慢性丙型肝炎患者血清和肝组织中庚型肝炎病毒RNA检测
1解放军88医院传染科 山东省泰安市 271000
2第二军医大学微生物教研室 上海市 200433
于建国，男，1953-07-06生，山东省东阿县人，汉族. 1977年上海第二军医大学医疗系本科毕业. 现任解放军88中心医院传染病科、济南军区肝病研究所副主任医师，主要从事肝脏疾病的临床与病理及分子生物学研究，获多项军队和省级科技进步奖及优秀论文奖. 国内外刊物发表论文76篇.
项目负责人 于建国，271000，解放军88医院传染科，山东省泰安市虎山路6号.
Correspondence to Jian-Guo Yu, Department of Infectious Diseases, Chinese PLA 88 Hospital, 6 Hushanlu, Taian 271000, Shandong Province, ChinaTel. +86·538·8223002-39365
, http://www.100md.com
收稿日期 1998-03-14
PCR detection of hepatitis G virus RNA in sera and liver tissues from patients with chronic hepatitis C
Jian-Guo Yu1, Xian-Rong Hou1, Wei Pan2, Guang-Shu Zhang1 and Xiu-Mei Zhou1
1Department of Infectious Diseases, Chinese PLA 88 Hospital, Taian 271000, Shandong Province, China
, 百拇医药
2Department of Microbiology, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China
Abstract
AIM To find out the condition of HGV infection in sera and liver tissues from patients with chronic hepatitis C.
METHODS RT-PCR was used to detect the HGVRNA in the sera from 49 patients and liver tissues from 14 patients with
, 百拇医药
chronic hepatitis C.
RESULTS In the sera of 49 patients and in the liver tissues of 14 patients with chronic hepatitis C, the positive detectable rates of HGVRNA were 12.2% (6/49) and 21.4% (3/14) respectively, which showed that HGV exists simultaneously in the sera and liver tissues of patients with chronic hepatitis C. The reason of the higher positive detectable rate of HGVRNA in the liver tissues was that HGV and HCV infection was closely related to transfusion and other direct exposure to blood.
, 百拇医药
CONCLUSION There are HGV and HCV infections in patients with chronic hepatitis C in southern Shandong, with a high detectable rate. It is imperative to further screen blood donors for HGVRNA and HCVRNA (PCR) and ALT so as to control HGV and HCV infection via blood transfusion.
Subject headings hepatitis C/virology; hepatitis viruses/genetics; RNA viruses/isolation & purification
Yu JG, Hou XR, Pan W, Zhang GS, Zhou XM. PCR detection of hepatitis G virus RNA in sera and liver tissues from patients with chronic hepatitis C. Huaren Xiaohua Zazhi,1998;6(7):580-581
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摘要
目的 了解慢性丙型肝炎(CHC)患者血清和肝组织中庚型肝炎病毒(HGV)感染的状况.
方法 用RT-PCR方法对49例CHC患者血清和其中14例肝组织进行HGVRNA检测.
结果 在49例CHC患者的血清和其中14例肝组织中HGVRNA阳性检出率分别为12.2%和21.4%，证实HGV和HCV感染在CHC患者血清和肝组织中同时存在，而肝组织中HGVRNA阳性检出率更高，其原因同受血或其直接经血液暴露密切相关.
结论 CHC患者血清和肝组织中存在HGV感染，而且感染率较高，故应加强对献血员进行HGVRNA和ALT筛查，以控制输血后庚型肝炎传播.
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主题词 肝炎，丙型/病毒学； 肝炎病毒/遗传学；RNA病毒/分离和提纯
于建国, 侯宪荣, 潘伟, 张光曙, 周秀梅.慢性丙型肝炎患者血清和肝组织中庚型肝炎病毒RNA检测.华人消化杂志,1998;6(7):580-581
0 引言
近年来，发现在一些CHC中存在着HGV感染，在众多人群中也存在不同程度的HGV感染. HGV感染主要经输血、注射等肠道外途径传播，并呈全球性分布，可形成持续性感染，与HCV混合感染较多. 特别经输血、血透、静脉注射、吸毒、母婴传播等途径感染的存在. 为了解我国CHC患者HGV感染状况，我们对49例CHC患者血清和其中14例肝组织进行HGVRNA检测，旨在了解CHC患者HGV感染的状况，为阐明HGV感染致病性与肝病慢性化关系提供依据.
, 百拇医药
1 对象和方法
1.1 对象 本组49例CHC患者均系我院1995/1997住院和门诊随访患者，其中男35例，女14例，年龄31岁～59岁，平均41.9岁. 其中有输血或输血制品史26例，手术、拔牙意外伤12例，血液透析史6例，疫苗接种和静脉注射史4例，职业献血员1例. CHC诊断均为血清抗-HCV和HCVRNA均阳性患者，并由临床、生化和肝穿活检病理学证实. 诊断按1995年北京第五次传染病与寄生虫病会议修订标准.
1.2 方法 肝组织活检同时静脉采血，分离血清后，存放于-80℃冻存备用. 血清RNA提取采用PCR法. 肝组织HGVRNA提取采用活检组织加裂解液500μl，混匀后加氯仿500μl，离心后取上清液约250μl移入另外离心管，加异丙醇250μl混匀，再次离心倒弃上液，沉淀后用真空抽干，至管内液体全部流出后加逆转录反应混合液混匀，98℃ 5min加12μl TaqDNA聚合酶，55℃ 1min，原管内加入12μlTaqDNA聚合酶和360μl PCR-2混合液滴石蜡油一滴，72℃ 45s 35个循环，经20g/L琼脂糖凝胶电泳后紫外灯下依分子量大小判断结果.
, 百拇医药
PCR扩增引物位于HGV 5＇非编码区(5＇-NCR)，引物合成设计由上海第二军医大学肝炎病毒研究实验室合成. 其外引物正义链序列为5＇-AAG CCC CAG AAA CCG ACG CC-3＇，反义链5＇-TGA AGG GCG ACG TGG ACC GT-3＇；内引物正义链序列为5＇-CGG CCA AAA GGT GGT GGA TG-3＇，反义链5＇-GTA ACG GGC TCG GTT TAA CG-3＇. 禽成髓细胞瘤病毒逆转录酶(AMV-RT)和dNTP均为美国Promega公司生产，TaqDNA聚合酶为上海生工公司产品.
统计学处理 采用χ2检验.
2 结果
本组49例CHC患者血清和其中14例肝组织中HGVRNA阳性检出率分别为12.2%和21.4%. 肝组织中HGVRNA阳性率较高于血清，经统计学处理，两者均有明显差异(P<0.05，表1).
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表1 血清和肝组织中HGV和HCV标志物关系
aP<0.05.
3 讨论
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近年来有关HGV的研究获得了重大突破，随着检测甲、乙、丙、丁和戊型肝炎病毒免疫学和分子生物学方法的建立，使大部分非甲非乙型肝炎得以分型诊断，但仍有10%～20%的急、慢性肝炎不能诊断. 1995年Simons et al[1]和Yoshiba et al在非甲～非戊型肝炎血清中检测到一种与肝炎相关的新型肝炎病毒RNA序列即HGV(GBV-C)RNA. 1996年初，Linnen et al[2]正式报道在肝炎中存在着HGV感染. 目前国外已发表了3个HGV全序列分别为9125、9392和 9103个碱基. 国内周育森et al1996年发表了HGV全序列cDNA全长9128个碱基. 我国北京、上海、南京、重庆、广州等也相继报道中国人HGV株部分基因序列. 目前，国内外对HGV感染的诊断主要是血清抗-HGV ELISA和HGVRNA PCR法检测，利用PCR法从CHC患者肝组织中检测HGVRNA还少见有报道. 此方法检测为急、慢性肝炎HGV感染的诊断提供了有效分子生物学手段. 本试验结果表明，CHC患者血清和肝组织中HGVRNA阳性检出率分别为12.2%和21.4%. 证实我国CHC患者血清和肝组织中存在着HGV感染和同HCV重叠感染，而且HGV感染率相当高. 血清中HGVRNA阳性率低于肝组织，而血清中HCVRNA阳性率高于肝组织，两者HGVRNA和HCVRNA阳性检出率均有明显差异(P<0.05).
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HGV感染易慢性化，大多数急性感染呈亚临床表现. 本组49例CHC患者经血清学和组织学证实有11例(22.4%)存在着HGV/HCV重叠感染，且同输血或输血制品密切相关.由于HGV同HBV和HCV其传播途径相似，临床上常见HGV同HCV同时感染，而且多见于CHC中青年患者. 本组一例32岁CHC患者6a前因外伤有输血史，ALT持续性升高，肝活检病理按Scheller分级标准为重度慢性肝炎并早期肝硬变(S4，G4)改变，提示HGV感染同HCV感染有加速慢性化导致肝硬变发展进程，但因临床观察病例数尚少，有待于进一步研究证实.
HGV感染呈全球性分布，在遗传进化上还是比较保守的. 我们利用现代分子生物学技术，采用PCR法，将保守序列作为引物，提高了血清和肝组织中HGVRNA阳性检出率. 不仅在CHC患者血清中而在肝活检组织中也检测到HGVRNA，提示HGV同HCV可能一样在肝组织中复制，肝组织HGV含量拷贝数可能较HCV高应予重视. 随着人们对HGV全基因序列研究和统一对HGV灵敏、特异性诊断试剂的研制和应用，人们将对血清、肝组织及HGV进行诸多方面研究，对庚型肝炎致病机制，流行病学、免疫学、病毒学的诊断和预防都将进一步认识.
, 百拇医药
4 参考文献
1 Simons JN, Leary TP, Dawson GJ Pilot Matias TJ, Scott muerhoff A, Schlauder GG et al. Isolaton of novel virus-lake
sequences associated with human hepatitis. Nature Med, 1995;1(6):563-569
2 Linnen J, Jr Wages J, Zhang-kect ZY, Fry KE, Krawczynski KZ, Alter H et al. Molecular cloning and disease association of hepatitis
G virus; A transfusion-transmissible agent. Science, 1996;271(26):505-508, 百拇医药(于建国1 侯宪荣1 潘伟2 张光曙1 周秀梅1)
2第二军医大学微生物教研室 上海市 200433
于建国，男，1953-07-06生，山东省东阿县人，汉族. 1977年上海第二军医大学医疗系本科毕业. 现任解放军88中心医院传染病科、济南军区肝病研究所副主任医师，主要从事肝脏疾病的临床与病理及分子生物学研究，获多项军队和省级科技进步奖及优秀论文奖. 国内外刊物发表论文76篇.
项目负责人 于建国，271000，解放军88医院传染科，山东省泰安市虎山路6号.
Correspondence to Jian-Guo Yu, Department of Infectious Diseases, Chinese PLA 88 Hospital, 6 Hushanlu, Taian 271000, Shandong Province, ChinaTel. +86·538·8223002-39365
, http://www.100md.com
收稿日期 1998-03-14
PCR detection of hepatitis G virus RNA in sera and liver tissues from patients with chronic hepatitis C
Jian-Guo Yu1, Xian-Rong Hou1, Wei Pan2, Guang-Shu Zhang1 and Xiu-Mei Zhou1
1Department of Infectious Diseases, Chinese PLA 88 Hospital, Taian 271000, Shandong Province, China
, 百拇医药
2Department of Microbiology, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China
Abstract
AIM To find out the condition of HGV infection in sera and liver tissues from patients with chronic hepatitis C.
METHODS RT-PCR was used to detect the HGVRNA in the sera from 49 patients and liver tissues from 14 patients with
, 百拇医药
chronic hepatitis C.
RESULTS In the sera of 49 patients and in the liver tissues of 14 patients with chronic hepatitis C, the positive detectable rates of HGVRNA were 12.2% (6/49) and 21.4% (3/14) respectively, which showed that HGV exists simultaneously in the sera and liver tissues of patients with chronic hepatitis C. The reason of the higher positive detectable rate of HGVRNA in the liver tissues was that HGV and HCV infection was closely related to transfusion and other direct exposure to blood.
, 百拇医药
CONCLUSION There are HGV and HCV infections in patients with chronic hepatitis C in southern Shandong, with a high detectable rate. It is imperative to further screen blood donors for HGVRNA and HCVRNA (PCR) and ALT so as to control HGV and HCV infection via blood transfusion.
Subject headings hepatitis C/virology; hepatitis viruses/genetics; RNA viruses/isolation & purification
Yu JG, Hou XR, Pan W, Zhang GS, Zhou XM. PCR detection of hepatitis G virus RNA in sera and liver tissues from patients with chronic hepatitis C. Huaren Xiaohua Zazhi,1998;6(7):580-581
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摘要
目的 了解慢性丙型肝炎(CHC)患者血清和肝组织中庚型肝炎病毒(HGV)感染的状况.
方法 用RT-PCR方法对49例CHC患者血清和其中14例肝组织进行HGVRNA检测.
结果 在49例CHC患者的血清和其中14例肝组织中HGVRNA阳性检出率分别为12.2%和21.4%，证实HGV和HCV感染在CHC患者血清和肝组织中同时存在，而肝组织中HGVRNA阳性检出率更高，其原因同受血或其直接经血液暴露密切相关.
结论 CHC患者血清和肝组织中存在HGV感染，而且感染率较高，故应加强对献血员进行HGVRNA和ALT筛查，以控制输血后庚型肝炎传播.
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主题词 肝炎，丙型/病毒学； 肝炎病毒/遗传学；RNA病毒/分离和提纯
于建国, 侯宪荣, 潘伟, 张光曙, 周秀梅.慢性丙型肝炎患者血清和肝组织中庚型肝炎病毒RNA检测.华人消化杂志,1998;6(7):580-581
0 引言
近年来，发现在一些CHC中存在着HGV感染，在众多人群中也存在不同程度的HGV感染. HGV感染主要经输血、注射等肠道外途径传播，并呈全球性分布，可形成持续性感染，与HCV混合感染较多. 特别经输血、血透、静脉注射、吸毒、母婴传播等途径感染的存在. 为了解我国CHC患者HGV感染状况，我们对49例CHC患者血清和其中14例肝组织进行HGVRNA检测，旨在了解CHC患者HGV感染的状况，为阐明HGV感染致病性与肝病慢性化关系提供依据.
, 百拇医药
1 对象和方法
1.1 对象 本组49例CHC患者均系我院1995/1997住院和门诊随访患者，其中男35例，女14例，年龄31岁～59岁，平均41.9岁. 其中有输血或输血制品史26例，手术、拔牙意外伤12例，血液透析史6例，疫苗接种和静脉注射史4例，职业献血员1例. CHC诊断均为血清抗-HCV和HCVRNA均阳性患者，并由临床、生化和肝穿活检病理学证实. 诊断按1995年北京第五次传染病与寄生虫病会议修订标准.
1.2 方法 肝组织活检同时静脉采血，分离血清后，存放于-80℃冻存备用. 血清RNA提取采用PCR法. 肝组织HGVRNA提取采用活检组织加裂解液500μl，混匀后加氯仿500μl，离心后取上清液约250μl移入另外离心管，加异丙醇250μl混匀，再次离心倒弃上液，沉淀后用真空抽干，至管内液体全部流出后加逆转录反应混合液混匀，98℃ 5min加12μl TaqDNA聚合酶，55℃ 1min，原管内加入12μlTaqDNA聚合酶和360μl PCR-2混合液滴石蜡油一滴，72℃ 45s 35个循环，经20g/L琼脂糖凝胶电泳后紫外灯下依分子量大小判断结果.
, 百拇医药
PCR扩增引物位于HGV 5＇非编码区(5＇-NCR)，引物合成设计由上海第二军医大学肝炎病毒研究实验室合成. 其外引物正义链序列为5＇-AAG CCC CAG AAA CCG ACG CC-3＇，反义链5＇-TGA AGG GCG ACG TGG ACC GT-3＇；内引物正义链序列为5＇-CGG CCA AAA GGT GGT GGA TG-3＇，反义链5＇-GTA ACG GGC TCG GTT TAA CG-3＇. 禽成髓细胞瘤病毒逆转录酶(AMV-RT)和dNTP均为美国Promega公司生产，TaqDNA聚合酶为上海生工公司产品.
统计学处理 采用χ2检验.
2 结果
本组49例CHC患者血清和其中14例肝组织中HGVRNA阳性检出率分别为12.2%和21.4%. 肝组织中HGVRNA阳性率较高于血清，经统计学处理，两者均有明显差异(P<0.05，表1).
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表1 血清和肝组织中HGV和HCV标志物关系
| 标本 | HGVRNA(+,%) | HCVAb(+，%) | HCVRNA(+，%) |
| 血清 | 6 (12.2) | 42 (85.7) | 44 (89.8)a |
| 肝组织 | 3 (21.4) | 0 (0.0) | 9 (64.3)a |
aP<0.05.
3 讨论
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近年来有关HGV的研究获得了重大突破，随着检测甲、乙、丙、丁和戊型肝炎病毒免疫学和分子生物学方法的建立，使大部分非甲非乙型肝炎得以分型诊断，但仍有10%～20%的急、慢性肝炎不能诊断. 1995年Simons et al[1]和Yoshiba et al在非甲～非戊型肝炎血清中检测到一种与肝炎相关的新型肝炎病毒RNA序列即HGV(GBV-C)RNA. 1996年初，Linnen et al[2]正式报道在肝炎中存在着HGV感染. 目前国外已发表了3个HGV全序列分别为9125、9392和 9103个碱基. 国内周育森et al1996年发表了HGV全序列cDNA全长9128个碱基. 我国北京、上海、南京、重庆、广州等也相继报道中国人HGV株部分基因序列. 目前，国内外对HGV感染的诊断主要是血清抗-HGV ELISA和HGVRNA PCR法检测，利用PCR法从CHC患者肝组织中检测HGVRNA还少见有报道. 此方法检测为急、慢性肝炎HGV感染的诊断提供了有效分子生物学手段. 本试验结果表明，CHC患者血清和肝组织中HGVRNA阳性检出率分别为12.2%和21.4%. 证实我国CHC患者血清和肝组织中存在着HGV感染和同HCV重叠感染，而且HGV感染率相当高. 血清中HGVRNA阳性率低于肝组织，而血清中HCVRNA阳性率高于肝组织，两者HGVRNA和HCVRNA阳性检出率均有明显差异(P<0.05).
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HGV感染易慢性化，大多数急性感染呈亚临床表现. 本组49例CHC患者经血清学和组织学证实有11例(22.4%)存在着HGV/HCV重叠感染，且同输血或输血制品密切相关.由于HGV同HBV和HCV其传播途径相似，临床上常见HGV同HCV同时感染，而且多见于CHC中青年患者. 本组一例32岁CHC患者6a前因外伤有输血史，ALT持续性升高，肝活检病理按Scheller分级标准为重度慢性肝炎并早期肝硬变(S4，G4)改变，提示HGV感染同HCV感染有加速慢性化导致肝硬变发展进程，但因临床观察病例数尚少，有待于进一步研究证实.
HGV感染呈全球性分布，在遗传进化上还是比较保守的. 我们利用现代分子生物学技术，采用PCR法，将保守序列作为引物，提高了血清和肝组织中HGVRNA阳性检出率. 不仅在CHC患者血清中而在肝活检组织中也检测到HGVRNA，提示HGV同HCV可能一样在肝组织中复制，肝组织HGV含量拷贝数可能较HCV高应予重视. 随着人们对HGV全基因序列研究和统一对HGV灵敏、特异性诊断试剂的研制和应用，人们将对血清、肝组织及HGV进行诸多方面研究，对庚型肝炎致病机制，流行病学、免疫学、病毒学的诊断和预防都将进一步认识.
, 百拇医药
4 参考文献
1 Simons JN, Leary TP, Dawson GJ Pilot Matias TJ, Scott muerhoff A, Schlauder GG et al. Isolaton of novel virus-lake
sequences associated with human hepatitis. Nature Med, 1995;1(6):563-569
2 Linnen J, Jr Wages J, Zhang-kect ZY, Fry KE, Krawczynski KZ, Alter H et al. Molecular cloning and disease association of hepatitis
G virus; A transfusion-transmissible agent. Science, 1996;271(26):505-508, 百拇医药(于建国1 侯宪荣1 潘伟2 张光曙1 周秀梅1)