PCR检测原发肝癌YNZ22位点VNTR的杂合性丢失
第三军医大学西南医院消化科 重庆市 400038
杜青书，男 ，1964-08-23生，重庆市合川县人，汉族. 1986年第三军医大学医疗系本科毕业，主治医师，讲师，主要从事消化病诊治研究，发表论文3篇.
项目负责人 杜青书，400038，第三军医大学西南医院消化科，重庆市沙坪坝区高滩岩正街1号 Correspondence to Dr. Qing-Shu Du, Department of Gastroenterology, Southwest Hospital, Third Military Medical University, 1 Gaotanyan Zhengjie, Shapingba District, Chongqing 400038, China
Tel. +86·23·65318301-73094
, 百拇医药
收稿日期 1997-09-23 接收日期 1997-10-29
PCR detection of heterozygosity loss at YNZ22 locus containing VNTR segment in hepatocellular carcinoma
Qing-Shu Du, Dian-Chun Fang, Yuan-Hui Luo and Wei-Wen Liu
Department of Gastroenterology, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China
, 百拇医药
Abstract
AIM To evaluate the role of heterozygosity (LOH) loss at YNZ22 locus in the development of hepatocellular carcinoma.
METHODS Polymorphic analysis of YNZ22 locus that contains a variable number of tandem repeat (VNTR) was performed in 35 surgically resected specimens of hepatocellular carcinomas and adjacent normal tissues by the polymerase chain reaction (PCR).
, 百拇医药
RESULTS Constitutional heterozygosity (informative) was found in 25/35 (71.4%) of hepatocellular carcinomas. Loss of heterozygosity (LOH) at YNZ22 locus was detected in 48.0% of informative cases. No significant difference existed between LOH at YNZ22 and serum levels of HBsAg and AFP,histological grades, tumor size and distant metastasis (P>0.05).
CONCLUSION LOH at YNZ22 locus is a common change in hepatocellular carcinomas and may be involved in carcinogenesis of hepatocellular cancer.
, http://www.100md.com
Subject headings liver neoplasms/genetics; chromosomes, human, pair 17;
minisatellite repeats; heterzygote; chromosome deletion
Du QS, Fang DC, Luo YH, Liu WW. PCR detection of heterozygosity loss at YNZ22 locus containing VNTR segment in hepatocellular carcinoma. Huaren Xiaohua Zazhi,1998;6(2):131-132
摘要
目的 探讨YNZ22位点串联重复序列(VNTR)的杂合性丢失在原发肝癌发生发展中的作用.
, 百拇医药
方法 应用多聚酶链反应(PCR)技术扩增35例原发肝癌和正常肝组织YNZ22位点的VNTR区，对原发肝癌的杂合缺失进行分析.
结果 原发肝癌35例，属信息个体25例，占71.4%. 信息个体中25例检出YNZ22位点杂合缺失(LOH)12例，杂合缺失率为48.0%.分析LOH与临床病理参数间的关系发现，原发肝癌YNZ22位点杂合缺失与血清HBsAg和AFP水平、组织学分级、肿瘤大小及远处转移无关.
结论 YNZ22位点杂合缺失是原发肝癌的常见改变，可能参与了原发肝癌的发生与发展.
主题词 肝肿瘤/遗传学；染色体，人，17对；小卫星重复；杂合子；染色体缺失
杜青书, 房殿春, 罗元辉, 刘为纹.PCR检测原发肝癌YNZ22位点VNTR的杂合性丢失.华人消化杂志,1998;6(2):131-132
, http://www.100md.com
0 引言
恶性肿瘤经常发生特定染色体区域的丢失，染色体17p的某些位点是最常见的丢失区域之一[1]. 数目可变的串联重复序列(variable number of tandem repeat, VNTR)为一类新的遗传标记，以同一短序列重复串联为特征[2]. 近年，在染色体17p13.3(YNZ22) 发现了VNTR区，由于该区域与抑癌基因p53基因连锁，并具有多态的性质，因此常被作为标记基因用于肿瘤杂合性丢失(Loss of heterozygosity, LOH)的研究. 作者采用多聚酶链反应(PCR)扩增YNZ22位点的VNTR片段，对肝细胞癌(HCC)的LOH进行分析.
1 材料和方法
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1.1 材料 我院1994-06/1996-06手术切除HCC标本35例，手术切下后立即收集癌组织和手术切缘处的正常组织，剔除出血、坏死部分，-80℃冻存. 按文献方法提取基因组DNA[3]. 冰冻切片染色证实所检测癌组织肿瘤细胞数均在50%以上.
1.2 PCR扩增 取1μg组织DNA，加入20μl PCR反应液中(含10mmol/L Tris-HCl，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2, 12.5pmol/L 上游及下游引物；dATP，dTTP,dCTP和dGTP各200μmol/L，以及Taq DNA聚合酶2U)，PCR扩增仪上扩增，反应条件：于95℃保温5min后，94℃变性40s，56℃复性40s,72℃ 延伸60s，循环35次.最后一个循环后，试管仍置72℃继续反应10min. 所用VNTR片段扩增引物由中国科学院上海细胞生物研究所合成，YNZ22(17p13.3)引物序列如下[4]：5′-CACAGTCTTTATTCTTCAGCG-3′5′-CGAAGAGTGAAGTGCACAGG-3′
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1.3 VNTR的PCR分析 取扩增产物10μl，30g/L琼脂糖凝胶进行电泳分离，溴乙锭染色，紫外光下观察并照相. 正常组织经电泳分离如显现两条电泳带者(170bp～780bp)为杂合子(信息个体)，若仅为一条带者为纯合子(非信息个体). 对信息个体癌组织DNA以同样的引物进行PCR分析，比较同一个体癌组织及正常组织DNA扩增片段大小及量的差异，就可推算出是否存在LOH.
2 结果
2.1 PCR分析 HCC组织VNTR HCC 35例，组织DNA经PCR分析，YNZ22(17p13.3)位点属信息个体25例，检出LOH 12例，占信息个体的48.0%(图1).
图1 PCR检测原发肝癌YNZ22位点VNTR的杂合性丢失M：分子量标志； N：正常组织； T：肿瘤组织.
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例1为杂合子；例2为杂合缺失；例3为纯合子(非信息个体)
表1 YNZ22位点的LOH与临床病理参数的关系
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2.2 LOH与临床病理参数 将25例HCC信息个体按血清HBsAg和AFP水平、有无肝硬变、肿瘤分化程度、大小和有无肝外转移的不同进行分组，YNZ22位点LOH率在各组间均无显著差异(P>0.05，表1).
3 讨论
HCC的发生发展是一个涉及到多种遗传物质改变的复杂过程，它至少涉及到癌基因N-ras,C-myc，抑癌基因p53和Rb的异常. 作者采用PCR技术，对HCC YNZ22位点中VNTR的多态性进行分析，观察到YNZ22位点的LOH率为48.0%. 结果提示，YNZ22位点LOH是HCC的常见改变，可能参与了HCC的发生、发展YNZ22位于人类第17号染色体短臂17P13.3p53基因远端，是由70bp的重复单位组成的串联重复序列[4]. 由于YNZ22与p53基因连锁，故常常用此位点LOH来代表p53基因的LOH. 近年研究发现，虽某些个体p53基因正常，但YNZ22却有LOH，提示该位点可能存在尚未克隆出来的抑癌基因[5]. YNZ22的VNTR呈现高度多态性，YNZ22的群体杂合率为86%[2]，本组为71.4%. 通过分析，YNZ22 LOH与临床病理参数的关系显示，YNZ22 LOH与血清HBsAg和AFP水平、组织学分级、肿瘤大小及肝外转移之间并无显著相关关系.
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以往检测YNZ22位点的LOH多采用限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)分析，本文采用PCR技术，选择VNTR两侧的序列合成引物，对DNA靶序列进行扩增，然后通过凝胶电泳，溴乙锭染色扩增片段，对VNTR位点的多态性进行分析. 此方法简便、灵敏，实验周期短，无需同位素，尤其适用于微量样品和大样本研究，具有良好的应用前景.
4 参考文献
1 Watatani M, Yoshida T, Kuroda K, Leda S, Yasutomi M. Allelic loss of chromosome 17P, mutation of the p53 gene, and
microsatellite instability in right-and left-sided colorectal cancer. Cancer, 1996;77(Suppl 8):1688-1693
, http://www.100md.com
2 Horn GT, Richards B, Klinger KW. Amplification of a highly polymorphic VNTR segment by the PCR. Nucleic Acides Res,1989;17(5):2140-2143
3 王东旭，房殿春，罗元辉，刘为纹. 胃癌组织大肠癌丢失基因杂合性丢失及表达缺失的研究. 中华肿瘤杂志，1996；18(5)：331-334
4 Fearon ER, Vogelstein BA.A genetic model for colorectal tumorigenesis.Cell,1990;61(3):759-767
5 Saxena A, Clark WC, Robertson JT, Ikejiri B, Oldfield EH, Ali IU. Evidence for the involvement of a potential second tunmor
suppressor gene on chromosome 17 disrinct from p53 in malignant astrocytoas. Cancer Res, 1992;52(23):6716-6721, 百拇医药(杜青书 房殿春 罗元辉 刘为纹)
杜青书，男 ，1964-08-23生，重庆市合川县人，汉族. 1986年第三军医大学医疗系本科毕业，主治医师，讲师，主要从事消化病诊治研究，发表论文3篇.
项目负责人 杜青书，400038，第三军医大学西南医院消化科，重庆市沙坪坝区高滩岩正街1号 Correspondence to Dr. Qing-Shu Du, Department of Gastroenterology, Southwest Hospital, Third Military Medical University, 1 Gaotanyan Zhengjie, Shapingba District, Chongqing 400038, China
Tel. +86·23·65318301-73094
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收稿日期 1997-09-23 接收日期 1997-10-29
PCR detection of heterozygosity loss at YNZ22 locus containing VNTR segment in hepatocellular carcinoma
Qing-Shu Du, Dian-Chun Fang, Yuan-Hui Luo and Wei-Wen Liu
Department of Gastroenterology, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China
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Abstract
AIM To evaluate the role of heterozygosity (LOH) loss at YNZ22 locus in the development of hepatocellular carcinoma.
METHODS Polymorphic analysis of YNZ22 locus that contains a variable number of tandem repeat (VNTR) was performed in 35 surgically resected specimens of hepatocellular carcinomas and adjacent normal tissues by the polymerase chain reaction (PCR).
, 百拇医药
RESULTS Constitutional heterozygosity (informative) was found in 25/35 (71.4%) of hepatocellular carcinomas. Loss of heterozygosity (LOH) at YNZ22 locus was detected in 48.0% of informative cases. No significant difference existed between LOH at YNZ22 and serum levels of HBsAg and AFP,histological grades, tumor size and distant metastasis (P>0.05).
CONCLUSION LOH at YNZ22 locus is a common change in hepatocellular carcinomas and may be involved in carcinogenesis of hepatocellular cancer.
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Subject headings liver neoplasms/genetics; chromosomes, human, pair 17;
minisatellite repeats; heterzygote; chromosome deletion
Du QS, Fang DC, Luo YH, Liu WW. PCR detection of heterozygosity loss at YNZ22 locus containing VNTR segment in hepatocellular carcinoma. Huaren Xiaohua Zazhi,1998;6(2):131-132
摘要
目的 探讨YNZ22位点串联重复序列(VNTR)的杂合性丢失在原发肝癌发生发展中的作用.
, 百拇医药
方法 应用多聚酶链反应(PCR)技术扩增35例原发肝癌和正常肝组织YNZ22位点的VNTR区，对原发肝癌的杂合缺失进行分析.
结果 原发肝癌35例，属信息个体25例，占71.4%. 信息个体中25例检出YNZ22位点杂合缺失(LOH)12例，杂合缺失率为48.0%.分析LOH与临床病理参数间的关系发现，原发肝癌YNZ22位点杂合缺失与血清HBsAg和AFP水平、组织学分级、肿瘤大小及远处转移无关.
结论 YNZ22位点杂合缺失是原发肝癌的常见改变，可能参与了原发肝癌的发生与发展.
主题词 肝肿瘤/遗传学；染色体，人，17对；小卫星重复；杂合子；染色体缺失
杜青书, 房殿春, 罗元辉, 刘为纹.PCR检测原发肝癌YNZ22位点VNTR的杂合性丢失.华人消化杂志,1998;6(2):131-132
, http://www.100md.com
0 引言
恶性肿瘤经常发生特定染色体区域的丢失，染色体17p的某些位点是最常见的丢失区域之一[1]. 数目可变的串联重复序列(variable number of tandem repeat, VNTR)为一类新的遗传标记，以同一短序列重复串联为特征[2]. 近年，在染色体17p13.3(YNZ22) 发现了VNTR区，由于该区域与抑癌基因p53基因连锁，并具有多态的性质，因此常被作为标记基因用于肿瘤杂合性丢失(Loss of heterozygosity, LOH)的研究. 作者采用多聚酶链反应(PCR)扩增YNZ22位点的VNTR片段，对肝细胞癌(HCC)的LOH进行分析.
1 材料和方法
, http://www.100md.com
1.1 材料 我院1994-06/1996-06手术切除HCC标本35例，手术切下后立即收集癌组织和手术切缘处的正常组织，剔除出血、坏死部分，-80℃冻存. 按文献方法提取基因组DNA[3]. 冰冻切片染色证实所检测癌组织肿瘤细胞数均在50%以上.
1.2 PCR扩增 取1μg组织DNA，加入20μl PCR反应液中(含10mmol/L Tris-HCl，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2, 12.5pmol/L 上游及下游引物；dATP，dTTP,dCTP和dGTP各200μmol/L，以及Taq DNA聚合酶2U)，PCR扩增仪上扩增，反应条件：于95℃保温5min后，94℃变性40s，56℃复性40s,72℃ 延伸60s，循环35次.最后一个循环后，试管仍置72℃继续反应10min. 所用VNTR片段扩增引物由中国科学院上海细胞生物研究所合成，YNZ22(17p13.3)引物序列如下[4]：5′-CACAGTCTTTATTCTTCAGCG-3′5′-CGAAGAGTGAAGTGCACAGG-3′
, http://www.100md.com
1.3 VNTR的PCR分析 取扩增产物10μl，30g/L琼脂糖凝胶进行电泳分离，溴乙锭染色，紫外光下观察并照相. 正常组织经电泳分离如显现两条电泳带者(170bp～780bp)为杂合子(信息个体)，若仅为一条带者为纯合子(非信息个体). 对信息个体癌组织DNA以同样的引物进行PCR分析，比较同一个体癌组织及正常组织DNA扩增片段大小及量的差异，就可推算出是否存在LOH.
2 结果
2.1 PCR分析 HCC组织VNTR HCC 35例，组织DNA经PCR分析，YNZ22(17p13.3)位点属信息个体25例，检出LOH 12例，占信息个体的48.0%(图1).
图1 PCR检测原发肝癌YNZ22位点VNTR的杂合性丢失M：分子量标志； N：正常组织； T：肿瘤组织.
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例1为杂合子；例2为杂合缺失；例3为纯合子(非信息个体)
表1 YNZ22位点的LOH与临床病理参数的关系
| 临床病理参数 | 信息个体 | LOH(%) | |
| HBsAg | 阴性 | 6 | 2(33.3) |
| 阳性 | 19 | 10(52.6) | |
| AFP | ≤30ng/ml | 13 | 5(38.5) |
| >30ng/ml | 12 | 7(58.3) | |
| 肝硬变 | 无 | 8 | 4(50.0) |
| 有 | 17 | 8(47.1) | |
| 分化程度 | 高分化 | 6 | 3(50.0) |
| 中分化 | 10 | 5(50.0) | |
| 低分化 | 9 | 4(44.4) | |
| 肿瘤大小 | ≤5cm | 6 | 3(50.0) |
| >5cm | 19 | 9(47.4) | |
| 肝外转移 | 无转移 | 18 | 7(38.9) |
| 有转移 | 7 | 5(71.4) |
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2.2 LOH与临床病理参数 将25例HCC信息个体按血清HBsAg和AFP水平、有无肝硬变、肿瘤分化程度、大小和有无肝外转移的不同进行分组，YNZ22位点LOH率在各组间均无显著差异(P>0.05，表1).
3 讨论
HCC的发生发展是一个涉及到多种遗传物质改变的复杂过程，它至少涉及到癌基因N-ras,C-myc，抑癌基因p53和Rb的异常. 作者采用PCR技术，对HCC YNZ22位点中VNTR的多态性进行分析，观察到YNZ22位点的LOH率为48.0%. 结果提示，YNZ22位点LOH是HCC的常见改变，可能参与了HCC的发生、发展YNZ22位于人类第17号染色体短臂17P13.3p53基因远端，是由70bp的重复单位组成的串联重复序列[4]. 由于YNZ22与p53基因连锁，故常常用此位点LOH来代表p53基因的LOH. 近年研究发现，虽某些个体p53基因正常，但YNZ22却有LOH，提示该位点可能存在尚未克隆出来的抑癌基因[5]. YNZ22的VNTR呈现高度多态性，YNZ22的群体杂合率为86%[2]，本组为71.4%. 通过分析，YNZ22 LOH与临床病理参数的关系显示，YNZ22 LOH与血清HBsAg和AFP水平、组织学分级、肿瘤大小及肝外转移之间并无显著相关关系.
, http://www.100md.com
以往检测YNZ22位点的LOH多采用限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)分析，本文采用PCR技术，选择VNTR两侧的序列合成引物，对DNA靶序列进行扩增，然后通过凝胶电泳，溴乙锭染色扩增片段，对VNTR位点的多态性进行分析. 此方法简便、灵敏，实验周期短，无需同位素，尤其适用于微量样品和大样本研究，具有良好的应用前景.
4 参考文献
1 Watatani M, Yoshida T, Kuroda K, Leda S, Yasutomi M. Allelic loss of chromosome 17P, mutation of the p53 gene, and
microsatellite instability in right-and left-sided colorectal cancer. Cancer, 1996;77(Suppl 8):1688-1693
, http://www.100md.com
2 Horn GT, Richards B, Klinger KW. Amplification of a highly polymorphic VNTR segment by the PCR. Nucleic Acides Res,1989;17(5):2140-2143
3 王东旭，房殿春，罗元辉，刘为纹. 胃癌组织大肠癌丢失基因杂合性丢失及表达缺失的研究. 中华肿瘤杂志，1996；18(5)：331-334
4 Fearon ER, Vogelstein BA.A genetic model for colorectal tumorigenesis.Cell,1990;61(3):759-767
5 Saxena A, Clark WC, Robertson JT, Ikejiri B, Oldfield EH, Ali IU. Evidence for the involvement of a potential second tunmor
suppressor gene on chromosome 17 disrinct from p53 in malignant astrocytoas. Cancer Res, 1992;52(23):6716-6721, 百拇医药(杜青书 房殿春 罗元辉 刘为纹)