态不规则，有的高度曲折凹陷(图3).核膜弯曲折迭，核仁增多，细胞表面微绒毛丰富，长短不一.
, 百拇医药
图1 细胞生长曲线
图2 Hp培养滤液转化的细胞呈重叠生长，倒置显微镜×100
图3 Hp培养滤液转化的细胞，核膜凹陷，呈髓鞘样结构 TEM×15K
3 讨论本研究以Hp培养滤液处理人胃粘膜细胞，其生长特性出现了改变，表现为细胞增殖加速，饱和密度增加，失去生长的接触性抑制，ras癌基因表达增高，Con A凝集试验阳性，能在软琼脂中集落生长，并有细胞形态和超微结构的改变.这些均说明受Hp培养滤液作用的细胞已获得恶性转化的部分表型特征.我们的研究发现，在细胞转化的早期阶段，ras癌基因产物P21蛋白的表达明显增高，而在较晚期阶段当细胞获得软琼脂中生长能力等恶性特征时，P21蛋白的表达几乎降至正常水平，说明ras癌基因可能主要在癌变早期(启动阶段)起作用，而当细胞完成启动阶段之后，ras癌基因的表达可能又恢复至原来水平.这些结果与国内在食管上皮细胞转化试验中所得结果一致[4-6].细胞体外培养系统是研究肿瘤病因及癌变机理的重要手段.人类恶性肿瘤80%以上起源于上皮组织，因此在不可能用人体作整体试验的情况下，建立敏感、可靠的人上皮细胞体外转化系统具有重要的意义.我们在成功建立人胃粘膜上皮细胞体外培养的基础上，将其应用于人类致癌危险因子的检测，结果发现在Hp培养滤液的作用下，胃粘膜上皮细胞出现了一系列恶性转化的表型特征，多次试验均证实了此系统的敏感性、稳定性和可重复性.这一结果不仅首次证实了Hp毒性产物的体外致癌作用，而且为胃癌病因学和癌变机理的研究提供了一个较为理想的体外模型.
, http://www.100md.com
4 参考文献1 Nomura A,Stemmerman GN.Helicobacter pylori and gastric cancer.Gastroenterol Hepatol,1993;8(2):294-303
2 Hirai M,Azuma T,Ho S,et al.High prevalence of neutralizing activity to Helicobacter pylori cytotoxin in serum of gastric
carcinoma patients.Int J Cancer,1994;56(1):56-60
3 Leunk RD,Johnson PT,David BC,et al.Cytotoxic activity in broth culture filtrates of campylobacter pylori.
J Med Microbiol,1988;26(1):93-99
4 张启行,徐永玲，席与萍，等.人胃粘膜上皮细胞的原代培养及其特性观察的初步报道.北京医科大学学报，1988；20(1)：70
5 路桂荣，武纯静，柯杨，等.C_Ha_ras反义RNA对细胞恶性表型逆转作用的研究.中国科学(B辑)，1991;6(1):67-73
6 张鹏.交链孢酚单甲醚激活人胎食管上皮组织细胞癌基因的研究.中华病理学杂志，1991；20(1)：14-16, 百拇医药(梁后杰 刘为纹 房殿春 刘卫 王俊茹)
梁后杰，男，1964-12-05生，河南省商丘县人，汉族.1983年新乡医学院医疗系毕业，消化内科副主任医师，副教授，医学博士，主要从事胃癌前病变的研究，发表论文20篇.
项目负责人 梁后杰,四川省重庆市沙坪坝区高滩岩正街31号.
Telephone:0811-5318301-42304收搞日期 1996-04-04 接收日期 1996-08-21
Malignant transformation of gastric mucosal cells induced by concentr
ated Helicobacter pylori culture supernatant in vitro
, http://www.100md.com
Hou-Jie Liang, Wei-Wen Liu, Dian-Chun Fang, Wei Liu and Jun-Ru Wang
Department of Gastroenterology,Southwest Hospital,Third Military Medical University,Chongqing 630038 Sichuan Province,China
Abstract
AIM To investigate the transformating effect of concentrated Helicobacter pylori culture supernatant on gastric mucosal cells in vitro.
, http://www.100md.com
METHODS Gastric mucosal cells were stimulated with concentrated Helicobacter pylori culture supernatant and the growth characteristics and ultrastructures were examined.
RESULTS Concentrated Helicobacter pylori culture supernatan t could stimulate cell growth,increase cell saturation density and the expression of ras P21 protein.The transformed cells showed disorganized growth pattern with altered cell morphology and ultrastructure,and could be agglutinated by concanavalin A and had the ability to form colonies in soft_agar medium.
, http://www.100md.com
CONCLUSION Concentrated Helicobacter pylori culture superna tant could induce malignant transformation of gastric mucosal cells in vitro,suggesting that Helicobacter pylori cytotoxin(s) may have potential carcinogenecity.
Subject headings Helicobacter pylori Gastric; mucosa/patholog y; Liver neoplasms/microbiology
Liang HJ, Liu WW, Fang DC, Liu W, Wang JR. Malignant transformation of gastric mucosal cells induced by concentrated Helicobacter pylori culture supernatant in vitro. Xin Xiaohuabingxue Zazhi, 1997；5(4)：213-215
, http://www.100md.com
摘 要
目的 研究浓缩的幽门螺杆菌(Hp)培养滤液体外对胃粘膜细胞的转化作用.
方法 以旋转培养法制备浓缩的Hp培养滤液，与胃粘膜细胞共同孵育后，观察胃粘膜细胞生长特性和细胞结构的变化.
结果 在Hp培养滤液的作用下，胃粘膜细胞增殖加速，饱和密度增加，失去生长的接触性抑制，ras癌基因表达增高，ConA凝集试验阳性，能在软琼脂中集落生长，并有细胞排列紊乱、重叠生长、形态不规则、胞核增大、核膜凹陷、细胞表面微绒毛丰富、长短不一等细胞形态和超微结构的改变.说明在Hp培养滤液的作用下，胃粘膜细胞已获得恶性转化的部分表型特征.
结论 Hp培养滤液体外可诱导胃粘膜细胞的恶性转化，具有潜在的致癌活性.
, 百拇医药
主题词 幽门螺杆菌;胃粘膜/病理学;肝肿瘤/微生物学
梁后杰, 刘为纹, 房殿春, 刘卫, 王俊茹. 幽门螺杆菌培养滤液诱导胃粘膜细胞恶性 转化. 新消化病学杂志, 1997；5(4)：213-215
流行病学资料表明，幽门螺杆菌(Hp)感染可能与胃癌的发生有关，但其确切的作用尚不清楚[1-2].Hp感染常持续存在，但极少直接侵犯胃粘膜上皮细胞，故不少人推测，Hp分泌的某些毒性物质可能在其致病机制中起重要作用.我们参照Leunk等[3]的方法，以旋转培养法制备Hp培养滤液，并以Hp寄居的靶器官——胃粘膜细胞为受试对象，通过观察Hp培养滤液体外对胃粘膜细胞的转化作用，探讨Hp毒素的致癌性.
1 材料和方法
, 百拇医药
1.1 材料 ①Hp培养滤液的制备：从胃粘膜活检标本分离培养Hp，并进行鉴定.参照Leunk等的方法以布氏肉汤于37℃微需氧条件下旋转(120 r/min)培养72h,培养液于12 000g 低温离心30min，上清液经0.22μm微孔滤膜过滤除菌，冷冻浓缩20倍，低温保存备用.以相同方法(不加Hp)制备肉汤滤液作为对照.②胃粘膜细胞的分离培养：水囊引产18周～28周龄的胎胃组织，经机械分离和酶消化法制备单细胞悬液.调细胞浓度为(1～5)×105/ml，培养液采用DMEM Eagle和Ham F12混合培养基.培养箱通5%CO2，95%空气，于37℃培养.
1.2 方法 ①毒性实验：将传代胃粘膜细胞种入20ml培养瓶中，每瓶1000个细胞.在37℃，5%CO2孵箱中培养24h，待细胞贴壁后加入不同浓度的Hp培养滤液(3，6，12，24，48μl/ml)，作用48h,换新鲜培养液，此后每3 d 换液1次，继续培养14d.经甲醇固定，Giemsa染色，计数存活细胞集落.根据Hp培养滤液时细胞集落形成的半数抑制浓度(IC50值)，选择1/3～1 IC50值的浓度用于转化试验.②转化方法：根据细胞毒性实验结果，选择Hp培养滤液浓度为3，6，12μl/ml 3个剂量组用于转化试验，另以12 μ/ml的肉汤滤液作为对照.细胞接种24h 后，换含不同浓度的Hp 培养滤液染毒72h，再换新鲜培养液，于第2周再按上述方法染毒1次，视细胞生长密度，以1∶1，1∶2，1∶3等不同比例分种传代培养.③细胞生长曲线及饱和密度：将细胞以2×105/瓶的密度接种于25ml培养瓶，次日起，每天取3瓶细胞进行计数，取平均值绘制生长曲线，最高峰值为饱和密度.④刀豆素A(Con A)凝集试验：细胞经胰酶消化，用无血清F12培养液吹打成单细胞悬液，浓度为1×105细胞/ml.向多孔板中每孔加细胞液0.1ml，再加不同浓度的Con A 0.1 ml，置微型振荡器上振荡15min，观察凝集情况.⑤软琼脂培养基集落形成试验：平板琼脂浓度为底层0.5%，顶层0.3%，每皿接种1000个细胞，培养21 d，观察细胞在软琼脂中形成的集落.⑥Ha_ras癌基因产物P21蛋白ELISA检测：根据Engvall的方法，将细胞以2.0×104/孔种入多聚赖氨酸预先涂布的96孔板，0.05%冷戊二醛固定10 min,1% Triton 100室温作用10 min，再以1%BSA室温浸泡1h后，加入1000倍稀释的小鼠抗P21蛋白单克隆抗体，室温作用1h，生理盐水洗5遍，加入二抗-辣根过氧化物酶交联的兔抗鼠IgG，室温作用30 min后再以生理盐水洗5遍，以邻苯二胺显色，酶联仪测定492nm处的OD值，求平均值与对照比较.⑦细胞电镜观察：细胞经4%戊二醛和1%饿酸双重固定，环氧树脂618包埋，超薄切片醋酸铀和枸橼酸铅染色，用JEM-2000型电镜观察.
, 百拇医药
2 结果
2.1 细胞生长曲线 如图1所示，实验组细胞生长速度较对照组增加，接种6 d后对照组细胞趋于生长饱和，生长曲线进入平顶期，而实验组细胞(以6μl/ml剂量为例)继续呈指数生长，其饱和密度高于对照组，说明实验组细胞推动了生长的接触性抑制.
2.2 Con A〖HTK〗凝集试验 正常细胞在较高Con A浓度时出现轻微凝集，实验组细胞在较低 Con A浓度时即出现明显的凝集现象.
表1 转化细胞与对照细胞Con A凝集性比较
| 细胞 | n | Con A浓度(μg/ml) | ||||
| 0.0 | 12.5 | 25.0 | 50.0 | 100.0 | ||
| 对照组 | 3 | - | - | - | - | + |
| 实验组 | 12 | - | + | ++ | +++ | ++++ |
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2.3 软琼脂培养基中的集落生长 实验组细胞出现旺盛生长时(第5～6代)，我们曾进行此试验，但未获阳性结果.又经4～5次传代(第10代),此试验才呈阳性.在将细胞接种于琼脂的第5天，倒置显微镜下可见细胞已分裂增殖，至10d～12d时已能看到集落形成.2周～3周所有剂量组均出现了细胞集落，且随Hp培养滤液浓度的增加，所形成的集落也较大.
2.4 Ha_ras癌基因产物P21蛋白的表达 细胞受Hp培养滤液作用后，ELISA所测得的OD值逐渐增高，第2代，第5代和第8代细胞的OD值分别为0.89，0.96和1.08，显著高于对照组(OD值为0.35).但第10代后又开始下降，第10代和第12代细胞的OD值分别为0.41和0.38，几乎降至正常水平.
2.5 形态学改变 实验组细胞传至第4～5代时出现旺盛生长，第6代后依Hp培养滤液剂量从高到低各组先后出现细胞转化灶.转化细胞呈圆、椭圆或多边形，密集成簇，并可重叠生长(图2).电镜下观察，见细胞形态不规则，胞核明显增大，核形态不规则，有的高度曲折凹陷(图3).核膜弯曲折迭，核仁增多，细胞表面微绒毛丰富，长短不一.
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图1 细胞生长曲线
图2 Hp培养滤液转化的细胞呈重叠生长，倒置显微镜×100
图3 Hp培养滤液转化的细胞，核膜凹陷，呈髓鞘样结构 TEM×15K
3 讨论本研究以Hp培养滤液处理人胃粘膜细胞，其生长特性出现了改变，表现为细胞增殖加速，饱和密度增加，失去生长的接触性抑制，ras癌基因表达增高，Con A凝集试验阳性，能在软琼脂中集落生长，并有细胞形态和超微结构的改变.这些均说明受Hp培养滤液作用的细胞已获得恶性转化的部分表型特征.我们的研究发现，在细胞转化的早期阶段，ras癌基因产物P21蛋白的表达明显增高，而在较晚期阶段当细胞获得软琼脂中生长能力等恶性特征时，P21蛋白的表达几乎降至正常水平，说明ras癌基因可能主要在癌变早期(启动阶段)起作用，而当细胞完成启动阶段之后，ras癌基因的表达可能又恢复至原来水平.这些结果与国内在食管上皮细胞转化试验中所得结果一致[4-6].细胞体外培养系统是研究肿瘤病因及癌变机理的重要手段.人类恶性肿瘤80%以上起源于上皮组织，因此在不可能用人体作整体试验的情况下，建立敏感、可靠的人上皮细胞体外转化系统具有重要的意义.我们在成功建立人胃粘膜上皮细胞体外培养的基础上，将其应用于人类致癌危险因子的检测，结果发现在Hp培养滤液的作用下，胃粘膜上皮细胞出现了一系列恶性转化的表型特征，多次试验均证实了此系统的敏感性、稳定性和可重复性.这一结果不仅首次证实了Hp毒性产物的体外致癌作用，而且为胃癌病因学和癌变机理的研究提供了一个较为理想的体外模型.
, http://www.100md.com
4 参考文献1 Nomura A,Stemmerman GN.Helicobacter pylori and gastric cancer.Gastroenterol Hepatol,1993;8(2):294-303
2 Hirai M,Azuma T,Ho S,et al.High prevalence of neutralizing activity to Helicobacter pylori cytotoxin in serum of gastric
carcinoma patients.Int J Cancer,1994;56(1):56-60
3 Leunk RD,Johnson PT,David BC,et al.Cytotoxic activity in broth culture filtrates of campylobacter pylori.
J Med Microbiol,1988;26(1):93-99
4 张启行,徐永玲，席与萍，等.人胃粘膜上皮细胞的原代培养及其特性观察的初步报道.北京医科大学学报，1988；20(1)：70
5 路桂荣，武纯静，柯杨，等.C_Ha_ras反义RNA对细胞恶性表型逆转作用的研究.中国科学(B辑)，1991;6(1):67-73
6 张鹏.交链孢酚单甲醚激活人胎食管上皮组织细胞癌基因的研究.中华病理学杂志，1991；20(1)：14-16, 百拇医药(梁后杰 刘为纹 房殿春 刘卫 王俊茹)