胃癌D17S261和D17S799位点二核苷酸重复序列不稳定性的意义
1解放军322医院内一科 山西省大同市 037006
2第三军医大学西南医院消化科 重庆市 430038
周晓东，男，1963-01-21生，汉族. 1985年第四军医大学毕业，学士，1997年第三军医大学消化内科硕士，消化内科主治医师，发表论文10篇.
项目负责人 周晓东，037006，山西省大同市，解放军322医院内一科，山西省大同市新开南路2号.
Correspondence to Xiao-Dong Zhou, Department of Gastroenterology, Chinese PLA 322 Hospital, 2 Xinkai Nanlu,Datong 037006, Shanxi Province, China
, http://www.100md.com
Tel. +86·352·2023869-83025
收稿日期 1997-12-10
Clinical implication of dinucleotide repeat sequence instability in gastric cancer
Xiao-Dong Zhou1 and Dian-Chun Fang2
1Department of Gastroenterology, Chinese PLA 322 Hospital, Datong 037006, Shanxi Province, China
, 百拇医药
2Department of Gastroenterology, Southwest Hospital, the Third Military Medical University, Chongqing 430038, China
Abstract
AIM To investigate dinucleotide repeat sequence instability (DRSI) in the carcinogenesis of gastric cancer.
METHODS DRSI was detected in 50 surgically resected specimens of gastric cancer using the PCR method.
, http://www.100md.com
RESULTS DRSI was detected in 17 (34.0%) of the 50 gastric cancer specimens. The frequency of DRSI in well-differentiated gastric cancer (66.7%， 10/15) was significantly higher than that in poorly-differentiated one (19.4%，6/31) (P<0.01), and in intestinal type (55.6%，10/18) it was significantly higher than in diffused type (20%,6/30) (P<0.05). No significant correlation was found between DRSI and the size, location, lymphnode metastasis, serosal invasion and clinical stage of gastric cancer.
, 百拇医药
CONCLUSION DRSI may be an early molecular marker and may play an important role in carcinogenesis of gastric cancer.
Subject headings stomach neoplasms/genetics; adenocarcinoma/genetics; dinucleotide repeats/genetics
Zhou XD, Fang DC. Clinical implication of dinucleotide repeat sequence instability at D17S261 and D17S799 in gastric cancer.
Huaren Xiaohua Zazhi,1998;6(4):318-320
, http://www.100md.com
摘要
目的 研究二核苷酸重复序列不稳定性〔DRSI〕在胃癌发生中的作用及其临床意义.
方法 采用PCR方法检测了D17S 261和D17S 799位点二核苷酸重复序列不稳定性.
结果 胃癌总DRSI发生率为34%(17/?50)，其中高中分化腺癌DRSI阳性率(66.7%，10/15)显著高于低分化癌(19.4%，6/31，P<0.01)；肠型胃癌DRSI阳性率(55.6%，10/18)显著高于胃型胃癌(20%，6/30，P<0.05)，DRSI与胃癌部位、大小、浸润、分期、淋巴结转移无显著相关.
, 百拇医药 结论 DRSI在胃癌的发生中可能起重要作用.
主题词 胃肿瘤/遗传学；腺癌/遗传学；双核苷酸重复/遗传学；序列分析，RNA
周晓东, 房殿春.胃癌D17S261和D17S799位点二核苷酸重复序列不稳定性的意义.华人消化杂志,1998;6(4):318-320
0 引言
胃癌的发生涉及到一系列的遗传改变，包括癌基因的激活及抑癌基因的失活等. 近期研究发现，二核苷重复序列不稳定性(Dinucleotide repeated sequence instability, DRSI)在肿瘤的发生中扮演重要角色[1，2]. 有关胃癌DRSI的研究国外已见报道[3-5]，国内尚未见这方面的报道. 为了探讨DRSI在中国人胃癌发生中的作用，我们采用PCR方法检测了胃癌的DRSI.
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 材料 我院1994-01/1996-07手术切除胃癌标本50例. 手术切下肿瘤后收集癌及切缘处正常组织，置-80℃冰箱保存备用. 早期胃癌3例，进展期胃癌47例；中-高分化腺癌15例，低发化腺癌31例，印戒细胞癌4例；肠型胃癌18例，胃型胃癌30例，混合型胃癌2例.
1.2 方法 采用显微解剖技术收集癌及正常粘膜组织，以蛋白酶K消化、酚/氯仿抽提法提取基因组DNA. 采用中科院上海细胞生物研究所合成引物扩增D17S261，位点二核苷酸重复序列[6]，D17S799位点引物由Garden博士提供. 采用2400型PCR仪扩增DNA. 反应总体积20μl，含基因组DNA 100ng，10×Buffer 2μl，引物各10pmol，4×dNTP各0.2mmol， Taq DNA聚合酶2U. 循环参数94℃ 30s，56℃ 40s，72℃ 30s，32个循环后置72℃继续反应10min. 扩增产物在15g/L琼脂糖上电泳证实无杂带后，以首次扩增产物为模板，另加α-32pdCTP 0.8μl，进行第2次扩增. 取2次扩增产物5μl与等体积上样缓冲液(980g/L)甲酰胺，2.5g/L二甲苯蓝和溴酚蓝)混合，95℃变性5min后在100g/L聚丙烯酰胺凝胶上(含7mol/L尿素)电泳2h，干燥凝胶在-80℃下放射自显影. 和正常DNA等位片段比较，肿瘤组织有额外的DNA等位片段即为阳性结果.
, http://www.100md.com
统计学处理 以χ2或四表格确切概率法对相关数据进行统计学处理. P<0.05相差显著，P<0.01相差非常显著.
2 结果
2.1 胃癌DRSI检出率 胃癌50例中D17S261和D17S799位点各检出DRSI 12例，阳性率均为24.0%. 若将2个位点综合分析，共检出MRSI 17例，总阳性率为34.0%(图1)，3例早期胃癌2例DRSI阳性，进展期胃癌DRSI阳性率为31.9%(15/47)，二者之间无显著差异I(P>0.05).
2.2 DRSI与胃癌临床病理参数 将50例胃癌按部位、大小、分化程度、淋巴结转移、浆膜浸润、分期及Lauren分型进行分组，可见中-高分化腺癌DRSI阳性率为66.7%(10/15)，显著高于低分化腺癌(19.4%，6/31，P<0.01)；肠型胃癌阳性率为55.6%(10/18)，显著高于胃型胃癌(20%，6/30,P<0.05). DRSI与其他各项参数无显著相关(表1).
, 百拇医药
图1 胃癌组织D17S261，D17S799位点MSIN：正常组织 T：肿瘤组织
图2 胃癌组织(SP法×400)突变型P53蛋白表达
表1 胃癌DRSI与临床病理参数的关系
, http://www.100md.com
aP<0.01，bP<0.05.
3 讨论
D17S261和D17S799位点分别位于染色体17P 13.1-12和17P 12.1-11，该位点存在一种具有高度多态性的二核苷酸重复序列即微卫星DNA，当DNA发生频发的复制错误时，该重复序列可发生缺失和插入，导致不稳定性发生，即DRSI或微卫星不稳定性(microsatellite instability, MSI). 近期研究发现，DRSI参与了胃癌的发生，国外报道胃癌MSI发生率18%～38%[3-5]，Nakashima et al[7]检测了25例胃癌的MSI，发现早期胃癌MSI发生率显著高于晚期胃癌，提示MSI是胃癌发生的早期事件. 本研究发现，胃癌MSI/DRSI检出率为34%，3例早期胃癌2例阳性，提示在胃癌发生的早期阶段即有DRSI的发生，因此DRSI可能是胃癌发生过程中的早期分子标志.
, 百拇医药
MSI与胃癌分化程度的关系文献报告不尽一致. Han et al[3]发现低分化腺癌MSI发生率高于高分化腺癌. Semba et al[8]发现高分化腺癌MSI发生率高于低分化腺癌，而且肠化组织阳性率为33.3%. 本研究显示，中-高分化腺癌DRSI发生率显著高于低分化腺癌，肠型胃癌阳性率显著高于胃型胃癌，提示二核苷酸重复序列不稳定性在肠型胃癌的发生中起重要作用，DRSI阳性胃癌恶性程度可能低.
Seroca et al[9]研究显示，MSI与胃癌发生部位，淋巴结转移有关，81.8%的MSI发生于胃窦部癌琈SI阳性胃癌淋巴结转移率显著低于MSI阴性胃癌，提示MSI阳性胃癌预后相对较好. 本研究未发现胃癌DRSI与淋巴结转移有关，亦未能证实与胃癌大小、浆膜浸润、部位、临床分期有显著相关.
, 百拇医药
DRSI参与胃癌发生的机制目前还不清楚，但并不是通过引起p53基因突变而致癌[10]，在这方面还有待进一步研究. 本研究提示，DRSI参与了胃癌的发生，可能是胃癌发生的一种新机制，检测DRSI可能有助于胃癌早期诊断和预后评估.
4 参考文献
1 Shridhar V, Siegfried J, Hunt J, MarAlonso M, Smith DI. Genetic instability of Microsatellite seguence in many
non-small lung carcinomas. Cancer Res,1994;54(8):2084-2087
, 百拇医药 2 Yee CJ, Roodi N, Verrier CS, Parl FF. Microsatellite instability and loss of heterozygosity in breast cancer.
Cancer Res, 1994;54(7):1641-1644
3 Han HJ, Yanagicawa A, Kato Y, Park JG, Nakamura Y. Genetic instability in Pancreatic cancer and pooly differentiated type of
gastric cancer. Cancer Res, 1993;53(23):5087-5089
4 Chong JM, Fukayama M, Hayashi Y, Takizawa T, Koike M, Konishi M et al. Microsatellite instability in progression of gastric
, 百拇医药
carcinoma. Cancer Res, 1994;54(17):4595-4597
5 Tumura G, Sakata K, Maesawa C, Suzuki Y, Terashima M, Satoh K et al.Microsatellite alterations in adenoma and
differentiated adenocarcinoma of the stomach. Cancer Res, 1995;55(9):1933-1936
6 Weber JL, Kwitek AE, May PE. Dinucleotide repeat polymorphism at the 17S250 and D17S261 loci. Nucleic Acid Res,1990;18(14):4640
, 百拇医药
7 Nakashima H, Inoue H, Mori M, Ueo H, IKeda M, Akiyoshi T. Microsatellite instability in Japanese gastric cancer.
Cancer, 1995;75(6):1503-1507
8 Semba S, Yokozaki H, Yamamoto S, Yaswi W, Tahara E. Microsatellite instability in precancerous lesions and carcinomas
of the stomach. Cancer,1996;77(Suppl 8):1620-1627
9 Seroca R, Santos NR, David L, Constancia M, Barroca H, Carneico F et al. Sporadic gastric carcinomas with microsatellite
instability display a particular clinicopathologic profile. Int J Cancer,1995;64(1):32-36
10 Mironov N, Aguelon MAM, Potapova GI, Omori Y, Gorbunov OV, Klimenkov AA et al. Alterations of (CA)n,DNA repeats and
tumor suppressor genes in human gastric cancer.Cancer Res,1994;54(1):41-44, http://www.100md.com(周晓东1 房殿春2)
2第三军医大学西南医院消化科 重庆市 430038
周晓东，男，1963-01-21生，汉族. 1985年第四军医大学毕业，学士，1997年第三军医大学消化内科硕士，消化内科主治医师，发表论文10篇.
项目负责人 周晓东，037006，山西省大同市，解放军322医院内一科，山西省大同市新开南路2号.
Correspondence to Xiao-Dong Zhou, Department of Gastroenterology, Chinese PLA 322 Hospital, 2 Xinkai Nanlu,Datong 037006, Shanxi Province, China
, http://www.100md.com
Tel. +86·352·2023869-83025
收稿日期 1997-12-10
Clinical implication of dinucleotide repeat sequence instability in gastric cancer
Xiao-Dong Zhou1 and Dian-Chun Fang2
1Department of Gastroenterology, Chinese PLA 322 Hospital, Datong 037006, Shanxi Province, China
, 百拇医药
2Department of Gastroenterology, Southwest Hospital, the Third Military Medical University, Chongqing 430038, China
Abstract
AIM To investigate dinucleotide repeat sequence instability (DRSI) in the carcinogenesis of gastric cancer.
METHODS DRSI was detected in 50 surgically resected specimens of gastric cancer using the PCR method.
, http://www.100md.com
RESULTS DRSI was detected in 17 (34.0%) of the 50 gastric cancer specimens. The frequency of DRSI in well-differentiated gastric cancer (66.7%， 10/15) was significantly higher than that in poorly-differentiated one (19.4%，6/31) (P<0.01), and in intestinal type (55.6%，10/18) it was significantly higher than in diffused type (20%,6/30) (P<0.05). No significant correlation was found between DRSI and the size, location, lymphnode metastasis, serosal invasion and clinical stage of gastric cancer.
, 百拇医药
CONCLUSION DRSI may be an early molecular marker and may play an important role in carcinogenesis of gastric cancer.
Subject headings stomach neoplasms/genetics; adenocarcinoma/genetics; dinucleotide repeats/genetics
Zhou XD, Fang DC. Clinical implication of dinucleotide repeat sequence instability at D17S261 and D17S799 in gastric cancer.
Huaren Xiaohua Zazhi,1998;6(4):318-320
, http://www.100md.com
摘要
目的 研究二核苷酸重复序列不稳定性〔DRSI〕在胃癌发生中的作用及其临床意义.
方法 采用PCR方法检测了D17S 261和D17S 799位点二核苷酸重复序列不稳定性.
结果 胃癌总DRSI发生率为34%(17/?50)，其中高中分化腺癌DRSI阳性率(66.7%，10/15)显著高于低分化癌(19.4%，6/31，P<0.01)；肠型胃癌DRSI阳性率(55.6%，10/18)显著高于胃型胃癌(20%，6/30，P<0.05)，DRSI与胃癌部位、大小、浸润、分期、淋巴结转移无显著相关.
, 百拇医药 结论 DRSI在胃癌的发生中可能起重要作用.
主题词 胃肿瘤/遗传学；腺癌/遗传学；双核苷酸重复/遗传学；序列分析，RNA
周晓东, 房殿春.胃癌D17S261和D17S799位点二核苷酸重复序列不稳定性的意义.华人消化杂志,1998;6(4):318-320
0 引言
胃癌的发生涉及到一系列的遗传改变，包括癌基因的激活及抑癌基因的失活等. 近期研究发现，二核苷重复序列不稳定性(Dinucleotide repeated sequence instability, DRSI)在肿瘤的发生中扮演重要角色[1，2]. 有关胃癌DRSI的研究国外已见报道[3-5]，国内尚未见这方面的报道. 为了探讨DRSI在中国人胃癌发生中的作用，我们采用PCR方法检测了胃癌的DRSI.
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 材料 我院1994-01/1996-07手术切除胃癌标本50例. 手术切下肿瘤后收集癌及切缘处正常组织，置-80℃冰箱保存备用. 早期胃癌3例，进展期胃癌47例；中-高分化腺癌15例，低发化腺癌31例，印戒细胞癌4例；肠型胃癌18例，胃型胃癌30例，混合型胃癌2例.
1.2 方法 采用显微解剖技术收集癌及正常粘膜组织，以蛋白酶K消化、酚/氯仿抽提法提取基因组DNA. 采用中科院上海细胞生物研究所合成引物扩增D17S261，位点二核苷酸重复序列[6]，D17S799位点引物由Garden博士提供. 采用2400型PCR仪扩增DNA. 反应总体积20μl，含基因组DNA 100ng，10×Buffer 2μl，引物各10pmol，4×dNTP各0.2mmol， Taq DNA聚合酶2U. 循环参数94℃ 30s，56℃ 40s，72℃ 30s，32个循环后置72℃继续反应10min. 扩增产物在15g/L琼脂糖上电泳证实无杂带后，以首次扩增产物为模板，另加α-32pdCTP 0.8μl，进行第2次扩增. 取2次扩增产物5μl与等体积上样缓冲液(980g/L)甲酰胺，2.5g/L二甲苯蓝和溴酚蓝)混合，95℃变性5min后在100g/L聚丙烯酰胺凝胶上(含7mol/L尿素)电泳2h，干燥凝胶在-80℃下放射自显影. 和正常DNA等位片段比较，肿瘤组织有额外的DNA等位片段即为阳性结果.
, http://www.100md.com
统计学处理 以χ2或四表格确切概率法对相关数据进行统计学处理. P<0.05相差显著，P<0.01相差非常显著.
2 结果
2.1 胃癌DRSI检出率 胃癌50例中D17S261和D17S799位点各检出DRSI 12例，阳性率均为24.0%. 若将2个位点综合分析，共检出MRSI 17例，总阳性率为34.0%(图1)，3例早期胃癌2例DRSI阳性，进展期胃癌DRSI阳性率为31.9%(15/47)，二者之间无显著差异I(P>0.05).
2.2 DRSI与胃癌临床病理参数 将50例胃癌按部位、大小、分化程度、淋巴结转移、浆膜浸润、分期及Lauren分型进行分组，可见中-高分化腺癌DRSI阳性率为66.7%(10/15)，显著高于低分化腺癌(19.4%，6/31，P<0.01)；肠型胃癌阳性率为55.6%(10/18)，显著高于胃型胃癌(20%，6/30,P<0.05). DRSI与其他各项参数无显著相关(表1).
, 百拇医药
图1 胃癌组织D17S261，D17S799位点MSIN：正常组织 T：肿瘤组织
图2 胃癌组织(SP法×400)突变型P53蛋白表达
表1 胃癌DRSI与临床病理参数的关系
| 参数 | n | DRSI(%) |
| 部位 | ||
| 胃窦 | 30 | 10(33.3) |
| 胃体 | 11 | 4(36.4) |
| 胃底 | 9 | 3(33.3) |
| 大小 | ||
| ≤5cm | 32 | 13(40.6) |
| >5cm | 18 | 4(22.2) |
| 分化程度 | ||
| 高-中 | 15 | 10(66.7)a |
| 低 | 31 | 6(19.4) |
| 印戒 | 4 | 1(25.0) |
| 淋巴结转移 | ||
| 有 | 25 | 6(24.0) |
| 无 | 25 | 11(44.0) |
| 浆膜浸润 | ||
| 有 | 30 | 11(36.7) |
| 无 | 20 | 6(30.0) |
| 分期 | ||
| Ⅰ，Ⅱ | 24 | 11(45.8) |
| Ⅲ，Ⅳ | 26 | 6(23.1) |
| Lauren分型 | ||
| 肠型 | 18 | 10(55.6)b |
| 胃型 | 30 | 6(20.0) |
| 混合型 | 2 | 1(50.0) |
, http://www.100md.com
aP<0.01，bP<0.05.
3 讨论
D17S261和D17S799位点分别位于染色体17P 13.1-12和17P 12.1-11，该位点存在一种具有高度多态性的二核苷酸重复序列即微卫星DNA，当DNA发生频发的复制错误时，该重复序列可发生缺失和插入，导致不稳定性发生，即DRSI或微卫星不稳定性(microsatellite instability, MSI). 近期研究发现，DRSI参与了胃癌的发生，国外报道胃癌MSI发生率18%～38%[3-5]，Nakashima et al[7]检测了25例胃癌的MSI，发现早期胃癌MSI发生率显著高于晚期胃癌，提示MSI是胃癌发生的早期事件. 本研究发现，胃癌MSI/DRSI检出率为34%，3例早期胃癌2例阳性，提示在胃癌发生的早期阶段即有DRSI的发生，因此DRSI可能是胃癌发生过程中的早期分子标志.
, 百拇医药
MSI与胃癌分化程度的关系文献报告不尽一致. Han et al[3]发现低分化腺癌MSI发生率高于高分化腺癌. Semba et al[8]发现高分化腺癌MSI发生率高于低分化腺癌，而且肠化组织阳性率为33.3%. 本研究显示，中-高分化腺癌DRSI发生率显著高于低分化腺癌，肠型胃癌阳性率显著高于胃型胃癌，提示二核苷酸重复序列不稳定性在肠型胃癌的发生中起重要作用，DRSI阳性胃癌恶性程度可能低.
Seroca et al[9]研究显示，MSI与胃癌发生部位，淋巴结转移有关，81.8%的MSI发生于胃窦部癌琈SI阳性胃癌淋巴结转移率显著低于MSI阴性胃癌，提示MSI阳性胃癌预后相对较好. 本研究未发现胃癌DRSI与淋巴结转移有关，亦未能证实与胃癌大小、浆膜浸润、部位、临床分期有显著相关.
, 百拇医药
DRSI参与胃癌发生的机制目前还不清楚，但并不是通过引起p53基因突变而致癌[10]，在这方面还有待进一步研究. 本研究提示，DRSI参与了胃癌的发生，可能是胃癌发生的一种新机制，检测DRSI可能有助于胃癌早期诊断和预后评估.
4 参考文献
1 Shridhar V, Siegfried J, Hunt J, MarAlonso M, Smith DI. Genetic instability of Microsatellite seguence in many
non-small lung carcinomas. Cancer Res,1994;54(8):2084-2087
, 百拇医药 2 Yee CJ, Roodi N, Verrier CS, Parl FF. Microsatellite instability and loss of heterozygosity in breast cancer.
Cancer Res, 1994;54(7):1641-1644
3 Han HJ, Yanagicawa A, Kato Y, Park JG, Nakamura Y. Genetic instability in Pancreatic cancer and pooly differentiated type of
gastric cancer. Cancer Res, 1993;53(23):5087-5089
4 Chong JM, Fukayama M, Hayashi Y, Takizawa T, Koike M, Konishi M et al. Microsatellite instability in progression of gastric
, 百拇医药
carcinoma. Cancer Res, 1994;54(17):4595-4597
5 Tumura G, Sakata K, Maesawa C, Suzuki Y, Terashima M, Satoh K et al.Microsatellite alterations in adenoma and
differentiated adenocarcinoma of the stomach. Cancer Res, 1995;55(9):1933-1936
6 Weber JL, Kwitek AE, May PE. Dinucleotide repeat polymorphism at the 17S250 and D17S261 loci. Nucleic Acid Res,1990;18(14):4640
, 百拇医药
7 Nakashima H, Inoue H, Mori M, Ueo H, IKeda M, Akiyoshi T. Microsatellite instability in Japanese gastric cancer.
Cancer, 1995;75(6):1503-1507
8 Semba S, Yokozaki H, Yamamoto S, Yaswi W, Tahara E. Microsatellite instability in precancerous lesions and carcinomas
of the stomach. Cancer,1996;77(Suppl 8):1620-1627
9 Seroca R, Santos NR, David L, Constancia M, Barroca H, Carneico F et al. Sporadic gastric carcinomas with microsatellite
instability display a particular clinicopathologic profile. Int J Cancer,1995;64(1):32-36
10 Mironov N, Aguelon MAM, Potapova GI, Omori Y, Gorbunov OV, Klimenkov AA et al. Alterations of (CA)n,DNA repeats and
tumor suppressor genes in human gastric cancer.Cancer Res,1994;54(1):41-44, http://www.100md.com(周晓东1 房殿春2)