PCR检测结直肠肿瘤组织HPV16型DNA的研究
1广东医学院附属医院消化内科 广东省湛江市 524001
2湖北医科大学附属第一医院消化内科
项目负责人 周宇广东医学院附属医院消化内科 广东省湛江市 524001
收稿日期 1997-10-28 接收日期 1997-12-10
Subject headings colonic neoplasms/virology; rectal neoplasms/virology; papillomavirus, human/genetics;
DNA,viral/analysis; polymerase chain reaction
, http://www.100md.com
主题词 结肠肿瘤/病毒学；直肠肿瘤/病毒学；乳头状瘤病毒，人/遗传学；DNA，病毒/分析；聚合酶链反应
周宇, 于皆平, 沈志祥, 罗和生.PCR检测结直肠肿瘤组织HPV16型DNA的研究.华人消化杂志,1998;6(3):233
人乳头状瘤病毒(human papilloma virus, HPVs)是一类小DNA肿瘤病毒，现已明确HPV16，18，33型与宫颈鳞癌有关. 近几年亦发现HPVs与腺癌有关[1]. 本研究应用PCR技术检测国人结直肠肿瘤组织中HPV16型DNA序列，以期了解HPVs与国人结直肠腺癌的关系. 现报道如下：
1 材料和方法
1.1 材料 结直肠癌共50例，均为腺癌，均为手术切除标本. 结直肠腺癌共38例，其中腺瘤伴组织细胞异型增生18例均系内镜高频电摘除标本. 正常结直肠粘膜组织20例，系肠镜钳取的结直肠粘膜组织，且均经病理检查证实.
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 组织和质粒DNA的提取 取石蜡包埋组织切取8μm～12μm组织片，用二甲苯脱蜡，酒精水化，蛋白酶K(10mg/ml)消化，并用等体积苯酚/氯仿抽提，经冷纯乙醇沉淀1h(-20℃)后贮存备用. 把HPV16型克隆株(德国Zur Hausen博士惠赠)扩增培养，采用常规碱变性方法提取质粒DNA.
1.2.2 PCR检测 反应体积为50μl，其中引物1和引物2(扩增HPV16型E6/E7区的120bp，序列为：5＇TCAAAAGCCACTGTGTCCTG 3＇和5＇CGTGTTCTTGATGATCTGCA3＇)分别为0.5μl(500μmol/L)，标本DNA 10μl(或含0.01ng～100ng的质粒DNA或100ng的白细胞DNA)，TaqDNA多聚酶2U. 温度为94℃ 1min，50℃ 1min，72℃ 1min 30sec，共进行35次循环. 扩增产物经2%琼脂凝胶电泳分析和核酸杂交分析(地高辛标记探针试剂盒为德国Boehringer Mannheim公司产品，操作步骤按试剂盒说明书进行).
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2 结果
结直肠腺癌、结直肠腺瘤及正常结直肠粘膜组织HPV16型DNA阳性率分别为42.0%，31.6%和0.0%(表1). 结直肠腺癌和腺瘤比较，HPV16型DNA阳性率无显著性差异(P>0.05). 两者分别与正常结直肠粘膜组织比较，HPV16型DNA阳性率均有显著性差异(P<0.05). HPV16型DNA阳性的12例大肠腺瘤组织均伴有组织细胞异型增生. 另外，4例原发癌和转移淋巴结组织同时检测到HPV16型DNA.
表1 三组患者HPV16型DNA的检出率
, 百拇医药
3 讨论
业已证明，HPVs是宫颈、肛管等部位鳞癌的病因之一，且主要与HPV16型有关[1]. 近年来，不少研究也发现HPVs与结直肠腺癌有关的证据. 我国台湾学者Cheng et al[2]在三个中国人大肠腺癌细胞系中发现HPV16型和HPV18型的DNA表达，并通过转基因技术进一步说明国人大肠腺癌细胞系与HPV16型有关. Kirgan et al[3]应用免疫组化及核酸杂交等技术，在结直肠腺癌组织中分别检测到HPVs抗原和HPVs DNA. 指出，HPVs是结直肠腺癌的病因之一. 本研究应用敏感的PCR技术和Southern blot杂交技术检测国人结直肠腺癌组织中的HPV16型DNA序列，其阳性率为42.0%，而在正常组织中未检测到HPV16型DNA，支持HPV16型感染与结直肠腺癌有关的观点. 但本研究检出的HPV16型DNA阳性率比文献[3]报道结果稍高，其原因可能为：①HPV16型感染常呈地区性分布. 我国为HPV感染的高发区，且主要感染型别为HPV16型；②选择的检测方法不同. PCR技术比免疫组化或单用核酸杂交技术检测HPV DNA具有更高的敏感性；③选择的引物或探针不同. HPV16型DNA常整合于癌细胞DNA中，整合后只保留E6，E7基因，而其余早期和晚期基因全部丢失. 故选择E6，E7以外的早期或晚期基因为引物或探针检测肿瘤组织HPVs DNA，阳性率可能较低或出现阴性结果[4，5].
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本资料显示，尽管HPV16型DNA在大肠腺癌和腺瘤组织中的表达率无显著性差异，但HPV16型DNA阳性的大肠腺瘤均伴组织细胞异型增生. 推测，HPV16型可能开始作用于癌前病变，其DNA整合于异型增生细胞内，在p53或Rb等抑癌基因和ras或C-myc等致癌基因协同作用下，使癌前病变逐渐发生癌变[1]. 另外，在4例患者的原发癌和转移淋巴结组织中同时检测到HPV16型DNA，说明HPV16型DNA整合于癌细胞DNA，随癌细胞而转移. 同时提示，HPV16型感染的结直肠腺癌在肿瘤的发生、发展及临床生物行为等方面可能与无病毒感染的结直肠腺癌有所不同，需进一步深入研究.
4 参考文献
1 Da BC, Gopalkrishna V, Das K. Human papilloma virus DNA sequences in adenocarcinoma of the uterine cervix in
, http://www.100md.com
Indian woman.Cancer,1993;72(2):147-153
2 Cheng JY, Meng CL, Chao CF, Gau SD, Lin JC. Human papillomavirus 16 DNA in NIH3T3 cells transformed by colonic cancer
cellular DNA. Gut,1993;34(5):1710-1713
3 Kirgan D, Manalo P, Hall M, McGregor B. Association of human papillomavirus and colon neoplasms. Arch Surg,1990;125(10):862-865
4 Chang F, Syrjanen S, Shen Q, Mang L, Syrjanen K. Screening for human papillomavirus infections in esophageal squamous
cell carcinomas by in situhybridization. Cancer, 1993;72(9):2525-2530
5 Toh Y, Kuwano H, Tanaka S, Baba K, Matsuda H, Sugimachi K. Detection of human papillomavirus DNA in esophageal carcinoma
in Japan by polymerase chain reaction. Cancer, 1992;70(9):2234-2238, 百拇医药(周宇1 于皆平2 沈志祥2 罗和生2)
2湖北医科大学附属第一医院消化内科
项目负责人 周宇广东医学院附属医院消化内科 广东省湛江市 524001
收稿日期 1997-10-28 接收日期 1997-12-10
Subject headings colonic neoplasms/virology; rectal neoplasms/virology; papillomavirus, human/genetics;
DNA,viral/analysis; polymerase chain reaction
, http://www.100md.com
主题词 结肠肿瘤/病毒学；直肠肿瘤/病毒学；乳头状瘤病毒，人/遗传学；DNA，病毒/分析；聚合酶链反应
周宇, 于皆平, 沈志祥, 罗和生.PCR检测结直肠肿瘤组织HPV16型DNA的研究.华人消化杂志,1998;6(3):233
人乳头状瘤病毒(human papilloma virus, HPVs)是一类小DNA肿瘤病毒，现已明确HPV16，18，33型与宫颈鳞癌有关. 近几年亦发现HPVs与腺癌有关[1]. 本研究应用PCR技术检测国人结直肠肿瘤组织中HPV16型DNA序列，以期了解HPVs与国人结直肠腺癌的关系. 现报道如下：
1 材料和方法
1.1 材料 结直肠癌共50例，均为腺癌，均为手术切除标本. 结直肠腺癌共38例，其中腺瘤伴组织细胞异型增生18例均系内镜高频电摘除标本. 正常结直肠粘膜组织20例，系肠镜钳取的结直肠粘膜组织，且均经病理检查证实.
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 组织和质粒DNA的提取 取石蜡包埋组织切取8μm～12μm组织片，用二甲苯脱蜡，酒精水化，蛋白酶K(10mg/ml)消化，并用等体积苯酚/氯仿抽提，经冷纯乙醇沉淀1h(-20℃)后贮存备用. 把HPV16型克隆株(德国Zur Hausen博士惠赠)扩增培养，采用常规碱变性方法提取质粒DNA.
1.2.2 PCR检测 反应体积为50μl，其中引物1和引物2(扩增HPV16型E6/E7区的120bp，序列为：5＇TCAAAAGCCACTGTGTCCTG 3＇和5＇CGTGTTCTTGATGATCTGCA3＇)分别为0.5μl(500μmol/L)，标本DNA 10μl(或含0.01ng～100ng的质粒DNA或100ng的白细胞DNA)，TaqDNA多聚酶2U. 温度为94℃ 1min，50℃ 1min，72℃ 1min 30sec，共进行35次循环. 扩增产物经2%琼脂凝胶电泳分析和核酸杂交分析(地高辛标记探针试剂盒为德国Boehringer Mannheim公司产品，操作步骤按试剂盒说明书进行).
, http://www.100md.com
2 结果
结直肠腺癌、结直肠腺瘤及正常结直肠粘膜组织HPV16型DNA阳性率分别为42.0%，31.6%和0.0%(表1). 结直肠腺癌和腺瘤比较，HPV16型DNA阳性率无显著性差异(P>0.05). 两者分别与正常结直肠粘膜组织比较，HPV16型DNA阳性率均有显著性差异(P<0.05). HPV16型DNA阳性的12例大肠腺瘤组织均伴有组织细胞异型增生. 另外，4例原发癌和转移淋巴结组织同时检测到HPV16型DNA.
表1 三组患者HPV16型DNA的检出率
| 组别 | 总例数 | HPV16型DNA阳性 | |
| n | % | ||
| 结直肠腺癌 | 50 | 21 | 42.0 |
| 结直肠腺瘤 | 38 | 12 | 31.6 |
| 正常结直肠组织 | 20 | 0 | 0.0 |
, 百拇医药
3 讨论
业已证明，HPVs是宫颈、肛管等部位鳞癌的病因之一，且主要与HPV16型有关[1]. 近年来，不少研究也发现HPVs与结直肠腺癌有关的证据. 我国台湾学者Cheng et al[2]在三个中国人大肠腺癌细胞系中发现HPV16型和HPV18型的DNA表达，并通过转基因技术进一步说明国人大肠腺癌细胞系与HPV16型有关. Kirgan et al[3]应用免疫组化及核酸杂交等技术，在结直肠腺癌组织中分别检测到HPVs抗原和HPVs DNA. 指出，HPVs是结直肠腺癌的病因之一. 本研究应用敏感的PCR技术和Southern blot杂交技术检测国人结直肠腺癌组织中的HPV16型DNA序列，其阳性率为42.0%，而在正常组织中未检测到HPV16型DNA，支持HPV16型感染与结直肠腺癌有关的观点. 但本研究检出的HPV16型DNA阳性率比文献[3]报道结果稍高，其原因可能为：①HPV16型感染常呈地区性分布. 我国为HPV感染的高发区，且主要感染型别为HPV16型；②选择的检测方法不同. PCR技术比免疫组化或单用核酸杂交技术检测HPV DNA具有更高的敏感性；③选择的引物或探针不同. HPV16型DNA常整合于癌细胞DNA中，整合后只保留E6，E7基因，而其余早期和晚期基因全部丢失. 故选择E6，E7以外的早期或晚期基因为引物或探针检测肿瘤组织HPVs DNA，阳性率可能较低或出现阴性结果[4，5].
, http://www.100md.com
本资料显示，尽管HPV16型DNA在大肠腺癌和腺瘤组织中的表达率无显著性差异，但HPV16型DNA阳性的大肠腺瘤均伴组织细胞异型增生. 推测，HPV16型可能开始作用于癌前病变，其DNA整合于异型增生细胞内，在p53或Rb等抑癌基因和ras或C-myc等致癌基因协同作用下，使癌前病变逐渐发生癌变[1]. 另外，在4例患者的原发癌和转移淋巴结组织中同时检测到HPV16型DNA，说明HPV16型DNA整合于癌细胞DNA，随癌细胞而转移. 同时提示，HPV16型感染的结直肠腺癌在肿瘤的发生、发展及临床生物行为等方面可能与无病毒感染的结直肠腺癌有所不同，需进一步深入研究.
4 参考文献
1 Da BC, Gopalkrishna V, Das K. Human papilloma virus DNA sequences in adenocarcinoma of the uterine cervix in
, http://www.100md.com
Indian woman.Cancer,1993;72(2):147-153
2 Cheng JY, Meng CL, Chao CF, Gau SD, Lin JC. Human papillomavirus 16 DNA in NIH3T3 cells transformed by colonic cancer
cellular DNA. Gut,1993;34(5):1710-1713
3 Kirgan D, Manalo P, Hall M, McGregor B. Association of human papillomavirus and colon neoplasms. Arch Surg,1990;125(10):862-865
4 Chang F, Syrjanen S, Shen Q, Mang L, Syrjanen K. Screening for human papillomavirus infections in esophageal squamous
cell carcinomas by in situhybridization. Cancer, 1993;72(9):2525-2530
5 Toh Y, Kuwano H, Tanaka S, Baba K, Matsuda H, Sugimachi K. Detection of human papillomavirus DNA in esophageal carcinoma
in Japan by polymerase chain reaction. Cancer, 1992;70(9):2234-2238, 百拇医药(周宇1 于皆平2 沈志祥2 罗和生2)