高渗枸橼酸腺嘌呤液灌注对猪胰腺泡细胞
1南京医科大学第一附属医院肝胆外科 江苏省南京市 210029
2徐州市第四医院普通外科(研究生) 江苏省南京市 221009
3南京大学配位化学国家重点实验室 江苏省南京市 210008
*江苏省教委基金赞助项目，No. 95060.
刘训良，男，1938-12-05生，江苏省南京市人，汉族. 1963年南京医科大学医疗系毕业，普通外科主任医师，教授，硕士、博士生导师. 主要从事胰腺疾病的诊治研究，发表论文25篇，参编全国高等医学院校高护系系列教材(普外部分).
项目负责人 刘训良,江苏省南京市堂子街68号606室.
, 百拇医药
Tel: 025-6614476.收搞日期 1997-02-01
Effect of hypertonic citrate adenine solution perfusion on intracellular free calcium in pig panereatic acinus cells
Xun_Liang Liu1, Huai_Xin Cui1,2, Ze_Kuan Xu1, Zhu_Yin Qian1, Cun_Cai Dai1, Hua Liu1 and Jin_Xi Wang3
1Department of Hepatobiliary Pancreatic Surgery, The First Affiliated Hospital, Nanjing Medical University, Nanjing 210029, China
, 百拇医药
2Department of General Surgery, Xuzhou 4th Hospital, Xuzhou 221009, China
3State Key Laboratory of Coordination Chemistry, Nanjing University, Nanjing 210008, China
Abstract
AIM To study the effect of hypertonic citrate adenine solution (HCA) perfusion on intracellular free calcium in pig pancreatic acinus cells.
METHODS Intracellular free calcium concentration was measured with Fura_2 pre_ and post_HCA perfusion in pig pancreatic (n=8) acinus cells using AR_CM_MIC cation measurement system.
, http://www.100md.com
RESULTS Intracellular free calcium concentrations pre_and post_HCA perfusion in pig pancreatic acinus cells/10-7mol/L were 1.337±0.089 and 1.851±0.191, respectively (P<0.01).
CONCLUSION After HCA perfusion, intracellular free calcium in pig pancreatic acinus cells is increased.
Subject headings pancreas transplantation; citrates/pharmacology; adenine/pharmacology; pancreas/drug effects; calcium/metabolism
, http://www.100md.com
摘 要目的 探讨高渗枸橼酸腺嘌呤液(HCA)灌注对猪胰腺泡细胞[Ca2+]i的影响.
方法 以Furz_2为细胞内钙离子的荧光探剂，采用精密的AR_GM_MIC阳离子测定系统，检测HCA灌注肖后猪胰(n=8)腺泡细胞[Ca2+]i的变化.
结果 HCA灌注后猪腺泡细胞[Ca2+]i/107mol/L为1.851±0.191，HCA灌注前猪胰腺泡细胞[Ca2+]i为1.337±0.089(P<0.01).
结论 HCA灌注使猪胰腺泡细胞[Ca2+]i升高.
, http://www.100md.com
主题词 胰腺移植； 柠檬酸盐类/药理学； 腺嘌呤/药理学； 胰腺/药物作用； 钙/代谢
刘训良,崔怀信,徐泽宽,钱祝银,戴存才,刘华,王金唏.高渗枸橼酸腺嘌呤液灌注对猪胰腺泡细胞.新消化病学杂志,1997;5(9):560-561
高渗枸橼酸腺嘌呤液(Hypertonic citrate adenine solution, HCA),是临床肾移植常用的 保存液. Ca2+作为生理活性物质，对细胞的代谢和功能有重要的调节作用.几乎涉及到细胞的所有生理生化过程. 本试验应用HCA灌注猪胰腺，采用精密的AR_CM_MIC阳离子测定 系统(美国SPEX公司生产)检测猪胰单个腺泡细胞的胞内游离钙浓度(intracellular free ca lcium, [Ca2+]i)，了解HCA灌注对猪胰腺泡细胞[Ca2+]i的影响.
, 百拇医药
1 材料和方法1.1 材料 杂种猪8只，体重10Kg～15Kg，雄雄兼用. HCA购自上海市中心血站(500ml HCA加20ml利多卡因和4ml盐酸川芎嗪). Fura_2/AM，胰蛋白酶，EGTA,ionomysin均购自Sigma公司. Furz_1/AM用DMSO配成0.25mmol/L储备液，-20℃避光保存. EGTA和ionomysin用DMSO配成1mmol/L储备液，低温保存. Hepes为进口分装(上海市生化试剂商店).
1.2 方法 ①灌注方法：采用原位胰、肾联合灌注方式，方法参照多器官联合灌注切取[1]. ②腺泡细胞的分离与负载：胰腺泡细胞分离方法参照Padfield等[2]. 37℃恒温下，将分离的腺泡细胞与Fura_2/AM孵育(终浓度为2μmol/L)30min后，细胞悬液以1000r/min离心5min，弃上液，用hepes 液洗涤2次后，将细胞再以Hepes液悬浮，即完成细胞的负载. ③AR_CM_MIC阳离子测定系统及[Ca2+]i测定：AR_CM_MIC阳性离测定系统由激发光源，倒置荧光显微镜，检测系统，计算机和成像系统五个部分组合而成. 收集的数据可经计算机自动处理. Fura_2有两种形式：Fura_1/AM和Fura_2. 前者能通过细胞膜，但不与Ca 2+结合；后者不能通过细胞膜但能与Ca2+结合，细胞负载后，Fura_2/AM入细胞，在胞内酯酶作用下水解为Fura_2,与Ca2+结合成Fura_2_Ca2+，较Fura_2荧光增强，且激发波长从380nm移至340nm，相应于380nm处荧光减弱. [Ca2+]i计算参照Grynkiewicz等[3]. 测定于负载后2h内完成. 每只动物测5个细胞，取其平均值. 统计学处理 实验结果以x±s表示，采用t检验.
, 百拇医药
2 结果HCA灌注(n=8)前[Ca2+]i/10-7mol/L为1.337±0.089，而HCA灌注后[Ca2+]i为1.851±0.191(P<0.01). HCA灌注使猪胰腺泡细胞[Ca2+]i升高非常明显.
3 讨论HCA是仿细胞内液型保存液，临床肾移植中广泛使用，Ca2+是重要的生理物质，不仅在正常细胞中起重要作用，而且与许多病理状态有关.[Ca2+]i过度 增高可导致细胞死亡. 大量文献[4～6]报道认为：肝细胞的损害与[Ca2+]i升高密切相关. 而对胰腺损害与[Ca2+]i升高关系的研究报道未见. 采用AR_CM_MIC阳离子测定系统，以Fura_2为钙荧光探针，测定HCA灌注前后，猪胰腺泡细胞[Ca2+]i的变化，结果显示：HCA灌注后，猪胰腺泡细胞[Ca2+]i比灌注前增高(P<0.01).可能导致[Ca2+]i升高有以下原因：①能量代谢障碍：供移植物离体乏氧，底物供 应缺乏及利用障碍，致ATP生成减少，继而影响跨膜离子的运输[4,5]. 正常细胞膜上Na+_K+_ATP酶和Ca2+-ATP酶在依赖ATP的条件下可泵出胞内的Na+,Ca2+，转入K+，以维持内环境的稳定. ATP缺乏后导致该作用减弱，Na+，Ca2+入细胞，K+出细胞. Cl-顺浓度入细胞，带入水，致细胞水肿；同时由于Na+_K+_ATP酶和Ca2+-ATP酶失活，从而激活细胞膜上的Na+/Ca2+交换蛋白，Ca2+在细胞浆内和 线粒体内储留[6]. ②细胞内Na+升高：Na+势能下降，刺激Ca2+内流[4]. ③氧自由基损伤：缺氧时，氧自由基产生增加，破坏细胞膜上的Ca2+-ATP酶，导致[Ca2+]i升高[7]. ④pH值下降：乏氧代谢导致酸中毒时,pH值下降，可促进细胞内钙以游离Ca2+形式释放. [Ca2+]i升高后，可干扰线粒体氧化磷酸化作用，使ATP生成更减少，尚可激活钙依赖性酶[4]， 最终导致细胞不可逆损伤. 由此可见，[Ca2+]i升高在 细胞损伤中起着重要的始动作用. 我们采用HCA灌注猪胰腺，研究灌注前后猪胰腺组织形态 学及Na+_K+_ATP酶、Ca2+-ATP酶的变化：猪胰腺组织的光镜观察未见明显细胞水 肿，空泡化等，而Na+_K+_ATP酶和Ca2+-ATP酶均下降，总ATP酶升高. 说明组织损伤后的生化指标变化早已形态学变化. [Ca2+]i可作为胰腺组织损伤的早期指标.肝缺血前投入钙离子拮抗剂异搏定(Verapamil)，能明显减少肝细胞钙内流，减轻缺血再灌注所致的肝细胞损害，改善肝功能[8]. 至于胰腺组织，尚需进一步探讨.
, http://www.100md.com
4 参考文献1 夏穗生主编. 器官移植学. 上海：上海科学技术出版社，1995：94-97
2 Padfield PJ, Panesar N. Ca 2+_dependent amylasesecretion from slopermeabiized rat pancreaticacini requires diffusible cytosolic protein.
Am J Physiol, 1995;269:9647-9652
3 Grynkiewica K, Poenic M, Tsien RY. A newgeneration of Ca 2+ indicators with greatlyimprored fluorescence properties. J Biol Chem,1995;260:3440-3450
, 百拇医药
4 Gasbarrini A, Borle AB, Farghali H, et al. Effect of anoxia on intracellular ATP, Na+ i, Ca2+ i, Mg2+i and cytotoxicity in rat hepatocytes.
J Biol Chem, 1992;267(10):6654-6663
5 Le Couteur DG, Rivary LP, Pond SM, et al. Glucose transport and hypoxia_reoxygenation injury in the perfused rat liver. J Gastroenterol
Hepatol, 1994;9(4):385
6 Shimizu S, Kamiike WM Hatanaka N, et al. Enzymerelease from mitochondria during reoxygenation of the liver. Transplantation,1994;57(1):144
, 百拇医药
7 Uchida M, Takemoto Y, Nagasui N, et al. Calciumin pig livers following ischemia and reperfusion. J Hepatol, 1994;20(6):714
8 Natua R, Jsimoyiannis E, Vribe M, et al. The role of calciumions and calcium channel; entry blockers on expermentic ischemia
reperfusion liver injury. Ann Surg,1991;213(1):137, 百拇医药
2徐州市第四医院普通外科(研究生) 江苏省南京市 221009
3南京大学配位化学国家重点实验室 江苏省南京市 210008
*江苏省教委基金赞助项目，No. 95060.
刘训良，男，1938-12-05生，江苏省南京市人，汉族. 1963年南京医科大学医疗系毕业，普通外科主任医师，教授，硕士、博士生导师. 主要从事胰腺疾病的诊治研究，发表论文25篇，参编全国高等医学院校高护系系列教材(普外部分).
项目负责人 刘训良,江苏省南京市堂子街68号606室.
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Tel: 025-6614476.收搞日期 1997-02-01
Effect of hypertonic citrate adenine solution perfusion on intracellular free calcium in pig panereatic acinus cells
Xun_Liang Liu1, Huai_Xin Cui1,2, Ze_Kuan Xu1, Zhu_Yin Qian1, Cun_Cai Dai1, Hua Liu1 and Jin_Xi Wang3
1Department of Hepatobiliary Pancreatic Surgery, The First Affiliated Hospital, Nanjing Medical University, Nanjing 210029, China
, 百拇医药
2Department of General Surgery, Xuzhou 4th Hospital, Xuzhou 221009, China
3State Key Laboratory of Coordination Chemistry, Nanjing University, Nanjing 210008, China
Abstract
AIM To study the effect of hypertonic citrate adenine solution (HCA) perfusion on intracellular free calcium in pig pancreatic acinus cells.
METHODS Intracellular free calcium concentration was measured with Fura_2 pre_ and post_HCA perfusion in pig pancreatic (n=8) acinus cells using AR_CM_MIC cation measurement system.
, http://www.100md.com
RESULTS Intracellular free calcium concentrations pre_and post_HCA perfusion in pig pancreatic acinus cells/10-7mol/L were 1.337±0.089 and 1.851±0.191, respectively (P<0.01).
CONCLUSION After HCA perfusion, intracellular free calcium in pig pancreatic acinus cells is increased.
Subject headings pancreas transplantation; citrates/pharmacology; adenine/pharmacology; pancreas/drug effects; calcium/metabolism
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摘 要目的 探讨高渗枸橼酸腺嘌呤液(HCA)灌注对猪胰腺泡细胞[Ca2+]i的影响.
方法 以Furz_2为细胞内钙离子的荧光探剂，采用精密的AR_GM_MIC阳离子测定系统，检测HCA灌注肖后猪胰(n=8)腺泡细胞[Ca2+]i的变化.
结果 HCA灌注后猪腺泡细胞[Ca2+]i/107mol/L为1.851±0.191，HCA灌注前猪胰腺泡细胞[Ca2+]i为1.337±0.089(P<0.01).
结论 HCA灌注使猪胰腺泡细胞[Ca2+]i升高.
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主题词 胰腺移植； 柠檬酸盐类/药理学； 腺嘌呤/药理学； 胰腺/药物作用； 钙/代谢
刘训良,崔怀信,徐泽宽,钱祝银,戴存才,刘华,王金唏.高渗枸橼酸腺嘌呤液灌注对猪胰腺泡细胞.新消化病学杂志,1997;5(9):560-561
高渗枸橼酸腺嘌呤液(Hypertonic citrate adenine solution, HCA),是临床肾移植常用的 保存液. Ca2+作为生理活性物质，对细胞的代谢和功能有重要的调节作用.几乎涉及到细胞的所有生理生化过程. 本试验应用HCA灌注猪胰腺，采用精密的AR_CM_MIC阳离子测定 系统(美国SPEX公司生产)检测猪胰单个腺泡细胞的胞内游离钙浓度(intracellular free ca lcium, [Ca2+]i)，了解HCA灌注对猪胰腺泡细胞[Ca2+]i的影响.
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1 材料和方法1.1 材料 杂种猪8只，体重10Kg～15Kg，雄雄兼用. HCA购自上海市中心血站(500ml HCA加20ml利多卡因和4ml盐酸川芎嗪). Fura_2/AM，胰蛋白酶，EGTA,ionomysin均购自Sigma公司. Furz_1/AM用DMSO配成0.25mmol/L储备液，-20℃避光保存. EGTA和ionomysin用DMSO配成1mmol/L储备液，低温保存. Hepes为进口分装(上海市生化试剂商店).
1.2 方法 ①灌注方法：采用原位胰、肾联合灌注方式，方法参照多器官联合灌注切取[1]. ②腺泡细胞的分离与负载：胰腺泡细胞分离方法参照Padfield等[2]. 37℃恒温下，将分离的腺泡细胞与Fura_2/AM孵育(终浓度为2μmol/L)30min后，细胞悬液以1000r/min离心5min，弃上液，用hepes 液洗涤2次后，将细胞再以Hepes液悬浮，即完成细胞的负载. ③AR_CM_MIC阳离子测定系统及[Ca2+]i测定：AR_CM_MIC阳性离测定系统由激发光源，倒置荧光显微镜，检测系统，计算机和成像系统五个部分组合而成. 收集的数据可经计算机自动处理. Fura_2有两种形式：Fura_1/AM和Fura_2. 前者能通过细胞膜，但不与Ca 2+结合；后者不能通过细胞膜但能与Ca2+结合，细胞负载后，Fura_2/AM入细胞，在胞内酯酶作用下水解为Fura_2,与Ca2+结合成Fura_2_Ca2+，较Fura_2荧光增强，且激发波长从380nm移至340nm，相应于380nm处荧光减弱. [Ca2+]i计算参照Grynkiewicz等[3]. 测定于负载后2h内完成. 每只动物测5个细胞，取其平均值. 统计学处理 实验结果以x±s表示，采用t检验.
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2 结果HCA灌注(n=8)前[Ca2+]i/10-7mol/L为1.337±0.089，而HCA灌注后[Ca2+]i为1.851±0.191(P<0.01). HCA灌注使猪胰腺泡细胞[Ca2+]i升高非常明显.
3 讨论HCA是仿细胞内液型保存液，临床肾移植中广泛使用，Ca2+是重要的生理物质，不仅在正常细胞中起重要作用，而且与许多病理状态有关.[Ca2+]i过度 增高可导致细胞死亡. 大量文献[4～6]报道认为：肝细胞的损害与[Ca2+]i升高密切相关. 而对胰腺损害与[Ca2+]i升高关系的研究报道未见. 采用AR_CM_MIC阳离子测定系统，以Fura_2为钙荧光探针，测定HCA灌注前后，猪胰腺泡细胞[Ca2+]i的变化，结果显示：HCA灌注后，猪胰腺泡细胞[Ca2+]i比灌注前增高(P<0.01).可能导致[Ca2+]i升高有以下原因：①能量代谢障碍：供移植物离体乏氧，底物供 应缺乏及利用障碍，致ATP生成减少，继而影响跨膜离子的运输[4,5]. 正常细胞膜上Na+_K+_ATP酶和Ca2+-ATP酶在依赖ATP的条件下可泵出胞内的Na+,Ca2+，转入K+，以维持内环境的稳定. ATP缺乏后导致该作用减弱，Na+，Ca2+入细胞，K+出细胞. Cl-顺浓度入细胞，带入水，致细胞水肿；同时由于Na+_K+_ATP酶和Ca2+-ATP酶失活，从而激活细胞膜上的Na+/Ca2+交换蛋白，Ca2+在细胞浆内和 线粒体内储留[6]. ②细胞内Na+升高：Na+势能下降，刺激Ca2+内流[4]. ③氧自由基损伤：缺氧时，氧自由基产生增加，破坏细胞膜上的Ca2+-ATP酶，导致[Ca2+]i升高[7]. ④pH值下降：乏氧代谢导致酸中毒时,pH值下降，可促进细胞内钙以游离Ca2+形式释放. [Ca2+]i升高后，可干扰线粒体氧化磷酸化作用，使ATP生成更减少，尚可激活钙依赖性酶[4]， 最终导致细胞不可逆损伤. 由此可见，[Ca2+]i升高在 细胞损伤中起着重要的始动作用. 我们采用HCA灌注猪胰腺，研究灌注前后猪胰腺组织形态 学及Na+_K+_ATP酶、Ca2+-ATP酶的变化：猪胰腺组织的光镜观察未见明显细胞水 肿，空泡化等，而Na+_K+_ATP酶和Ca2+-ATP酶均下降，总ATP酶升高. 说明组织损伤后的生化指标变化早已形态学变化. [Ca2+]i可作为胰腺组织损伤的早期指标.肝缺血前投入钙离子拮抗剂异搏定(Verapamil)，能明显减少肝细胞钙内流，减轻缺血再灌注所致的肝细胞损害，改善肝功能[8]. 至于胰腺组织，尚需进一步探讨.
, http://www.100md.com
4 参考文献1 夏穗生主编. 器官移植学. 上海：上海科学技术出版社，1995：94-97
2 Padfield PJ, Panesar N. Ca 2+_dependent amylasesecretion from slopermeabiized rat pancreaticacini requires diffusible cytosolic protein.
Am J Physiol, 1995;269:9647-9652
3 Grynkiewica K, Poenic M, Tsien RY. A newgeneration of Ca 2+ indicators with greatlyimprored fluorescence properties. J Biol Chem,1995;260:3440-3450
, 百拇医药
4 Gasbarrini A, Borle AB, Farghali H, et al. Effect of anoxia on intracellular ATP, Na+ i, Ca2+ i, Mg2+i and cytotoxicity in rat hepatocytes.
J Biol Chem, 1992;267(10):6654-6663
5 Le Couteur DG, Rivary LP, Pond SM, et al. Glucose transport and hypoxia_reoxygenation injury in the perfused rat liver. J Gastroenterol
Hepatol, 1994;9(4):385
6 Shimizu S, Kamiike WM Hatanaka N, et al. Enzymerelease from mitochondria during reoxygenation of the liver. Transplantation,1994;57(1):144
, 百拇医药
7 Uchida M, Takemoto Y, Nagasui N, et al. Calciumin pig livers following ischemia and reperfusion. J Hepatol, 1994;20(6):714
8 Natua R, Jsimoyiannis E, Vribe M, et al. The role of calciumions and calcium channel; entry blockers on expermentic ischemia
reperfusion liver injury. Ann Surg,1991;213(1):137, 百拇医药