河南食管癌高低发区人群食管上皮p53变化 和细胞增生状况的比较研究
1河南医科大学癌症研究室 河南省郑州市 450052
2河南范县人民医院
*国家教委优秀青年教师基金 河南省杰出青年科学基金资助项目(No.951200134).
项目负责人 王立东,河南医科大学癌症研究室 河南省郑州市 450052
收搞日期 1996-04-22
p53 alterations and cell proliferation in esophageal epithelia among subjects from high and low incidence areas of esophageal cancer
, 百拇医药
Li-Dong Wang1, Qi Zhou1, Yu-Chun Zhang2, Xiao-Fang Li1, Wen-Ping Wang2, Ling He2, Shan-Shan Gao1 and Young-Xin Li1
1 Laboratory for Cancer Research,Henan Medical University,Zhengzhou 450052,Henan Province,China
2 Fanxian People's Hospital,Fanxian County
AbstractAIM To study p53 alteration and cell proliferation in esopha geal epithelia in high and lowincidence areas for esophageal cancer in Henan Province to understand their molecular basis.
, 百拇医药
METHODS Esophageal endoscopic mucosa biopsies and histopatholog ical examinations were performed on 220 subjects from highincidence areas and 50 subjects from lowincidence areas of esophageal cancer in Henan Province.The esophageal epithelia was diagnosed as normal,basal cell hyperplasia and dysplasia based on the cell morphology and tissue structure.Immunohistochemistry (ABC method)was applied to analyze the P53 alteration and proliferating cell nuclear antigen (PCNA) in the normal epithelia and the epithelia with different severities of lesions.The immunostaining positive cells of P53 and PCNA were counted.
, http://www.100md.com
RESULTS Positive immunostains for P53 and PCAN were observed i n esophageal epithelial cell nuclei in individuals both from the high and low-inc idence areas.The number of PCNA positive cells in the esophageal epithelia gradually increased with lesions worsening in the high and lowincidence areas.In high incidence areas,the number of P53 protein immunostaining positive cells was higher than that in lowincidence areas,and rapidly increased with lesion progressing.P53 alteration was correlated with PCNA,and increased with the lesions progressing.
, http://www.100md.com
CONCLUSION The number of p53 and PCNA positive cells both incre ased.p53 alteration was higher in subjects from highincidence areas of esophageal cancer than those from lowincidence areas.These results may shed a light on the molecular basis for the geographic distribution of esophageal cancer.
Subject headings Esophageal neoplasms/pathology Genes,p53; Esophagus/pathology
Wang LD, Zhou Q, Zhang YC, Li XF, Wang WP, He L, Gao SS, Li YX. p53 alterations and cell proliferation in esophageal epithelia among subjects from high and low incidence areas of esophageal cancer. Xin Xiaohuabingxue Zazhi, 1997；5(4)：221-222
, 百拇医药
摘 要
目的 探讨食管癌高、低发区人群食管上皮肿瘤抑制基因p53的变化及其与细胞增生状况的关系，以了解食管癌变的分子学基础.
方法 食管癌高发区居民220例和低发区居民50例分别进行食管内镜检查、粘膜活检和组织病理学检查.根据细胞和组织形态结构区分为正常、基底细胞增生和间变，并采用免疫组化ABC法分析各级病变和正常上皮P53蛋白及细胞增生核抗原(PCNA)的改变，并计数上皮单位面积内P53和PCNA阳性细胞数，进行定量比较研究.
结果 河南高、低发区人群食管上皮细胞均出现不同程度的P53和PCNA的变化.高、低发区居民食管正常上皮和病变组织PCNA免疫阳性细胞数和高发区P53阳性细胞数随病变加重呈升高趋势.但是，低发区居民食管上皮P53阳性细胞数却无此现象.
, http://www.100md.com
结论 肿瘤抑制基因P53的变化和PCNA改变有明显关系，均随病变的进展而升高.高发区居民食管各级病变P53改变明显高于低发区居民，此结果有助于对食管癌地域性分布差异的分子学基础的了解.
主题词 食管肿瘤/病理学;基因，p53;食管/病理学
王立东, 周琦, 张玉春, 李晓芳, 王卫平, 贺玲, 高珊珊, 李永欣. 河南食管癌高低发区人群食管上皮p53变化和细胞增生状况的比较研究.
新消化病学杂志, 1997；5(4)：221-222
食管癌流行病学的一个显著特征是明显的地域分布差异.高、低发区发病率可相差数百倍[1].食管上皮癌变被认为是一种多阶段进行性过程，其高危人群的早期异常特征形态 学上表现为食管上皮基底层细胞过度增生、间变和原位癌.然而对食管癌变的分子生物学基础 至今了解甚少.与食管癌变有关的一个重要的可能性分子生物学改变是肿瘤抑制基因P53的变 化[2].在食管癌发生率低的美国非癌患者食管上皮不同病变阶段P53免疫阳性细胞数和P53蛋白聚集的发生率明显低于中国食管癌高发区人群[3].本研究旨在进一步 比较河南高发区和低发区居民食管上皮P53蛋白水平的变化及其与细胞增生的关系，加深对 食管癌发生的分子生物学基础的认识.
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1 对象和方法
1.1 对象 河南食管癌高发区林县及辉县居民220例和河南食管癌低发区范县居民 50例.食 管组织均来自食管粘膜活检.食管组织迅速经80%酒精固定，常规组织学处理，切片用于组织病理学诊断和免疫组化分析.
1.2 组织病理学检查 组织诊断标准见文献[4].根据组织结构和 细胞形态，将食管上皮分为正常、基底细胞增生和间变.
1.3 免疫组织化学 ①试剂：PC10为鼠单克隆抗体(DAKO，USA).Ab6为 鼠单克隆抗人P53蛋白抗体(Oncogen Science Inc.USA).ABC试剂盒和DAB底物试剂盒(Vector USA).2%牛冻干血清白蛋白(BSA，Sigma).②实验步骤：采用卵白素生物素辣根过氧化氢 酶复合物(ABC)法，主要步骤如下：①切片脱蜡至水，0.1%过氧化氢室温孵育20 min；②正常马血清(1∶50)室温 孵育20min封闭非特异性免疫球蛋白；③2% BSA 稀释Ab6至1∶1000，稀释PC10 1∶200， 至孵育12h(4℃)；④生物素标记的第2抗体1∶200稀释(2%BSA)，室温孵育45min；⑤ABC室温下孵育60min(使用前30min配制)；⑥DAB和过氧化氢混合液孵育2min～5min,显微镜下观察.本实验采用生产第2抗体的正常动物血清封闭非特异性免疫球蛋白反应和省略孵育第1抗体作阴性对照实验.免疫组化阳性细胞定量方法见参考文献[5]，首先在镜下选择切片平展，细胞组织结构清楚，染色均匀的组织进行上皮的长度、厚度和面积的形态学测量，在40倍光镜下计数切片中所有免疫阳性细胞，并记录单位面积免疫阳性细胞数.
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统计学分析 所有数据输入Power Macintosh 7100型计算机进行Wilcoxon rank-Sum 检验和X2检验.
2 结果在220例高发区人群食管粘膜活检组织中共发现24例正常上皮，161例基底细胞增生和35例间变患者.在50例低发区人群食管活检组织中共发现23例正常上皮，21例基底细胞增生和6例间变组织.高、低发区人群食管上皮细胞均出现不同程度PCNA阳性表达，且随病变的进展，出现不同程度的升高趋势.高发区人群从正常基底细胞增生间变，PCNA阳性细胞数出现明显升高(表1).低发区人群从正常基底细胞增生，PCNA阳性细胞数升高不明显，但从基底细胞增生间变，PCNA阳性细胞数出现明显升高(P<0.01,Wilcoxon rank-sum检验，表1).高、低发区人群食管上皮细胞虽然均出现P53阳性表达，但高发区人群从正常上皮基底细胞增生间变，P53阳性细胞数快速升高，差异有显著性(表1).低发区人群中随病变加重，P53阳性细胞数却未观察到有升高趋势，且P53阳性细胞数低于高发区人群.
, 百拇医药
表1 高、低发区人群各类食管上皮P53和PCNA的免疫组化结果(中位数)
, http://www.100md.com
3 讨论作者发现，在食管癌高发区非癌患者的上皮基底细胞增生和间变阶段已出现明显的P53肿瘤 抑制基因蛋白的变化[4].本研究结果显示，高、低发区人群PCNA的免疫阳性细胞 数均 呈升高趋势.高发区人群P53蛋白免疫阳性细胞数从正常上皮到间变都呈现快速升高，而低发 区人群P53免疫阳性细胞数无升高趋势，且低于高发区人群. 人肿瘤抑制基因P53位于染色体17P13上，有11个外显子，约15000个碱基对.它的编码产物是 一种393个氨基酸的细胞核蛋白，Mr 53000，该基因也因此而得名.P53蛋白产物对细胞增生 有重要的调节作用，突变的P53基因蛋白产物不但失去正常的抑制细胞增生的作用，且部分 具有使细胞转化的癌基因作用[6].野生型P53蛋白半衰期短(<1h),且含量低，用免 疫组化的方法常不能测出来，而突变型P53蛋白半衰期明显延长(20h左右)，且更稳定，可以 用免疫组化方法检测.作者的结果表明食管癌高发区非癌患者癌前病变已有明显的P53表达， 且阳性细胞数随病变的进展而明显升高.与此相反，低发区居民的食管上皮P53蛋白聚集的阳性细胞数随病变进展无升高趋势.提示P53蛋白的变化可能是食管癌发病中的一个重要分子学改变.高、低发区人群P53变化的差异，不但有助于加深对P53基因变化在食管癌变中的作用的了解，而且这种分子学变化的差异对食管癌明显的地域分布差异提供了可能的病因学和发病学的解释.
, http://www.100md.com
4 参考文献1 Cook Mozaffari P.The epidemiology of cancer of the esophagus.Nutr Cancer,1979;1(1):51-55
2 Takashi W,Ichio S,Masayuki I,et al.Loss of 17p,mutation of the p53 gene,and overexpression of
p53 protein in esophageal squamous cell carcinomas.Cancer Res,1993;53(4):846-850
3 王立东，周琦，邢莹，等.中国和美国人食管上皮肿瘤抑制基因P53变化与细胞增生关系的比较研究.
, http://www.100md.com 河南医科大学学报，1995；30(2):121-124
4 Wang LD,Hong JY,Qiu SL,et al.Accumulation of p53 protein in human esophageal precancerous lesions: a prossible early biomarker
for carcinogenesis.Cancer Res,1993;53(8):1783-1787
5 Wang LD,Stephanie TS,Zhou Q,et al.Changes in p53 and cyclin D1 protein levels and cell proliferation in different stages of human
esophageal and gastriccardia carcinogenesis.Int J Cancer,1994;59(2):514-519
6 Greenblatt MS,Bennet WP,Hollstein M,et al.Mutations in the p53 tumor suppressor gene:clues to cancer etiology and molecular
pathogenesis.Cancer Res,1994;54(18):4855-4878, 百拇医药(王立东 周琦 张玉春 李晓芳 王卫平 贺玲 高珊珊 李永欣)
2河南范县人民医院
*国家教委优秀青年教师基金 河南省杰出青年科学基金资助项目(No.951200134).
项目负责人 王立东,河南医科大学癌症研究室 河南省郑州市 450052
收搞日期 1996-04-22
p53 alterations and cell proliferation in esophageal epithelia among subjects from high and low incidence areas of esophageal cancer
, 百拇医药
Li-Dong Wang1, Qi Zhou1, Yu-Chun Zhang2, Xiao-Fang Li1, Wen-Ping Wang2, Ling He2, Shan-Shan Gao1 and Young-Xin Li1
1 Laboratory for Cancer Research,Henan Medical University,Zhengzhou 450052,Henan Province,China
2 Fanxian People's Hospital,Fanxian County
AbstractAIM To study p53 alteration and cell proliferation in esopha geal epithelia in high and lowincidence areas for esophageal cancer in Henan Province to understand their molecular basis.
, 百拇医药
METHODS Esophageal endoscopic mucosa biopsies and histopatholog ical examinations were performed on 220 subjects from highincidence areas and 50 subjects from lowincidence areas of esophageal cancer in Henan Province.The esophageal epithelia was diagnosed as normal,basal cell hyperplasia and dysplasia based on the cell morphology and tissue structure.Immunohistochemistry (ABC method)was applied to analyze the P53 alteration and proliferating cell nuclear antigen (PCNA) in the normal epithelia and the epithelia with different severities of lesions.The immunostaining positive cells of P53 and PCNA were counted.
, http://www.100md.com
RESULTS Positive immunostains for P53 and PCAN were observed i n esophageal epithelial cell nuclei in individuals both from the high and low-inc idence areas.The number of PCNA positive cells in the esophageal epithelia gradually increased with lesions worsening in the high and lowincidence areas.In high incidence areas,the number of P53 protein immunostaining positive cells was higher than that in lowincidence areas,and rapidly increased with lesion progressing.P53 alteration was correlated with PCNA,and increased with the lesions progressing.
, http://www.100md.com
CONCLUSION The number of p53 and PCNA positive cells both incre ased.p53 alteration was higher in subjects from highincidence areas of esophageal cancer than those from lowincidence areas.These results may shed a light on the molecular basis for the geographic distribution of esophageal cancer.
Subject headings Esophageal neoplasms/pathology Genes,p53; Esophagus/pathology
Wang LD, Zhou Q, Zhang YC, Li XF, Wang WP, He L, Gao SS, Li YX. p53 alterations and cell proliferation in esophageal epithelia among subjects from high and low incidence areas of esophageal cancer. Xin Xiaohuabingxue Zazhi, 1997；5(4)：221-222
, 百拇医药
摘 要
目的 探讨食管癌高、低发区人群食管上皮肿瘤抑制基因p53的变化及其与细胞增生状况的关系，以了解食管癌变的分子学基础.
方法 食管癌高发区居民220例和低发区居民50例分别进行食管内镜检查、粘膜活检和组织病理学检查.根据细胞和组织形态结构区分为正常、基底细胞增生和间变，并采用免疫组化ABC法分析各级病变和正常上皮P53蛋白及细胞增生核抗原(PCNA)的改变，并计数上皮单位面积内P53和PCNA阳性细胞数，进行定量比较研究.
结果 河南高、低发区人群食管上皮细胞均出现不同程度的P53和PCNA的变化.高、低发区居民食管正常上皮和病变组织PCNA免疫阳性细胞数和高发区P53阳性细胞数随病变加重呈升高趋势.但是，低发区居民食管上皮P53阳性细胞数却无此现象.
, http://www.100md.com
结论 肿瘤抑制基因P53的变化和PCNA改变有明显关系，均随病变的进展而升高.高发区居民食管各级病变P53改变明显高于低发区居民，此结果有助于对食管癌地域性分布差异的分子学基础的了解.
主题词 食管肿瘤/病理学;基因，p53;食管/病理学
王立东, 周琦, 张玉春, 李晓芳, 王卫平, 贺玲, 高珊珊, 李永欣. 河南食管癌高低发区人群食管上皮p53变化和细胞增生状况的比较研究.
新消化病学杂志, 1997；5(4)：221-222
食管癌流行病学的一个显著特征是明显的地域分布差异.高、低发区发病率可相差数百倍[1].食管上皮癌变被认为是一种多阶段进行性过程，其高危人群的早期异常特征形态 学上表现为食管上皮基底层细胞过度增生、间变和原位癌.然而对食管癌变的分子生物学基础 至今了解甚少.与食管癌变有关的一个重要的可能性分子生物学改变是肿瘤抑制基因P53的变 化[2].在食管癌发生率低的美国非癌患者食管上皮不同病变阶段P53免疫阳性细胞数和P53蛋白聚集的发生率明显低于中国食管癌高发区人群[3].本研究旨在进一步 比较河南高发区和低发区居民食管上皮P53蛋白水平的变化及其与细胞增生的关系，加深对 食管癌发生的分子生物学基础的认识.
, http://www.100md.com
1 对象和方法
1.1 对象 河南食管癌高发区林县及辉县居民220例和河南食管癌低发区范县居民 50例.食 管组织均来自食管粘膜活检.食管组织迅速经80%酒精固定，常规组织学处理，切片用于组织病理学诊断和免疫组化分析.
1.2 组织病理学检查 组织诊断标准见文献[4].根据组织结构和 细胞形态，将食管上皮分为正常、基底细胞增生和间变.
1.3 免疫组织化学 ①试剂：PC10为鼠单克隆抗体(DAKO，USA).Ab6为 鼠单克隆抗人P53蛋白抗体(Oncogen Science Inc.USA).ABC试剂盒和DAB底物试剂盒(Vector USA).2%牛冻干血清白蛋白(BSA，Sigma).②实验步骤：采用卵白素生物素辣根过氧化氢 酶复合物(ABC)法，主要步骤如下：①切片脱蜡至水，0.1%过氧化氢室温孵育20 min；②正常马血清(1∶50)室温 孵育20min封闭非特异性免疫球蛋白；③2% BSA 稀释Ab6至1∶1000，稀释PC10 1∶200， 至孵育12h(4℃)；④生物素标记的第2抗体1∶200稀释(2%BSA)，室温孵育45min；⑤ABC室温下孵育60min(使用前30min配制)；⑥DAB和过氧化氢混合液孵育2min～5min,显微镜下观察.本实验采用生产第2抗体的正常动物血清封闭非特异性免疫球蛋白反应和省略孵育第1抗体作阴性对照实验.免疫组化阳性细胞定量方法见参考文献[5]，首先在镜下选择切片平展，细胞组织结构清楚，染色均匀的组织进行上皮的长度、厚度和面积的形态学测量，在40倍光镜下计数切片中所有免疫阳性细胞，并记录单位面积免疫阳性细胞数.
, http://www.100md.com
统计学分析 所有数据输入Power Macintosh 7100型计算机进行Wilcoxon rank-Sum 检验和X2检验.
2 结果在220例高发区人群食管粘膜活检组织中共发现24例正常上皮，161例基底细胞增生和35例间变患者.在50例低发区人群食管活检组织中共发现23例正常上皮，21例基底细胞增生和6例间变组织.高、低发区人群食管上皮细胞均出现不同程度PCNA阳性表达，且随病变的进展，出现不同程度的升高趋势.高发区人群从正常基底细胞增生间变，PCNA阳性细胞数出现明显升高(表1).低发区人群从正常基底细胞增生，PCNA阳性细胞数升高不明显，但从基底细胞增生间变，PCNA阳性细胞数出现明显升高(P<0.01,Wilcoxon rank-sum检验，表1).高、低发区人群食管上皮细胞虽然均出现P53阳性表达，但高发区人群从正常上皮基底细胞增生间变，P53阳性细胞数快速升高，差异有显著性(表1).低发区人群中随病变加重，P53阳性细胞数却未观察到有升高趋势，且P53阳性细胞数低于高发区人群.
, 百拇医药
表1 高、低发区人群各类食管上皮P53和PCNA的免疫组化结果(中位数)
| 组织类型 | PCNA | |||||||
| n | 阳性细胞数/mm2 | n | 阳性细胞数/mm2 | |||||
| 高 | 低 | 高 | 低 | 高 | 低 | 高 | 低 | |
| 正常 | 18 | 23 | 133(56,274) | 250(22，1028) | 24 | 23 | 32(10，380) | 27(8,94) |
| 基底细胞增生 | 125 | 21 | 265(42，946) | 255(25，2286) | 161 | 21 | 73(4，286) | 27(3，84) |
| 间变 | 28 | 6 | 743(151，2769) | 494(313，909) | 35 | 6 | 185(21，3529) | 27(9，84) |
, http://www.100md.com
3 讨论作者发现，在食管癌高发区非癌患者的上皮基底细胞增生和间变阶段已出现明显的P53肿瘤 抑制基因蛋白的变化[4].本研究结果显示，高、低发区人群PCNA的免疫阳性细胞 数均 呈升高趋势.高发区人群P53蛋白免疫阳性细胞数从正常上皮到间变都呈现快速升高，而低发 区人群P53免疫阳性细胞数无升高趋势，且低于高发区人群. 人肿瘤抑制基因P53位于染色体17P13上，有11个外显子，约15000个碱基对.它的编码产物是 一种393个氨基酸的细胞核蛋白，Mr 53000，该基因也因此而得名.P53蛋白产物对细胞增生 有重要的调节作用，突变的P53基因蛋白产物不但失去正常的抑制细胞增生的作用，且部分 具有使细胞转化的癌基因作用[6].野生型P53蛋白半衰期短(<1h),且含量低，用免 疫组化的方法常不能测出来，而突变型P53蛋白半衰期明显延长(20h左右)，且更稳定，可以 用免疫组化方法检测.作者的结果表明食管癌高发区非癌患者癌前病变已有明显的P53表达， 且阳性细胞数随病变的进展而明显升高.与此相反，低发区居民的食管上皮P53蛋白聚集的阳性细胞数随病变进展无升高趋势.提示P53蛋白的变化可能是食管癌发病中的一个重要分子学改变.高、低发区人群P53变化的差异，不但有助于加深对P53基因变化在食管癌变中的作用的了解，而且这种分子学变化的差异对食管癌明显的地域分布差异提供了可能的病因学和发病学的解释.
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4 参考文献1 Cook Mozaffari P.The epidemiology of cancer of the esophagus.Nutr Cancer,1979;1(1):51-55
2 Takashi W,Ichio S,Masayuki I,et al.Loss of 17p,mutation of the p53 gene,and overexpression of
p53 protein in esophageal squamous cell carcinomas.Cancer Res,1993;53(4):846-850
3 王立东，周琦，邢莹，等.中国和美国人食管上皮肿瘤抑制基因P53变化与细胞增生关系的比较研究.
, http://www.100md.com 河南医科大学学报，1995；30(2):121-124
4 Wang LD,Hong JY,Qiu SL,et al.Accumulation of p53 protein in human esophageal precancerous lesions: a prossible early biomarker
for carcinogenesis.Cancer Res,1993;53(8):1783-1787
5 Wang LD,Stephanie TS,Zhou Q,et al.Changes in p53 and cyclin D1 protein levels and cell proliferation in different stages of human
esophageal and gastriccardia carcinogenesis.Int J Cancer,1994;59(2):514-519
6 Greenblatt MS,Bennet WP,Hollstein M,et al.Mutations in the p53 tumor suppressor gene:clues to cancer etiology and molecular
pathogenesis.Cancer Res,1994;54(18):4855-4878, 百拇医药(王立东 周琦 张玉春 李晓芳 王卫平 贺玲 高珊珊 李永欣)