鼠人肝再生增强因子的cDNA克隆及序列分析
空军广州医院全军传染病中心分子生物学室 广东省广州市 510602
易学瑞，男，1965-04-11，安徽省蚌埠市人，汉族. 1992年上海第二医科大学分子生物学专业毕业，获硕士学位，主要从事基因治疗、基因克隆、基因工程产品研制以及细胞凋亡等基础研究，发表论文7篇.
项目负责人 易学瑞，510602，空军广州医院全军传染病中心分子生物学室，广东省广州市东风东路801号.
Correspondence to Xue-Rui Yi, Chinese PLA Centre of Infectious Diseases, Guangzhou Airforce Hospital,Guangzhou 510602, Guangdong Province, China
, 百拇医药
Tel. +86·20·87378532(O) 87621662(H)， Fax. +86·20·87371180
收稿日期 1998-02-12
Cloning and sequencing of rat and human augmenter of liver regeneration gene
Xue-Rui Yi, Xiang-Ping Kong, Ming-Hua Tong, Lian-Ping Yang, Ru-Bing Li and Yi-Jun Zhang
Chinese PLA Centre of Infectious Diseases, Guangzhou Airforce Hospital, Guangzhou 510602, Guangdong Province, China
, 百拇医药
Abstract
AIM To clone the cDNA of human and rat augmenter of liver regeneration.
METHODS According to the nuclear acid sequence of human and rat augmenter of liver regeneration, we designed two pairs of primer to clone the genes with RT-PCR from the liver tissues of weanling rat and human fetus. The Boeheringer mRNA isolation kit was used for the isolation of mRNA from liver tissues and the promega T7 sequencing kit was used for sequencing.
, http://www.100md.com
RESULTS We succeeded in cloning 470bp cDNA of rat augmenter in liver regeneration and 384bp cDNA of human augmenter of liver regeneration.
CONCLUSION Sequences of human and rat ALR gene are consistent with the results reported in literature.
Subject headings liver regeneration; hepatocyte growth factor; DNA, complementary; base sequence; sequence analysis, DNA
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Yi XR, Kong XP, Tong MH, Yang LP, Li RB, Zhang YJ. Cloning and sequencing of rat and human augmenter of liver regeneration gene.Huaren Xiaohua Zazhi,1998;6(5):392-393
摘要
目的 克隆大鼠及人肝再生增强因子的cDNA.
方法 按文献报道大鼠及人肝再生增强因子核苷酸序列设计合成引物. 利用mRNA抽提试剂盒分别从乳鼠及人胎肝组织中提取mRNA，再逆转录聚合酶链反应扩增出需要的cDNA片段，经克隆入pGEM-T质粒后以T-7DNA聚合酶序列分析试剂盒测定cDNA的序列.
, 百拇医药
结果 经RT-PCR反应顺利扩增到470bp的鼠肝再生增加因子cDNA及384bp的人肝再生增强因子.
结论 所得到的cDNA序列与文献报道一致.
主题词 肝再生；肝细胞生长因子；DNA，互补；碱基序列；序列分析，DNA
易学瑞, 孔祥平, 佟明华, 杨联萍, 李茹冰, 张宜俊.鼠人肝再生增强因子的cDNA克隆及序列分析.华人消化杂志,1998;6(5):392-393
0 引言
许多细胞因子都参与肝再生的调控，如HGF，TGF，EGF等，但它们都缺乏特异性，而来源于幼年动物肝组织中的一种热稳定的肝细胞生长刺激因子却有特异性，称之为肝脏碳の(Hepatic stimulator substance, HSS)[1]. 许多学者分别从大鼠[1]、乳猪[2]、新生小牛及人胚胎[3]的肝脏组织中都分离到这种广泛存在于多种哺乳动物肝组织中的刺激生长因子，而且张宜俊 et al[2]结合人胎肝细胞悬液治疗肝炎的成功经验，率先将来源于乳猪肝组织中的刺激因子pHGF(promote hepatocyte growth factor)应用于临床重型病毒性肝炎的治疗并取得较满意的疗效，从而进一步地推动了这类因子的研究. 1994年Hagiya et al[4]从新生大鼠肝组织中克隆到类似于HSS的刺激因子，称之为肝再生增强因子(augmenter of liver regeneration, ALR). 最近，杨晓明et al[5]在鼠ALR基因的基础上，成功地筛选到人肝细胞增强因子. 为了进一步地研究ALR的生物学活性，利用已知序列我们克隆到鼠及人的ALR基因并完成编码区核苷酸序列分析.
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1 材料和方法
1.1 材料 mRNA抽提试剂盒，cDNA第一条链合成试剂盒，PCR核心试剂盒均购自Boehringer公司，pGEM-T质粒，T7DNA聚合酶序列分析试剂盒及内切酶购自Promega公司，α35S-dATP(10uci/ul)购自Du pont 公司，E.Coli JM109为本室保存菌株.
1.2 方法
1.2.1 PCR引物设计 按照Hagiya et al[4]报道设计大鼠ALR引物1：5＇-AAGCTT-TGCGTGGACTTCAAGT-3＇引物2：5＇-AAGCTT-TCGTCAGTCAGGCTGT-3＇按照杨晓明et al[5]报道设计人ALR引物.引物3：5＇-TAGCATGCGGACGCAGCAGAAG-3＇引物4：5＇-GCATGCTAGTCACAGGAGCCAT-3＇
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1.2.2 mRNA的提取 取2wk内的新生Wistar大鼠及水囊引产4mo左右人胎肝组织200mg，按Boehringer公司mRNA分离试剂盒提取mRNA.
1.2.3 反转录PCR 取mRNA 0.2μg，加入oligopdT(15)引物1.6μg后于65℃保温10min，迅速加入Boehringer公司第一链cDNA合成体系中，混匀，室温放置10min后，于42℃保温60min，进行逆转录反应，完毕后于99℃ 10min灭活，取10μl做为PCR反应模板，在50μl反应体系中含1.5mmol/L MgCl2，0.1mmol/L dNTPs，0.2μmol/L P1,P2(或P3，P4)，10mmol/L Tris. HCL, 1.25U TaqDNA聚合酶，反应参数为：95℃先保温5min然后再95℃，1min，52℃ 1min；72℃ 1min；35循环后，于72℃延伸10min，以1.5%琼脂糖电泳，溴乙锭染色，检查有无特异性条带.
, 百拇医药
1.2.4 PCR产物亚克隆及核苷酸序列的测定 从低熔点琼脂糖胶中回收特异性扩增片段，与pGEM-T质粒连接，转化感受态E. ColiJM109，挑取白斑，用内切酶分析鉴定，阳性克隆经LB培养后，用CsCl密度梯度离心法纯化质粒，作为模板用Promega公司的T7DNA聚合酶分析试剂盒采用双链末端终止法，产物经Beckman公司genomyx DNA测序仪分析，经放射自显影后读取核苷酸序列.
2 结果
2.1 大鼠ALR cDNA克隆及序列分析 杨晓明 et al[5]以2/3肝部分切除后再生肝RNA进行RT-PCR反应，目的可能是提高成年鼠ALR表达丰度，实际上，ALR在幼年动物肝组织中就有高表达，因此，我们选用新生2wk内的大鼠肝组织抽提mRNA后，直接用合成引物进行鼠ALR的基因克隆，结果顺利地扩增出特异性片段(图1)，PCR产物直接克隆于pGEM-T质粒转化E. coli JM109细菌，重组子的核苷酸顺序与文献报道一致.
, 百拇医药
2.2 人ALR的cDNA克隆及序列分析 利用人ALR序列合成引物以RT-PCR方法从水囊引产4月龄胎儿肝组织mRNA，扩增出特异性片段，Mr与文献报道一致(图1). PCR产物直接克隆于pGEM-T质粒，序列分析表明其编码区序列与文献报道一致.
图1 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果 A 以乳鼠肝RNA RT产物为模板，P1，P2扩增产物(470bp)B 以人胎肝RNA RT产物为模板，P3，P4的扩增产物(384bp)C PCR DNA分子标准
3 讨论
ALR是类似于HSS的一种肝脏刺激因子，其基因产物能显著提高四氯化碳中毒肝衰竭大鼠存活率，这一点与HSS很相似. 因此ALR的基因产物可能代替目前来自幼体动物肝组织中采用生化方法提取的HSS做为药物应用于临床治疗重症肝衰竭患者. 而ALR在体外不能刺激原代肝细胞生长，表明ALR的刺激肝细胞生长可能是间接地起作用. 虽然ALR基因在成年大鼠肝组织中表达不高，但在幼体内却表达甚丰，显然我们选用2wk内的新生乳鼠肝组织，免去了做肝部分切除模型的麻烦，更为快捷方便.
, http://www.100md.com
目前，我们已经构建鼠及人ALR基因的原核及真核表达载体，以进一步研究其生物学活性.
4 参考文献
1 LaBrecque DR, Peshch IA. Preparation and partial characterization of hepatic regenerative stimulator substance (SS) from rat liver.
J Physiol, 1975;284(2):273-276
2 张宜俊，陈光明，孔祥平，郑国池，杨富强，胡肇春. 肝细胞生长素的研制和临床应用.临床肝胆杂志，1991；7(1)：15-19
3 涂强，吴祖泽. 人胎肝源肝细胞生长因子的纯化和生物学活性研究. 中国病理生理学杂志，1991；7(5)：537-541
, 百拇医药
4 Hagiya M. Francavilla A.Polimene L, Ihara I, Sakai H, Seki T et al.Cloning and sequence analysis of the rat augmenter of
liver regeneration (ALR)gene; expression of Biologically active recombinant ALR and demonstration of tissue distribution.
Proc Nati Acal Sci USA, 1994;91(4):8142-8146
5 杨晓明，谢玲，邱兆华，胡志远，吴祖泽，贺福初. 人肝再生增强因子的cDNA克隆与序列分析.军事医学科学院院刊，1996；20(4)：241-244, http://www.100md.com(易学瑞 孔祥平 佟明华 杨联萍 李茹冰 张宜俊)
易学瑞，男，1965-04-11，安徽省蚌埠市人，汉族. 1992年上海第二医科大学分子生物学专业毕业，获硕士学位，主要从事基因治疗、基因克隆、基因工程产品研制以及细胞凋亡等基础研究，发表论文7篇.
项目负责人 易学瑞，510602，空军广州医院全军传染病中心分子生物学室，广东省广州市东风东路801号.
Correspondence to Xue-Rui Yi, Chinese PLA Centre of Infectious Diseases, Guangzhou Airforce Hospital,Guangzhou 510602, Guangdong Province, China
, 百拇医药
Tel. +86·20·87378532(O) 87621662(H)， Fax. +86·20·87371180
收稿日期 1998-02-12
Cloning and sequencing of rat and human augmenter of liver regeneration gene
Xue-Rui Yi, Xiang-Ping Kong, Ming-Hua Tong, Lian-Ping Yang, Ru-Bing Li and Yi-Jun Zhang
Chinese PLA Centre of Infectious Diseases, Guangzhou Airforce Hospital, Guangzhou 510602, Guangdong Province, China
, 百拇医药
Abstract
AIM To clone the cDNA of human and rat augmenter of liver regeneration.
METHODS According to the nuclear acid sequence of human and rat augmenter of liver regeneration, we designed two pairs of primer to clone the genes with RT-PCR from the liver tissues of weanling rat and human fetus. The Boeheringer mRNA isolation kit was used for the isolation of mRNA from liver tissues and the promega T7 sequencing kit was used for sequencing.
, http://www.100md.com
RESULTS We succeeded in cloning 470bp cDNA of rat augmenter in liver regeneration and 384bp cDNA of human augmenter of liver regeneration.
CONCLUSION Sequences of human and rat ALR gene are consistent with the results reported in literature.
Subject headings liver regeneration; hepatocyte growth factor; DNA, complementary; base sequence; sequence analysis, DNA
, http://www.100md.com
Yi XR, Kong XP, Tong MH, Yang LP, Li RB, Zhang YJ. Cloning and sequencing of rat and human augmenter of liver regeneration gene.Huaren Xiaohua Zazhi,1998;6(5):392-393
摘要
目的 克隆大鼠及人肝再生增强因子的cDNA.
方法 按文献报道大鼠及人肝再生增强因子核苷酸序列设计合成引物. 利用mRNA抽提试剂盒分别从乳鼠及人胎肝组织中提取mRNA，再逆转录聚合酶链反应扩增出需要的cDNA片段，经克隆入pGEM-T质粒后以T-7DNA聚合酶序列分析试剂盒测定cDNA的序列.
, 百拇医药
结果 经RT-PCR反应顺利扩增到470bp的鼠肝再生增加因子cDNA及384bp的人肝再生增强因子.
结论 所得到的cDNA序列与文献报道一致.
主题词 肝再生；肝细胞生长因子；DNA，互补；碱基序列；序列分析，DNA
易学瑞, 孔祥平, 佟明华, 杨联萍, 李茹冰, 张宜俊.鼠人肝再生增强因子的cDNA克隆及序列分析.华人消化杂志,1998;6(5):392-393
0 引言
许多细胞因子都参与肝再生的调控，如HGF，TGF，EGF等，但它们都缺乏特异性，而来源于幼年动物肝组织中的一种热稳定的肝细胞生长刺激因子却有特异性，称之为肝脏碳の(Hepatic stimulator substance, HSS)[1]. 许多学者分别从大鼠[1]、乳猪[2]、新生小牛及人胚胎[3]的肝脏组织中都分离到这种广泛存在于多种哺乳动物肝组织中的刺激生长因子，而且张宜俊 et al[2]结合人胎肝细胞悬液治疗肝炎的成功经验，率先将来源于乳猪肝组织中的刺激因子pHGF(promote hepatocyte growth factor)应用于临床重型病毒性肝炎的治疗并取得较满意的疗效，从而进一步地推动了这类因子的研究. 1994年Hagiya et al[4]从新生大鼠肝组织中克隆到类似于HSS的刺激因子，称之为肝再生增强因子(augmenter of liver regeneration, ALR). 最近，杨晓明et al[5]在鼠ALR基因的基础上，成功地筛选到人肝细胞增强因子. 为了进一步地研究ALR的生物学活性，利用已知序列我们克隆到鼠及人的ALR基因并完成编码区核苷酸序列分析.
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 材料 mRNA抽提试剂盒，cDNA第一条链合成试剂盒，PCR核心试剂盒均购自Boehringer公司，pGEM-T质粒，T7DNA聚合酶序列分析试剂盒及内切酶购自Promega公司，α35S-dATP(10uci/ul)购自Du pont 公司，E.Coli JM109为本室保存菌株.
1.2 方法
1.2.1 PCR引物设计 按照Hagiya et al[4]报道设计大鼠ALR引物1：5＇-AAGCTT-TGCGTGGACTTCAAGT-3＇引物2：5＇-AAGCTT-TCGTCAGTCAGGCTGT-3＇按照杨晓明et al[5]报道设计人ALR引物.引物3：5＇-TAGCATGCGGACGCAGCAGAAG-3＇引物4：5＇-GCATGCTAGTCACAGGAGCCAT-3＇
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1.2.2 mRNA的提取 取2wk内的新生Wistar大鼠及水囊引产4mo左右人胎肝组织200mg，按Boehringer公司mRNA分离试剂盒提取mRNA.
1.2.3 反转录PCR 取mRNA 0.2μg，加入oligopdT(15)引物1.6μg后于65℃保温10min，迅速加入Boehringer公司第一链cDNA合成体系中，混匀，室温放置10min后，于42℃保温60min，进行逆转录反应，完毕后于99℃ 10min灭活，取10μl做为PCR反应模板，在50μl反应体系中含1.5mmol/L MgCl2，0.1mmol/L dNTPs，0.2μmol/L P1,P2(或P3，P4)，10mmol/L Tris. HCL, 1.25U TaqDNA聚合酶，反应参数为：95℃先保温5min然后再95℃，1min，52℃ 1min；72℃ 1min；35循环后，于72℃延伸10min，以1.5%琼脂糖电泳，溴乙锭染色，检查有无特异性条带.
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1.2.4 PCR产物亚克隆及核苷酸序列的测定 从低熔点琼脂糖胶中回收特异性扩增片段，与pGEM-T质粒连接，转化感受态E. ColiJM109，挑取白斑，用内切酶分析鉴定，阳性克隆经LB培养后，用CsCl密度梯度离心法纯化质粒，作为模板用Promega公司的T7DNA聚合酶分析试剂盒采用双链末端终止法，产物经Beckman公司genomyx DNA测序仪分析，经放射自显影后读取核苷酸序列.
2 结果
2.1 大鼠ALR cDNA克隆及序列分析 杨晓明 et al[5]以2/3肝部分切除后再生肝RNA进行RT-PCR反应，目的可能是提高成年鼠ALR表达丰度，实际上，ALR在幼年动物肝组织中就有高表达，因此，我们选用新生2wk内的大鼠肝组织抽提mRNA后，直接用合成引物进行鼠ALR的基因克隆，结果顺利地扩增出特异性片段(图1)，PCR产物直接克隆于pGEM-T质粒转化E. coli JM109细菌，重组子的核苷酸顺序与文献报道一致.
, 百拇医药
2.2 人ALR的cDNA克隆及序列分析 利用人ALR序列合成引物以RT-PCR方法从水囊引产4月龄胎儿肝组织mRNA，扩增出特异性片段，Mr与文献报道一致(图1). PCR产物直接克隆于pGEM-T质粒，序列分析表明其编码区序列与文献报道一致.
图1 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果 A 以乳鼠肝RNA RT产物为模板，P1，P2扩增产物(470bp)B 以人胎肝RNA RT产物为模板，P3，P4的扩增产物(384bp)C PCR DNA分子标准
3 讨论
ALR是类似于HSS的一种肝脏刺激因子，其基因产物能显著提高四氯化碳中毒肝衰竭大鼠存活率，这一点与HSS很相似. 因此ALR的基因产物可能代替目前来自幼体动物肝组织中采用生化方法提取的HSS做为药物应用于临床治疗重症肝衰竭患者. 而ALR在体外不能刺激原代肝细胞生长，表明ALR的刺激肝细胞生长可能是间接地起作用. 虽然ALR基因在成年大鼠肝组织中表达不高，但在幼体内却表达甚丰，显然我们选用2wk内的新生乳鼠肝组织，免去了做肝部分切除模型的麻烦，更为快捷方便.
, http://www.100md.com
目前，我们已经构建鼠及人ALR基因的原核及真核表达载体，以进一步研究其生物学活性.
4 参考文献
1 LaBrecque DR, Peshch IA. Preparation and partial characterization of hepatic regenerative stimulator substance (SS) from rat liver.
J Physiol, 1975;284(2):273-276
2 张宜俊，陈光明，孔祥平，郑国池，杨富强，胡肇春. 肝细胞生长素的研制和临床应用.临床肝胆杂志，1991；7(1)：15-19
3 涂强，吴祖泽. 人胎肝源肝细胞生长因子的纯化和生物学活性研究. 中国病理生理学杂志，1991；7(5)：537-541
, 百拇医药
4 Hagiya M. Francavilla A.Polimene L, Ihara I, Sakai H, Seki T et al.Cloning and sequence analysis of the rat augmenter of
liver regeneration (ALR)gene; expression of Biologically active recombinant ALR and demonstration of tissue distribution.
Proc Nati Acal Sci USA, 1994;91(4):8142-8146
5 杨晓明，谢玲，邱兆华，胡志远，吴祖泽，贺福初. 人肝再生增强因子的cDNA克隆与序列分析.军事医学科学院院刊，1996；20(4)：241-244, http://www.100md.com(易学瑞 孔祥平 佟明华 杨联萍 李茹冰 张宜俊)