多聚酶链反应检测胃粘膜幽门螺杆菌
1新加坡国立大学医学院微生物学系 新加坡 119026
2法国Bordeaux第二大学细菌学系
华杰松，男，1961-11-16生，上海市人，汉族. 1985年上海医科大学医学系毕业，1991年上海第二医科大学硕士研究生毕业，1993/1995年法国Bordeaux第二大学细菌学系访问学者，主要从事微生物致病与诊断研究，发表论文20篇.
项目负责人 华杰松，119026，新加坡国立大学医学院微生物学系，新加坡肯特岗路.
Correspondence to Dr. Jie-Song Hua, Department of Microbiology, National University of Singapore,Lower Kent Ridge Road, Singapore 119026
, 百拇医药
Tel. +65·8743285， Email: michuajs@nus,edu.sg
收稿日期 19984-25
Detection of Helicobacter pylori in gastric biopsy by polymerase chain reaction
Jie-Song Hua1, Peng-Yuan Zheng1, Ho BOW1 and Francis MEGRAUD2
Department of Microbiology, Faculty of Medicine, National University of Singapore, Singapore 119026, Republic of Singapore
, 百拇医药
Abstract
AIM To detect Helicobacter pylori (Hp) in gastric biopsy by using PCR.
METHODS Gastric specimens from 83 patients with gastric diseases were analyzed by histology, rapid urease test and polymerase chain reaction using primers based on specific Hp Mr 26000 protein genes.
RESULTS Out of 83 patients tested, 32 (38.6%) were Hp positive by PCR, while 29 (34.9%) and 28 (33.7%) cases were positive by histology and rapid urease test, respectively. There were no statistical differences among the 3 tests. It was noted that transportation of gastric specimen placed in urease test reagent did not affect polymerase chain reaction.
, http://www.100md.com
CONCLUSION Polymerase chain reaction is a sensitive and specific method to detect Hp. It needs no special transportation conditions to send gastric biopsy to laboratory.
Subject headings gastric mucosa/microbiology; helicobacter pylori/isolation & purificatiom; polymerase chain reaction
Hua JS, Zheng PY, Bow H, Megraud F. Detection of Helicobacter pylori in gastric biopsy by polymerase chain reaction.
, 百拇医药
Huaren Xiaohua Zazhi,1998;6(5):377-379
摘要
目的 采用PCR技术检测Hp.
方法 83例胃病患者粘膜标本经多聚酶链反应，组织学及快速尿素酶试验进行分析.
结果 在82例患者中，多聚酶链反应阳性32例(38.6%)，组织病理切片阳性29例(34.9%)，快速尿素酶试验阳性28例(33.7%). 三种方法无统计学差异. 存放于尿素酶试剂中的胃粘膜标本不影响多聚酶链反应结果.
结论 多聚酶链反应是检测Hp的一种敏感性及特异性较强的方法. 在将标本送经实验室时无需特殊的运输条件.
, 百拇医药
主题词 胃粘膜/微生物学；螺杆菌；幽门/分离和提纯；聚合酶链反应
华杰松, 郑鹏远,Bow H, Mégraud F.多聚酶链反应检测胃粘膜幽门螺杆菌.华人消化杂志,1998;6(5):377-379
0 引言
幽门螺杆菌(Hp)是一种弯曲状革兰阴性微需氧菌. 自1983年Warren和Marshall[1]首次从胃粘膜标本中分离以来，大量研究发现Hp与慢性胃炎密切相关，是消化性溃疡的主要致病因子，流行病学调查提示Hp可能是胃癌的重要相关因子[2，3]. 最近几年来分子生物学技术在Hp研究领域发展迅速，多聚酶链反应(PCR)能从样本中特异地扩增微量的靶DNA[4]，我们采用PCR技术检测Hp，并探讨邮递标本的可能性.
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 材料 共83例患者包括于本实验中，用内镜从患者胃窦处取3块胃粘膜标本，两块胃粘膜用于组织病理切片，一块胃粘膜标本用于快速尿素酶试验和PCR.
1.2 快速尿素酶试验 将胃粘膜标本放入尿素酶半固体试剂中(Belta West Pty Ltd, Australia)观察结果. 由于Hp产生大量尿素酶，若30min内试剂颜色由黄变红则为阳性. 将含有胃粘膜标本的尿素酶试剂经邮局寄往微生物实验室用于PCR.
1.3 多聚酶链反应
, http://www.100md.com 1.3.1 胃粘膜标本处理 从尿素酶试剂中取出胃粘膜，放于1mL无菌生理盐水中用组织粉碎仪粉碎胃粘膜标本，离心8000g，10min，弃上清，沉淀加300μL抽提缓冲液(20mmol/L，Tris-HCl, 2g/L吐温20，pH 7.4)，加10g/L. 蛋白酶15μL，56℃水浴60min，然后100℃水浴10min.
1.3.2 DNA扩增反应 引物顺序分别为5-TGGCGTGTCTATTGACAGCGAGC-3和5-CCTGCTGGGCATACTTCACCAAG-3[5]，编码Hp特异Mr 26000蛋白质. 总反应体积为50μL，加5μL PCR缓冲液，1.25U Taq多聚酶(Promega产品)，3μL 25mmol/L MgCl2, 1μL 10mmol/L dNTP，50pmol引物， 5μL胃粘膜标本抽提液. DNA扩增仪为Perkin Elmer 480，循环露任4℃ 5min， 50℃ 1min，72℃ 1min，39个循环. 将多聚酶链反应扩增后的产物做琼脂电泳，琼脂浓度为10g/L，含0.5g/L溴化乙锭. 每次实验均设阳性和阴性对照.
, http://www.100md.com
2 结果
胃粘膜标本经PCR扩增和电泳，若在紫外灯光下可见298bp DNA条带为阳性. 图1为典型的PCR结果. 在83例患者中，PCR阳性32例(38.6%)，组织病理切片阳性29例(34.9%)，快速尿素酶试验阳性28例(33.7%，表1). PCR分别与组织病理切片和快速尿素酶试验结果比较(表2，3)，存放于尿素酶试剂中的胃粘膜标本不影响PCR结果.
表1 不同方法检测Hp感染结果
, http://www.100md.com
表2 多聚酶链反应与组织病理切片比较结果*
*P>0.05.
表3 多聚酶链反应与快速尿素酶试验比较结果*
, 百拇医药
图1 PCR检测Hp结果，1.Hind Ⅲ酶切λ DNA，2-4.阳性标本，5.阴性标本，6.阳性对照，7.阴性对照.
3 讨论
由于幽门螺杆菌在人群中感染率很高和这个细菌在临床上的重要性，迫切需要一种快速有效，特异敏感诊断Hp感染的方法，但是到目前为止还没有一种公认的理想诊断方法，这妨碍Hp基础及临床研究，尤其是检测环境及粪便中的Hp的传染源和传播途径，这对预防Hp感染有重要意义. 随着分子生物学技术发展，PCR越来越多地被用来作为诊断Hp感染的工具，利用DNA扩增技术可使模板DNA增加到原来的106以上[4]. 研究表明，PCR有很高敏感性和特异性[5]. 我们用PCR检测Hp，并且进一步研究了胃粘膜标本运送条件对反应的影响，内镜医师经内镜取出胃粘膜后立刻做快速尿素酶试验，然后把含胃粘膜标本的尿素酶试剂送往实验室. 在83例标本中，PCR阳性率为38.6%，组织病理切片阳性率为34.9%，快速尿素酶试验阳性率为33.7%，表明PCR敏感性与其他二种方法相比无显著差异. 5例PCR阳性，其中仅1例快速尿素酶试验阳性，组织病理切片全部阴性. 另2例标本组织病理切片阳性，但PCR和快速尿素酶试验阴性. 这可能是标本中细菌量太少，低于快速尿素酶试验检测灵敏度或者可能Hp在胃内呈斑点状分布，非同一块胃组织用于PCR和组织病理切片使两者检测结果有差异，此外组织病理切片染色是非特异性染色，Sahay et al[6]报告从胃中分离到与Hp形态相似的空肠弯曲菌，因此组织病理切片不能完全排除有假阳性.
, 百拇医药
在操作过程中，最重要的是避免污染. 我们在检测过程中分别在三个房间中进行样品处理，DNA扩增和分析DNA扩增后产物. 操作过程中采用一次性带滤纸的微量吸管，PCR试剂小剂量分装保存，每次检测均设阳性和阴性对照，这样可以减少交叉污染. 本试验中标本运送时间约3d～5d，室温范围为15℃～33℃. 分析本结果表明，环境温度和运输条件不影响PCR检测结果. 由于PCR检测Hp敏感性高，特异性强，运输标本不受条件限制，尤其能检测到体外不能培养的Hp圆球体[7]，因此有很大优越性. 那些不能开展Hp检测的地区可以将标本送往中心实验室，内镜医师也可以只取一块胃组织‘一物二用’，先做快速尿素酶试验.
4 参考文献
1 Warren JR,Marshall BJ.Unidentified curved bacilli on gastric epithelium in active chronic gastritis. Lancet,1983;I(8336):1273-1275
, http://www.100md.com
2 Correa P,Fox J,Fontham E,Ruitz B,Lin YP,Zavala D et al.Helicobacter pylori and gastric carcinoma cancer. Serum antibody prevalence
in populations with contrasting cancer risks. Cancer,1990;66(4):2569-2574
3 Wee A,Kang JY,Toh M. Helicobacter pylori and gastric cancer:correlation with gastritis,interestinal metaplasia and
tumor histology.Gut,1992;33(3):1029-1032
, 百拇医药
4 Rolfs A,Schuller I,Finckh,Weber-rolfs I. PCR:Clinical diagnostics and research. SpringerVerlag Berlin Heidelberg,1992:34-41
5 Monteiro L,Birac C,Mégraud.Detection of Helicobacter pylori in gastric biopsy by polymerase chain reaction. In:Adrian L and Mégraud
F eds. Helicobacter pylori:techniques for clinical diagnosis and basic resarch. W B Saunders Company Ltd,1996:112-119
6 Sahay P,West AP,Birkenhead D,Hawkey pM. Campylobacter jejuni in the stomach. J Med Microbiol,1995;43(1):75-77
7 Hua J,Ho B. Is the coccoid form of Helicobacter pylori viable.Microbios,1996;87(351):103-112, 百拇医药(华杰松1 郑鹏远1 Bow H1 Mégraud F2.)
2法国Bordeaux第二大学细菌学系
华杰松，男，1961-11-16生，上海市人，汉族. 1985年上海医科大学医学系毕业，1991年上海第二医科大学硕士研究生毕业，1993/1995年法国Bordeaux第二大学细菌学系访问学者，主要从事微生物致病与诊断研究，发表论文20篇.
项目负责人 华杰松，119026，新加坡国立大学医学院微生物学系，新加坡肯特岗路.
Correspondence to Dr. Jie-Song Hua, Department of Microbiology, National University of Singapore,Lower Kent Ridge Road, Singapore 119026
, 百拇医药
Tel. +65·8743285， Email: michuajs@nus,edu.sg
收稿日期 19984-25
Detection of Helicobacter pylori in gastric biopsy by polymerase chain reaction
Jie-Song Hua1, Peng-Yuan Zheng1, Ho BOW1 and Francis MEGRAUD2
Department of Microbiology, Faculty of Medicine, National University of Singapore, Singapore 119026, Republic of Singapore
, 百拇医药
Abstract
AIM To detect Helicobacter pylori (Hp) in gastric biopsy by using PCR.
METHODS Gastric specimens from 83 patients with gastric diseases were analyzed by histology, rapid urease test and polymerase chain reaction using primers based on specific Hp Mr 26000 protein genes.
RESULTS Out of 83 patients tested, 32 (38.6%) were Hp positive by PCR, while 29 (34.9%) and 28 (33.7%) cases were positive by histology and rapid urease test, respectively. There were no statistical differences among the 3 tests. It was noted that transportation of gastric specimen placed in urease test reagent did not affect polymerase chain reaction.
, http://www.100md.com
CONCLUSION Polymerase chain reaction is a sensitive and specific method to detect Hp. It needs no special transportation conditions to send gastric biopsy to laboratory.
Subject headings gastric mucosa/microbiology; helicobacter pylori/isolation & purificatiom; polymerase chain reaction
Hua JS, Zheng PY, Bow H, Megraud F. Detection of Helicobacter pylori in gastric biopsy by polymerase chain reaction.
, 百拇医药
Huaren Xiaohua Zazhi,1998;6(5):377-379
摘要
目的 采用PCR技术检测Hp.
方法 83例胃病患者粘膜标本经多聚酶链反应，组织学及快速尿素酶试验进行分析.
结果 在82例患者中，多聚酶链反应阳性32例(38.6%)，组织病理切片阳性29例(34.9%)，快速尿素酶试验阳性28例(33.7%). 三种方法无统计学差异. 存放于尿素酶试剂中的胃粘膜标本不影响多聚酶链反应结果.
结论 多聚酶链反应是检测Hp的一种敏感性及特异性较强的方法. 在将标本送经实验室时无需特殊的运输条件.
, 百拇医药
主题词 胃粘膜/微生物学；螺杆菌；幽门/分离和提纯；聚合酶链反应
华杰松, 郑鹏远,Bow H, Mégraud F.多聚酶链反应检测胃粘膜幽门螺杆菌.华人消化杂志,1998;6(5):377-379
0 引言
幽门螺杆菌(Hp)是一种弯曲状革兰阴性微需氧菌. 自1983年Warren和Marshall[1]首次从胃粘膜标本中分离以来，大量研究发现Hp与慢性胃炎密切相关，是消化性溃疡的主要致病因子，流行病学调查提示Hp可能是胃癌的重要相关因子[2，3]. 最近几年来分子生物学技术在Hp研究领域发展迅速，多聚酶链反应(PCR)能从样本中特异地扩增微量的靶DNA[4]，我们采用PCR技术检测Hp，并探讨邮递标本的可能性.
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 材料 共83例患者包括于本实验中，用内镜从患者胃窦处取3块胃粘膜标本，两块胃粘膜用于组织病理切片，一块胃粘膜标本用于快速尿素酶试验和PCR.
1.2 快速尿素酶试验 将胃粘膜标本放入尿素酶半固体试剂中(Belta West Pty Ltd, Australia)观察结果. 由于Hp产生大量尿素酶，若30min内试剂颜色由黄变红则为阳性. 将含有胃粘膜标本的尿素酶试剂经邮局寄往微生物实验室用于PCR.
1.3 多聚酶链反应
, http://www.100md.com 1.3.1 胃粘膜标本处理 从尿素酶试剂中取出胃粘膜，放于1mL无菌生理盐水中用组织粉碎仪粉碎胃粘膜标本，离心8000g，10min，弃上清，沉淀加300μL抽提缓冲液(20mmol/L，Tris-HCl, 2g/L吐温20，pH 7.4)，加10g/L. 蛋白酶15μL，56℃水浴60min，然后100℃水浴10min.
1.3.2 DNA扩增反应 引物顺序分别为5-TGGCGTGTCTATTGACAGCGAGC-3和5-CCTGCTGGGCATACTTCACCAAG-3[5]，编码Hp特异Mr 26000蛋白质. 总反应体积为50μL，加5μL PCR缓冲液，1.25U Taq多聚酶(Promega产品)，3μL 25mmol/L MgCl2, 1μL 10mmol/L dNTP，50pmol引物， 5μL胃粘膜标本抽提液. DNA扩增仪为Perkin Elmer 480，循环露任4℃ 5min， 50℃ 1min，72℃ 1min，39个循环. 将多聚酶链反应扩增后的产物做琼脂电泳，琼脂浓度为10g/L，含0.5g/L溴化乙锭. 每次实验均设阳性和阴性对照.
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2 结果
胃粘膜标本经PCR扩增和电泳，若在紫外灯光下可见298bp DNA条带为阳性. 图1为典型的PCR结果. 在83例患者中，PCR阳性32例(38.6%)，组织病理切片阳性29例(34.9%)，快速尿素酶试验阳性28例(33.7%，表1). PCR分别与组织病理切片和快速尿素酶试验结果比较(表2，3)，存放于尿素酶试剂中的胃粘膜标本不影响PCR结果.
表1 不同方法检测Hp感染结果
| 标本 | 多聚酶链反应 | 组织病理切片 | 快速尿素酶试验 |
| 49 | - | - | - |
| 27 | + | + | + |
| 2 | - | + | - |
| 1 | + | - | + |
| 4 | + | - | - |
| 总计 83 | 32 | 29 | 28 |
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表2 多聚酶链反应与组织病理切片比较结果*
| 多聚酶链反应 | 总计 | |||
| + | - | |||
| 组织病理切片 | + | 27 | 2 | 29 |
| - | 5 | 49 | 54 | |
| 总计 | 32 | 51 | 83 |
*P>0.05.
表3 多聚酶链反应与快速尿素酶试验比较结果*
| 多聚酶链反应 | 总计 | |||
| + | - | |||
| 快速尿素酶试验 | + | 28 | 0 | 28 |
| - | 4 | 51 | 55 | |
| 总计 | 32 | 51 | 83 |
, 百拇医药
图1 PCR检测Hp结果，1.Hind Ⅲ酶切λ DNA，2-4.阳性标本，5.阴性标本，6.阳性对照，7.阴性对照.
3 讨论
由于幽门螺杆菌在人群中感染率很高和这个细菌在临床上的重要性，迫切需要一种快速有效，特异敏感诊断Hp感染的方法，但是到目前为止还没有一种公认的理想诊断方法，这妨碍Hp基础及临床研究，尤其是检测环境及粪便中的Hp的传染源和传播途径，这对预防Hp感染有重要意义. 随着分子生物学技术发展，PCR越来越多地被用来作为诊断Hp感染的工具，利用DNA扩增技术可使模板DNA增加到原来的106以上[4]. 研究表明，PCR有很高敏感性和特异性[5]. 我们用PCR检测Hp，并且进一步研究了胃粘膜标本运送条件对反应的影响，内镜医师经内镜取出胃粘膜后立刻做快速尿素酶试验，然后把含胃粘膜标本的尿素酶试剂送往实验室. 在83例标本中，PCR阳性率为38.6%，组织病理切片阳性率为34.9%，快速尿素酶试验阳性率为33.7%，表明PCR敏感性与其他二种方法相比无显著差异. 5例PCR阳性，其中仅1例快速尿素酶试验阳性，组织病理切片全部阴性. 另2例标本组织病理切片阳性，但PCR和快速尿素酶试验阴性. 这可能是标本中细菌量太少，低于快速尿素酶试验检测灵敏度或者可能Hp在胃内呈斑点状分布，非同一块胃组织用于PCR和组织病理切片使两者检测结果有差异，此外组织病理切片染色是非特异性染色，Sahay et al[6]报告从胃中分离到与Hp形态相似的空肠弯曲菌，因此组织病理切片不能完全排除有假阳性.
, 百拇医药
在操作过程中，最重要的是避免污染. 我们在检测过程中分别在三个房间中进行样品处理，DNA扩增和分析DNA扩增后产物. 操作过程中采用一次性带滤纸的微量吸管，PCR试剂小剂量分装保存，每次检测均设阳性和阴性对照，这样可以减少交叉污染. 本试验中标本运送时间约3d～5d，室温范围为15℃～33℃. 分析本结果表明，环境温度和运输条件不影响PCR检测结果. 由于PCR检测Hp敏感性高，特异性强，运输标本不受条件限制，尤其能检测到体外不能培养的Hp圆球体[7]，因此有很大优越性. 那些不能开展Hp检测的地区可以将标本送往中心实验室，内镜医师也可以只取一块胃组织‘一物二用’，先做快速尿素酶试验.
4 参考文献
1 Warren JR,Marshall BJ.Unidentified curved bacilli on gastric epithelium in active chronic gastritis. Lancet,1983;I(8336):1273-1275
, http://www.100md.com
2 Correa P,Fox J,Fontham E,Ruitz B,Lin YP,Zavala D et al.Helicobacter pylori and gastric carcinoma cancer. Serum antibody prevalence
in populations with contrasting cancer risks. Cancer,1990;66(4):2569-2574
3 Wee A,Kang JY,Toh M. Helicobacter pylori and gastric cancer:correlation with gastritis,interestinal metaplasia and
tumor histology.Gut,1992;33(3):1029-1032
, 百拇医药
4 Rolfs A,Schuller I,Finckh,Weber-rolfs I. PCR:Clinical diagnostics and research. SpringerVerlag Berlin Heidelberg,1992:34-41
5 Monteiro L,Birac C,Mégraud.Detection of Helicobacter pylori in gastric biopsy by polymerase chain reaction. In:Adrian L and Mégraud
F eds. Helicobacter pylori:techniques for clinical diagnosis and basic resarch. W B Saunders Company Ltd,1996:112-119
6 Sahay P,West AP,Birkenhead D,Hawkey pM. Campylobacter jejuni in the stomach. J Med Microbiol,1995;43(1):75-77
7 Hua J,Ho B. Is the coccoid form of Helicobacter pylori viable.Microbios,1996;87(351):103-112, 百拇医药(华杰松1 郑鹏远1 Bow H1 Mégraud F2.)