HBV侵犯PBMC致线粒体功能改变
西安医科大学第一临床医学院肝炎研究室 陕西省西安市 710061
作者简介 张树林，男，1945-12-06生，吉林省长春市人，汉族. 1969年毕业于北京医科大学，1982年获医学硕士学位，1987年～1988年赴美学习，现任西安医科大学第一临床医学院主任医师、教授. 多年从事病毒性肝炎发病机理及防治研究，发表学术论文84篇，指导硕士研究生10名，辅助指导博士生1名，硕士生6名[陕西省西安市健康路1号. 电话(029)5263596-3262(办)，8214309(宅)].
(收稿 1997-08-01 修回 1997-08-25)
Mitochondrial function changes of peripheral blood mononuclear cells infected with HBV
, http://www.100md.com
ZHANG Shu-Lin, WU Ning-Qiang, LIANG Xue-Song and DI Peng-Chao
Hepatitis Lab, First Clinical College, Xi′an Medical University, Xi′an 710061, Shaanxi Province, China
Subject headings hepatitis B/virology; hepatitis B virus/pathogenity; mitochondrial, liver/pathology; DNA,viral/analysis; polymerase chain reaction
Abstract
, http://www.100md.com AIM To investigate the changes of mitochondrial function of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) infected with HBV.
METHODS Polymerase chain reaction was used to detect HBV DNA in PBMC and the MTT chromatometry was used to determine the mitochondrial function. HBV serum markers, IgM anti-HAV, anti-HCV were tested with radioimmunoassay.
RESULTS Of 58 patients with chronic HBV infection, 31 (53.5%) were positive for HBV DNA in PBMC. The mitochondrial function A(OD 500nm) of HBV DNA positive PBMC (0.05±0.03) was much lower than that in HBV DNA negative PBMC (0.29±0.07)
, http://www.100md.com
(P<0.01).
CONCLUSION In chronic HBV infection patients, PBMCs were often infected with HBV, leading to lowered mitochondrial function. This may be one of the reasons for disturbance of immune function in patients with chronic HBV infection.
主题词 肝炎，乙型/病毒学；肝炎病毒，乙型/致病力；线粒体，肝/病理学；DNA，病毒/分析；聚合酶链反应
中国图书资料分类号 R512.62
摘要
, http://www.100md.com
目的 探讨HBV侵犯外周血单个核细胞(PBMC)后对其线粒体功能的影响.
方法 HBsAg阳性6个月以上，无肝炎症状及体征，肝功正常患者58例. 多聚酶链反应检测PBMC中HBV DNA，噻唑兰(MTT)比色法测线粒体功能. HBsAg、HBeAg检测用固相放免法检测.
结果 慢性HBV感染者58例，PBMC中检出HBV DNA 31例(53.5%)，PBMC中HBV DNA阳性组MTT比色法查线粒体功能的A(OD 500nm)值明显低于HBV DNA阴性组(0.05±0.03 vs 0.29±0.07，P<0.01).
结论 慢性HBV感染时，HBV常侵犯PBMC，并导致PBMC线粒体功能降低、能量代谢异常. 这可为HBV慢性感染免疫功能异常的原因之一.
, 百拇医药
HBV感染慢性化机理复杂，病毒变异与宿主免疫反应决定HBV感染结局. PBMC为免疫细胞群体，已发现HBV可感染PBMC，慢性HBV感染者存在免疫细胞功能异常[1-5]. 线粒体是细胞进行氧化磷酸化，产生ATP的主要场所，每种组织细胞均有其最低ATP需要阈值，低于此值则不能正常生长分裂发挥其正常功能. 业已证实线粒体功能异常参与一些疾病的发生与发展[6]. 笔者以多聚酶链反应(PCR)查PBMC中HBV DNA，采用MTT比色法检测PBMC的线粒体功能，试图探讨HBV对PBMC的侵犯，对PBMC线粒体功能的影响，对乙肝发病机理研究提供新思路.
1 对象和方法
1.1 对象 HBsAg阳性持续6个月以上，无肝病症状及体征、肝功正常者58例为研究对象. 20例HBsAg阴性、肝功正常的医学生作对照. 所有病例IgM抗-HAV、抗-HCV均阴性，二组间年龄、性别构成比无明显差异.
, http://www.100md.com
1.2 方法 无菌采静脉血6ml，2ml不抗凝，分离血清，查HBV血清标志；4ml抗凝，分离PBMC，PCR法查HBV DNA，MTT法检测线粒体功能.MTT比色法检测线粒体功能[7]. PBMC悬液(1×109/L)，50μl，1640培养液400μl加入48孔细胞培养板孔中(Promage)，置37℃，50ml/L CO2培养箱中68h后，每孔加MTT 100μl(2.5g/L)混匀，再继续培养4h. 轻轻弃尽上清，加二甲基亚砜150μl以充分溶解MTT代谢产物甲口替(Formazan)结晶，取此溶液100μl置比色杯中，再加二甲基亚砜2900μl，分光光度仪(4050型)测A(OD 500nm)值，每份标本平行做4个复孔，取A(OD 500nm)均值.PCR法检测PBMC中HBV DNA. PBMC悬液(1×109/L) 50μl，加入裂解液60μl(Tris-EDTA 50μl，pH 8.0；5g/L蛋白酶K 5μl；100g/L SDS 5μl)，55℃水浴1h，95℃ 5min灭活，再以酚：氯仿：异戊醇法抽提DNA作为模板行PCR循环. 引物依HBV基因组S区设计，由上海细胞生物学研究所合成. 引物序列：①5′-CATCTTCTTGTTGGTTCTTCTG-3′(300～321)；②5′-TTAGGGTTTAAATGTATACCC-3′(715～695). 扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳出现416bp条带为HBV DNA阳性.血清HBV标志IgM抗-HAV，抗-HCV均以固相放免法检测(3V诊断试剂公司药盒).
, http://www.100md.com
统计学处理 采用t检验.
2 结果
PBMC中HBV DNA检出情况表1. MTT比色法检测PBMC线粒体功能结果表2. MTT只能被活细胞线粒体分解代谢为甲口替，后者溶于二甲基亚砜在500nm处有最大吸收峰，故A(OD 500nm)值反映线粒体功能.
表1 PBMC中HBV DNA检出情况比较
, 百拇医药
bP<0.01， vs HBeAg-组.
表2 PBMC线粒体功能
bP<0.01， vs 试验组；dP<0.01， vs HBV DNA阴性组.
, 百拇医药
3 讨论
慢性HBV感染时，HBV常侵犯PBMC，与病毒活跃复制有关. HBV为动物嗜肝DNA病毒一员，对肝细胞有着特殊的亲嗜性，然而，业已证实HBV可侵犯多种组织细胞，其中对PBMC侵犯最受关注. 学者们以不同方法证实HBV可感染PBMC并在其中复制[5,8]. 本研究以PCR法自53.5%(31/58)无症状HBV慢性感染者PBMC中检出HBV DNA，并且血清HBeAg阳性组的检出率(84.2%，16/19)明显高于血清HBeAg阴性组(38.5%，15/39，P<0.01)，提示病毒复制水平与PBMC被HBV感染有关.
HBV侵犯PBMC可降低其线粒体功能，可能与机体免疫功能异常有关. 任何组织细胞正常生理功能的维持均依赖足够的能量供应. 线粒体是机体细胞呼吸器，能量供应关键场所，机体完成各种生命活动所需能量的95%由线粒体供给. 许多研究表明，线粒体功能异常可导致细胞活性降低，不能进行正常生命活动而出现临床症状，如慢性充血性心衰、帕金森病、Holt病、进行性脑病(progressive infantile poliodystrophy/Alper′s disease)、糖尿病等[6]. 本结果显示，PBMC中HBV DNA阳性者的线粒体功能明显低于HBV DNA阴性者(A 0.05±0.03 vs 0.29±0.07，P<0.01)，提示HBV侵犯PBMC与线粒体功能降低有关，PBMC能量代谢降低，ATP产生不足，导致PBMC功能异常. 这可能是HBV感染时机体免疫功能异常的原因之一. 然而，PBMC中HBV DNA阴性者的线粒体功能也低于正常对照，因此有必要探讨HBV感染者线粒体功能降低的机理，为慢性乙肝发病机理研究提供新的思路.
, http://www.100md.com
4 参考文献
1 张树林，李义方. 乙型肝炎病毒慢性感染的机理. 国外医学内科学分册，1992；19(8)：343-346
2 张树林，李义方. 宿主免疫反应与病毒变异决定HBV感染结局. 国外医学流行病传染病学分册，1993；20(6)：249-252
3 光丽霞，顾长海. HBV感染的单核细胞分泌TNF-α和PGE2的改变及其意义探讨. 中华传染病杂志，1995；13(4)：204-207
4 刘丽霞. 乙型肝炎患者可溶性白细胞介素2受体的研究. 免疫学杂志，1995；11(1)：68-72
5 Calmus Y, Marcellin P, Beaurain G, et al. Distribution of hepatitis B virus DNA sequences in different peripheral blood
, 百拇医药
mononuclear cell subsets in HBs antigen-positive and negative patients. Eur J Clin Invest, 1994;24(4):548-552
6 Schapira AH, Copper JM, Dexter D, et al. Mitochondrial complex deficiency in Parkinson′s disease. J Neurochem,
1990;54(3):823-827
7 张强，李通，黄延艹延. 过氧化脂质对淋巴细胞线粒体功能和细胞内GSH含量的影响. 中国实验临床免疫学杂志，1994；6(1)：1-4
8 王宝成，李光，杨道理. 聚合酶链反应检测肝癌患者外周血细胞中乙型肝炎病毒的存在. 中华内科杂志，1992；31(1)：90-92, 百拇医药(张树林 吴宁强 梁雪松 狄鹏超)
作者简介 张树林，男，1945-12-06生，吉林省长春市人，汉族. 1969年毕业于北京医科大学，1982年获医学硕士学位，1987年～1988年赴美学习，现任西安医科大学第一临床医学院主任医师、教授. 多年从事病毒性肝炎发病机理及防治研究，发表学术论文84篇，指导硕士研究生10名，辅助指导博士生1名，硕士生6名[陕西省西安市健康路1号. 电话(029)5263596-3262(办)，8214309(宅)].
(收稿 1997-08-01 修回 1997-08-25)
Mitochondrial function changes of peripheral blood mononuclear cells infected with HBV
, http://www.100md.com
ZHANG Shu-Lin, WU Ning-Qiang, LIANG Xue-Song and DI Peng-Chao
Hepatitis Lab, First Clinical College, Xi′an Medical University, Xi′an 710061, Shaanxi Province, China
Subject headings hepatitis B/virology; hepatitis B virus/pathogenity; mitochondrial, liver/pathology; DNA,viral/analysis; polymerase chain reaction
Abstract
, http://www.100md.com AIM To investigate the changes of mitochondrial function of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) infected with HBV.
METHODS Polymerase chain reaction was used to detect HBV DNA in PBMC and the MTT chromatometry was used to determine the mitochondrial function. HBV serum markers, IgM anti-HAV, anti-HCV were tested with radioimmunoassay.
RESULTS Of 58 patients with chronic HBV infection, 31 (53.5%) were positive for HBV DNA in PBMC. The mitochondrial function A(OD 500nm) of HBV DNA positive PBMC (0.05±0.03) was much lower than that in HBV DNA negative PBMC (0.29±0.07)
, http://www.100md.com
(P<0.01).
CONCLUSION In chronic HBV infection patients, PBMCs were often infected with HBV, leading to lowered mitochondrial function. This may be one of the reasons for disturbance of immune function in patients with chronic HBV infection.
主题词 肝炎，乙型/病毒学；肝炎病毒，乙型/致病力；线粒体，肝/病理学；DNA，病毒/分析；聚合酶链反应
中国图书资料分类号 R512.62
摘要
, http://www.100md.com
目的 探讨HBV侵犯外周血单个核细胞(PBMC)后对其线粒体功能的影响.
方法 HBsAg阳性6个月以上，无肝炎症状及体征，肝功正常患者58例. 多聚酶链反应检测PBMC中HBV DNA，噻唑兰(MTT)比色法测线粒体功能. HBsAg、HBeAg检测用固相放免法检测.
结果 慢性HBV感染者58例，PBMC中检出HBV DNA 31例(53.5%)，PBMC中HBV DNA阳性组MTT比色法查线粒体功能的A(OD 500nm)值明显低于HBV DNA阴性组(0.05±0.03 vs 0.29±0.07，P<0.01).
结论 慢性HBV感染时，HBV常侵犯PBMC，并导致PBMC线粒体功能降低、能量代谢异常. 这可为HBV慢性感染免疫功能异常的原因之一.
, 百拇医药
HBV感染慢性化机理复杂，病毒变异与宿主免疫反应决定HBV感染结局. PBMC为免疫细胞群体，已发现HBV可感染PBMC，慢性HBV感染者存在免疫细胞功能异常[1-5]. 线粒体是细胞进行氧化磷酸化，产生ATP的主要场所，每种组织细胞均有其最低ATP需要阈值，低于此值则不能正常生长分裂发挥其正常功能. 业已证实线粒体功能异常参与一些疾病的发生与发展[6]. 笔者以多聚酶链反应(PCR)查PBMC中HBV DNA，采用MTT比色法检测PBMC的线粒体功能，试图探讨HBV对PBMC的侵犯，对PBMC线粒体功能的影响，对乙肝发病机理研究提供新思路.
1 对象和方法
1.1 对象 HBsAg阳性持续6个月以上，无肝病症状及体征、肝功正常者58例为研究对象. 20例HBsAg阴性、肝功正常的医学生作对照. 所有病例IgM抗-HAV、抗-HCV均阴性，二组间年龄、性别构成比无明显差异.
, http://www.100md.com
1.2 方法 无菌采静脉血6ml，2ml不抗凝，分离血清，查HBV血清标志；4ml抗凝，分离PBMC，PCR法查HBV DNA，MTT法检测线粒体功能.MTT比色法检测线粒体功能[7]. PBMC悬液(1×109/L)，50μl，1640培养液400μl加入48孔细胞培养板孔中(Promage)，置37℃，50ml/L CO2培养箱中68h后，每孔加MTT 100μl(2.5g/L)混匀，再继续培养4h. 轻轻弃尽上清，加二甲基亚砜150μl以充分溶解MTT代谢产物甲口替(Formazan)结晶，取此溶液100μl置比色杯中，再加二甲基亚砜2900μl，分光光度仪(4050型)测A(OD 500nm)值，每份标本平行做4个复孔，取A(OD 500nm)均值.PCR法检测PBMC中HBV DNA. PBMC悬液(1×109/L) 50μl，加入裂解液60μl(Tris-EDTA 50μl，pH 8.0；5g/L蛋白酶K 5μl；100g/L SDS 5μl)，55℃水浴1h，95℃ 5min灭活，再以酚：氯仿：异戊醇法抽提DNA作为模板行PCR循环. 引物依HBV基因组S区设计，由上海细胞生物学研究所合成. 引物序列：①5′-CATCTTCTTGTTGGTTCTTCTG-3′(300～321)；②5′-TTAGGGTTTAAATGTATACCC-3′(715～695). 扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳出现416bp条带为HBV DNA阳性.血清HBV标志IgM抗-HAV，抗-HCV均以固相放免法检测(3V诊断试剂公司药盒).
, http://www.100md.com
统计学处理 采用t检验.
2 结果
PBMC中HBV DNA检出情况表1. MTT比色法检测PBMC线粒体功能结果表2. MTT只能被活细胞线粒体分解代谢为甲口替，后者溶于二甲基亚砜在500nm处有最大吸收峰，故A(OD 500nm)值反映线粒体功能.
表1 PBMC中HBV DNA检出情况比较
| 组别 | PBMC中HBV DNA | 阳性率(%) | |
| + | - | ||
| 对照组 | 0 | 20 | 0.0 |
| 实验组 | 31 | 27 | 53.5 |
| HBeAg+ | 16 | 3 | 84.2b |
| HBeAg- | 15 | 24 | 38.5 |
, 百拇医药
bP<0.01， vs HBeAg-组.
表2 PBMC线粒体功能
| 组别 | 线粒体功能A(OD 500nm) |
| 对照组b | 0.50±0.14 |
| 试验组 | |
| PBMC中HBV DNA- | 0.29±0.07 |
| PBMC中HBV DNA+ | 0.05±0.03d |
bP<0.01， vs 试验组；dP<0.01， vs HBV DNA阴性组.
, 百拇医药
3 讨论
慢性HBV感染时，HBV常侵犯PBMC，与病毒活跃复制有关. HBV为动物嗜肝DNA病毒一员，对肝细胞有着特殊的亲嗜性，然而，业已证实HBV可侵犯多种组织细胞，其中对PBMC侵犯最受关注. 学者们以不同方法证实HBV可感染PBMC并在其中复制[5,8]. 本研究以PCR法自53.5%(31/58)无症状HBV慢性感染者PBMC中检出HBV DNA，并且血清HBeAg阳性组的检出率(84.2%，16/19)明显高于血清HBeAg阴性组(38.5%，15/39，P<0.01)，提示病毒复制水平与PBMC被HBV感染有关.
HBV侵犯PBMC可降低其线粒体功能，可能与机体免疫功能异常有关. 任何组织细胞正常生理功能的维持均依赖足够的能量供应. 线粒体是机体细胞呼吸器，能量供应关键场所，机体完成各种生命活动所需能量的95%由线粒体供给. 许多研究表明，线粒体功能异常可导致细胞活性降低，不能进行正常生命活动而出现临床症状，如慢性充血性心衰、帕金森病、Holt病、进行性脑病(progressive infantile poliodystrophy/Alper′s disease)、糖尿病等[6]. 本结果显示，PBMC中HBV DNA阳性者的线粒体功能明显低于HBV DNA阴性者(A 0.05±0.03 vs 0.29±0.07，P<0.01)，提示HBV侵犯PBMC与线粒体功能降低有关，PBMC能量代谢降低，ATP产生不足，导致PBMC功能异常. 这可能是HBV感染时机体免疫功能异常的原因之一. 然而，PBMC中HBV DNA阴性者的线粒体功能也低于正常对照，因此有必要探讨HBV感染者线粒体功能降低的机理，为慢性乙肝发病机理研究提供新的思路.
, http://www.100md.com
4 参考文献
1 张树林，李义方. 乙型肝炎病毒慢性感染的机理. 国外医学内科学分册，1992；19(8)：343-346
2 张树林，李义方. 宿主免疫反应与病毒变异决定HBV感染结局. 国外医学流行病传染病学分册，1993；20(6)：249-252
3 光丽霞，顾长海. HBV感染的单核细胞分泌TNF-α和PGE2的改变及其意义探讨. 中华传染病杂志，1995；13(4)：204-207
4 刘丽霞. 乙型肝炎患者可溶性白细胞介素2受体的研究. 免疫学杂志，1995；11(1)：68-72
5 Calmus Y, Marcellin P, Beaurain G, et al. Distribution of hepatitis B virus DNA sequences in different peripheral blood
, 百拇医药
mononuclear cell subsets in HBs antigen-positive and negative patients. Eur J Clin Invest, 1994;24(4):548-552
6 Schapira AH, Copper JM, Dexter D, et al. Mitochondrial complex deficiency in Parkinson′s disease. J Neurochem,
1990;54(3):823-827
7 张强，李通，黄延艹延. 过氧化脂质对淋巴细胞线粒体功能和细胞内GSH含量的影响. 中国实验临床免疫学杂志，1994；6(1)：1-4
8 王宝成，李光，杨道理. 聚合酶链反应检测肝癌患者外周血细胞中乙型肝炎病毒的存在. 中华内科杂志，1992；31(1)：90-92, 百拇医药(张树林 吴宁强 梁雪松 狄鹏超)