肝细胞提取物组分S4对肿瘤细胞体外增殖的影响
解放军458医院 解放军传染病中心 广东省广州市 510602
李茹冰，女，1971-09-27生，吉林双辽人，汉族. 1994年吉林医学院检验系毕业，检验医师，发表论文1篇.
项目负责人 李茹冰，510602，广东省广州市，解放军458医院 解放军传染病中心.
Correspondence to Ru-Bing Li, Chinese PLA Infectious Disease Centre, Guangzhou Air Force 458 Hospital, Guangzhou 510602, Guangdong Province, China
Tel. +86·20·87600525-815
, 百拇医药
收稿日期 1998-03-23
Effect of hepatocyte extraction fraction S4 on proliferations of tumor cell lines in vitro
Ru-Bing Li, Xiang-Ping Kong, Qing-Yan Zou, Liang-Ping Yang, Ping-Lu Zeng, Yi-Jun Zhang, Zhou-Yao Yu and Zhuo-Liang Li
Chinese PLA Infectious Disease Centre, Guangzhou Air Force 458 Hospital, Guangzhou 510602, Guangdong Province, China
, 百拇医药
Abstract
AIM To study the growth inhibitory effect of hepatocyte extraction fraction S4 on 8 tumor cell lines in vitro.
METHODS The effect of the 1mg/L-10mg/L S4 on the tumor cell lines was investigated using MTT colorimetric assay in different periods (0-12, 24,48 or 72h).
RESULTS The inhibitory (concentration IC50mg/L) effects of S4 on 7402, 7721, 7703 and Hepe hepatoma cells in 72h were 3.9，4.2，9.5 and 6.5, respectively. The inhibitory (concentration IC50mg/L) effects (IC50) on SGC-7901, HCT-8 and GLC-82 were 14.3，9.9 and 5.4. S4 had no apparent inhibitory effect on CNE-2 in 48h.
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CONCLUSION S4 inhibits 7 tumor cell lines proliferation in a clear dose and time-dependent manner.
Subject headings liver neoplasm, experiment/pathology; liver/cytology; tumor cell, cultured;
liver extracts/pharmacology; antineoplastic agents
Li RB, Kong XP, Zou QY, Yang LP, Zeng PL, Zhang YJ, Yu ZY, Li ZL. Effect of hepatocyte extraction fraction S4 on proliferations of 8 tumor cell lines in vitro.Huaren Xiaohua Zazhi,1998;6(7):591-593
, 百拇医药
摘要
目的 观察肝细胞提取物组分S4对8株肿瘤细胞增殖的影响.
方法 采用MTT比色法研究不同浓度S4对8株肿瘤细胞不同时相增殖的影响.
结果 S4对7402，7721，7703，Hepe肝癌细胞作用72h后IC50(mg/L)分别为3.9，4.2，9.5和6.5. 对胃腺癌细胞(SGC-7901)、回盲部腺癌细胞(HCT-8)、肺腺癌细胞(GLC-82)作用72h的IC50分别为14.3，9.9和5.4. 对鼻咽癌细胞(CNE-2) 48h未显示抑制作用.
结论 S4抑制7株肿瘤细胞呈现明显的量效与时效关系，在1mg/L～10mg/L浓度范围内及24h～72h时限内，抑制作用随剂量增加、时间延长而增强.
, 百拇医药
主题词 肝提取物/药理学；肿瘤细胞，培养的/药物作用；肝肿瘤，实验性/病理学；肝/细胞学；抗肿瘤药
李茹冰, 孔祥平, 邹清雁, 杨联萍, 曾平鲁, 张宜俊, 余宙耀, 李灼亮. 肝细胞提取物组分S4对肿瘤细胞体外增殖的影响.
华人消化杂志,1998;6(7):591-593
0 引言
以往研究证明[1]，从肝细胞提取物中分离纯化的单一组分活性物质S4，抑制BEL-7402肝癌细胞增殖活性大于肝细胞提取物100倍，诱导BEL-7402细胞凋亡有良好的量效关系. S4对不同来源的肝癌细胞是否有相似的作用，是否抑制非肝癌系肿瘤细胞生长，一直是我们关注的问题. 我们观察了S4对4株肝癌细胞和4株非肝癌肿瘤细胞增殖的影响，进一步观察其时相和量效规律.
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1 材料和方法
1.1 材料 ①肝细胞提取肽纯化组分S4的制备参见文献[1]. ②细胞系及培养条件：BEL-7402肝癌细胞引自中日友好医院中西医结合研究所；SMMC-7721，QGY-7703肝癌细胞系和HCT-8回盲部腺癌及GLC-82肺腺癌细胞系购自中国科学院细胞所；CNE-2鼻咽癌细胞系由中山医科大学肿瘤研究所惠赠；SGC-7901胃腺癌细胞由第四军医大学生化教研室惠赠；Hepe小鼠肝癌细胞由中山医科大学实验动物中心惠赠. 实验时，8种细胞株均接种于DMEM/F12培养液中，培养液含100ml/L小牛血清，青、链霉素各100mg/L，在37℃，50mg/L CO2的培养箱内培养并传代，传代用2.5g/L胰蛋白酶加0.2g/LEDTA消化液消化. ③溴化噻唑蓝四氮唑(MTT)、二甲亚砜(DMSO)、DMEM/F12培养液均为Sigma产品，小牛血清购自杭州四季青研究所.
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1.2 方法 肝细胞提取肽S4组分对肿瘤细胞增殖影响的测定，采用MTT法. 取对数生长期细胞稀释成(2.5～5.0)×107细胞/L，接种96孔培养板，0.1ml/孔. 对照组加等体积培养液，置37℃，50ml/L CO2，培养箱培养24h，以使其恢复正常状态. 置4℃，1h后立即恢复37℃，换液后加入不同浓度(1，5，10mg/L) S4 0.1ml/孔，每浓度平均5孔. 分别于12，24，48，72h取出，弃上清，每孔加入0.15g/L MTT 0.1ml,于37℃继续孵育4h～6h，弃上清，每孔加入DMSO 0.1ml以溶解MTT甲 月替 沉淀，振荡15min后在960酶标仪上测定570nm处A(OD)值(参考波长630nm).
统计学处理 数据以x±s表示，统计学处理按t检验进行.
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2 结果
S4对8种肿瘤细胞不同时间增殖的影响结果见表1. 根据实验结果，为便于比较，我们选定作用时间为48h. 不同浓度S4对8种肿瘤细胞作用后结果见表2及图1.
图1 不同剂量S4(48h)对8种肿瘤细胞的影响.
表1 S4作用不同时间对8种肿瘤细胞增殖的影响
, 百拇医药
*IC50为半数抑制浓度.
表2 不同剂量S4(48h)对8种肿瘤细胞的抑制作用 (n=5,x±s)
, 百拇医药
bP<0.01 vs Zerogroup抑制率(%)=100%-(实验组A/对照组A×100%).
3 讨论
细胞的增殖、分化及凋亡是受基因的表达与关闭调控的. 目前的研究表明，细胞凋亡受阻是人体恶性肿瘤发生的重要因素之一. 在以前的工作中我们证实，在肝提取物中存在抑制某些肿瘤细胞增殖的物质，并可诱导细胞凋亡[2，3]. 这一物质与促进受损肝脏及单层培养肝细胞DNA合成的物质生物学行为不同，其纯化组分可以诱导BEL-7402肝癌细胞凋亡[4]. 本结果表明，S4对肿瘤细胞具有较强的抑制增殖作用，并呈现较好的时效与量效关系. S4与7402，7721，7703人肝癌细胞及小鼠Hepe肝癌细胞作用72h IC50分别为3.9，4.2，9.5和6.5；对SGC-7901，HCT-8，GLC-82作用72h，IC50分别为14.3，9.9和5.4；对CNE-2作用48h未显示抑制作用. 这一结果显示了S4对肝癌细胞有较强抑制特异性. 这一抑制作用，在S4以1mg/L～10mg/L浓度范围内，24h～72h时限内，随浓度、时间增加而得到加强. 在另一项研究中，我们亦证实，S4抑制肿瘤细胞增殖是通过诱导细胞凋亡实现的，而这种诱导作用与调节p53，Fas，Bcl-2及c-myc基因的表达有密切关系. 其中Bcl-2基因的表达与否与强弱是十分重要的.
, http://www.100md.com
S4作为一种天然提取、纯化的肝提取肽，有较强的诱导肿瘤细胞凋亡作用，并对肝细胞源的肿瘤细胞具有一定特异性，已具备天然提取物抑癌药物的基本标准，具有重要的研究与开发价值. 进一步探讨S4抑制肿瘤细胞增殖、诱导凋亡及调节基因表达的信号转导则有利于阐明细胞因子在肿瘤生物学治疗中的实际意义.
4 参考文献
1 孔祥平，邹清雁，杨联萍，尤玉琴，余宙耀，张宜俊 et al. 肝细胞提取物对肝癌细胞(BEL-7402)凋亡相关基因表达的影响.
中国病理生理杂志，1997；13(6)：570-573
2 简志翰, Kren Li, Stephen KW HO, P.J.Johnson, 张宜俊，孔祥平. 促肝细胞生(pHGF)对六种人癌细胞株的抑制作用及诱导HL-60白血病
细胞凋亡. 临床肝胆病杂志，1995；11(15)：20-28
3 魏育林，赵天德，金恩源，曹炜，牛建昭，刘德若 et al.促肝细胞生长素诱导人肝癌细胞(BEL-7402)凋亡. 上海免疫学杂志，1996；16(1)：33-36
4 孔祥平，邹清雁，杨联萍，张宜俊，曾平鲁，李灼亮. et al. 肝细胞提取物对正常肝和人肝癌细胞作用的研究. 上海免疫学杂志，1997；17(2)：108-111, http://www.100md.com(李茹冰 孔祥平 邹清雁 杨联萍 曾平鲁 张宜俊 余宙耀 李灼亮)
李茹冰，女，1971-09-27生，吉林双辽人，汉族. 1994年吉林医学院检验系毕业，检验医师，发表论文1篇.
项目负责人 李茹冰，510602，广东省广州市，解放军458医院 解放军传染病中心.
Correspondence to Ru-Bing Li, Chinese PLA Infectious Disease Centre, Guangzhou Air Force 458 Hospital, Guangzhou 510602, Guangdong Province, China
Tel. +86·20·87600525-815
, 百拇医药
收稿日期 1998-03-23
Effect of hepatocyte extraction fraction S4 on proliferations of tumor cell lines in vitro
Ru-Bing Li, Xiang-Ping Kong, Qing-Yan Zou, Liang-Ping Yang, Ping-Lu Zeng, Yi-Jun Zhang, Zhou-Yao Yu and Zhuo-Liang Li
Chinese PLA Infectious Disease Centre, Guangzhou Air Force 458 Hospital, Guangzhou 510602, Guangdong Province, China
, 百拇医药
Abstract
AIM To study the growth inhibitory effect of hepatocyte extraction fraction S4 on 8 tumor cell lines in vitro.
METHODS The effect of the 1mg/L-10mg/L S4 on the tumor cell lines was investigated using MTT colorimetric assay in different periods (0-12, 24,48 or 72h).
RESULTS The inhibitory (concentration IC50mg/L) effects of S4 on 7402, 7721, 7703 and Hepe hepatoma cells in 72h were 3.9，4.2，9.5 and 6.5, respectively. The inhibitory (concentration IC50mg/L) effects (IC50) on SGC-7901, HCT-8 and GLC-82 were 14.3，9.9 and 5.4. S4 had no apparent inhibitory effect on CNE-2 in 48h.
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CONCLUSION S4 inhibits 7 tumor cell lines proliferation in a clear dose and time-dependent manner.
Subject headings liver neoplasm, experiment/pathology; liver/cytology; tumor cell, cultured;
liver extracts/pharmacology; antineoplastic agents
Li RB, Kong XP, Zou QY, Yang LP, Zeng PL, Zhang YJ, Yu ZY, Li ZL. Effect of hepatocyte extraction fraction S4 on proliferations of 8 tumor cell lines in vitro.Huaren Xiaohua Zazhi,1998;6(7):591-593
, 百拇医药
摘要
目的 观察肝细胞提取物组分S4对8株肿瘤细胞增殖的影响.
方法 采用MTT比色法研究不同浓度S4对8株肿瘤细胞不同时相增殖的影响.
结果 S4对7402，7721，7703，Hepe肝癌细胞作用72h后IC50(mg/L)分别为3.9，4.2，9.5和6.5. 对胃腺癌细胞(SGC-7901)、回盲部腺癌细胞(HCT-8)、肺腺癌细胞(GLC-82)作用72h的IC50分别为14.3，9.9和5.4. 对鼻咽癌细胞(CNE-2) 48h未显示抑制作用.
结论 S4抑制7株肿瘤细胞呈现明显的量效与时效关系，在1mg/L～10mg/L浓度范围内及24h～72h时限内，抑制作用随剂量增加、时间延长而增强.
, 百拇医药
主题词 肝提取物/药理学；肿瘤细胞，培养的/药物作用；肝肿瘤，实验性/病理学；肝/细胞学；抗肿瘤药
李茹冰, 孔祥平, 邹清雁, 杨联萍, 曾平鲁, 张宜俊, 余宙耀, 李灼亮. 肝细胞提取物组分S4对肿瘤细胞体外增殖的影响.
华人消化杂志,1998;6(7):591-593
0 引言
以往研究证明[1]，从肝细胞提取物中分离纯化的单一组分活性物质S4，抑制BEL-7402肝癌细胞增殖活性大于肝细胞提取物100倍，诱导BEL-7402细胞凋亡有良好的量效关系. S4对不同来源的肝癌细胞是否有相似的作用，是否抑制非肝癌系肿瘤细胞生长，一直是我们关注的问题. 我们观察了S4对4株肝癌细胞和4株非肝癌肿瘤细胞增殖的影响，进一步观察其时相和量效规律.
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 材料 ①肝细胞提取肽纯化组分S4的制备参见文献[1]. ②细胞系及培养条件：BEL-7402肝癌细胞引自中日友好医院中西医结合研究所；SMMC-7721，QGY-7703肝癌细胞系和HCT-8回盲部腺癌及GLC-82肺腺癌细胞系购自中国科学院细胞所；CNE-2鼻咽癌细胞系由中山医科大学肿瘤研究所惠赠；SGC-7901胃腺癌细胞由第四军医大学生化教研室惠赠；Hepe小鼠肝癌细胞由中山医科大学实验动物中心惠赠. 实验时，8种细胞株均接种于DMEM/F12培养液中，培养液含100ml/L小牛血清，青、链霉素各100mg/L，在37℃，50mg/L CO2的培养箱内培养并传代，传代用2.5g/L胰蛋白酶加0.2g/LEDTA消化液消化. ③溴化噻唑蓝四氮唑(MTT)、二甲亚砜(DMSO)、DMEM/F12培养液均为Sigma产品，小牛血清购自杭州四季青研究所.
, http://www.100md.com
1.2 方法 肝细胞提取肽S4组分对肿瘤细胞增殖影响的测定，采用MTT法. 取对数生长期细胞稀释成(2.5～5.0)×107细胞/L，接种96孔培养板，0.1ml/孔. 对照组加等体积培养液，置37℃，50ml/L CO2，培养箱培养24h，以使其恢复正常状态. 置4℃，1h后立即恢复37℃，换液后加入不同浓度(1，5，10mg/L) S4 0.1ml/孔，每浓度平均5孔. 分别于12，24，48，72h取出，弃上清，每孔加入0.15g/L MTT 0.1ml,于37℃继续孵育4h～6h，弃上清，每孔加入DMSO 0.1ml以溶解MTT甲 月替 沉淀，振荡15min后在960酶标仪上测定570nm处A(OD)值(参考波长630nm).
统计学处理 数据以x±s表示，统计学处理按t检验进行.
, http://www.100md.com
2 结果
S4对8种肿瘤细胞不同时间增殖的影响结果见表1. 根据实验结果，为便于比较，我们选定作用时间为48h. 不同浓度S4对8种肿瘤细胞作用后结果见表2及图1.
图1 不同剂量S4(48h)对8种肿瘤细胞的影响.
表1 S4作用不同时间对8种肿瘤细胞增殖的影响
| 细 胞 | IC50*(mg/L) | |||
| 12h | 24h | 48h | 72h | |
| BEL-7402 | - | 8.2 | 5.0 | 3.9 |
| SMMC-7721 | - | - | 8.4 | 4.2 |
| QGY-7703 | - | - | 24.2 | 9.5 |
| Hepe | - | 15.2 | 8.9 | 6.5 |
| SGC-7901 | - | 30.2 | 19.7 | 14.3 |
| GLC-82 | - | 12.4 | 9.9 | 5.4 |
| CNE-2 | - | - | - | 8.9 |
| HCT-8 | - | - | - | 9.9 |
, 百拇医药
*IC50为半数抑制浓度.
表2 不同剂量S4(48h)对8种肿瘤细胞的抑制作用 (n=5,x±s)
| 细 胞 | S4(ug/ml) | A | 抑制率 |
| SMMC-7721 | 0 | 0.214±0.009 | |
| 1 | 0.182±0.007 | 25.0b | |
| 5 | 0.146±0.008 | 32.0b | |
| 10 | 0.086±0.006 | 60.0b | |
| BEL-7402 | 0 | 0.240±0.031 | |
| 1 | 0.229±0.030 | 4.6 | |
| 5 | 0.115±0.024 | 52.1b | |
| 10 | 0.078±0.023 | 67.5b | |
| QGY-7703 | 0 | 0.220±0.007 | |
| 1 | 0.185±0.020 | 16.0b | |
| 5 | 0.168±0.014 | 24.0b | |
| 10 | 0.120±0.021 | 45.5b | |
| Hepe | 0 | 0.174±0.002 | |
| 1 | 0.142±0.003 | 18.4b | |
| 5 | 0.105±0.004 | 39.7b | |
| 10 | 0.082±0.004 | 52.9b | |
| SGC-7901 | 0 | 0.211±0.018 | |
| 1 | 0.202±0.011 | 4.3 | |
| 5 | 0.160±0.003 | 24.2b | |
| 10 | 0.122±0.012 | 42.2b | |
| CNE-2 | 0 | 0.397±0.038 | |
| 1 | 0.389±0.048 | 2.0 | |
| 5 | 0.387±0.039 | 2.5 | |
| 10 | 0.372±0.048 | 6.3 | |
| HCT-8 | 0 | 0.506±0.033 | |
| 1 | 0.501±0.033 | 1.0 | |
| 5 | 0.457±0.030 | 10.0b | |
| 10 | 0.411±0.024 | 19.0b | |
| GLC-82 | 0 | 0.196±0.002 | |
| 1 | 0.156±0.006 | 20.4b | |
| 5 | 0.123±0.01 | 37.2b | |
| 10 | 0.093±0.017 | 52.6b |
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bP<0.01 vs Zerogroup抑制率(%)=100%-(实验组A/对照组A×100%).
3 讨论
细胞的增殖、分化及凋亡是受基因的表达与关闭调控的. 目前的研究表明，细胞凋亡受阻是人体恶性肿瘤发生的重要因素之一. 在以前的工作中我们证实，在肝提取物中存在抑制某些肿瘤细胞增殖的物质，并可诱导细胞凋亡[2，3]. 这一物质与促进受损肝脏及单层培养肝细胞DNA合成的物质生物学行为不同，其纯化组分可以诱导BEL-7402肝癌细胞凋亡[4]. 本结果表明，S4对肿瘤细胞具有较强的抑制增殖作用，并呈现较好的时效与量效关系. S4与7402，7721，7703人肝癌细胞及小鼠Hepe肝癌细胞作用72h IC50分别为3.9，4.2，9.5和6.5；对SGC-7901，HCT-8，GLC-82作用72h，IC50分别为14.3，9.9和5.4；对CNE-2作用48h未显示抑制作用. 这一结果显示了S4对肝癌细胞有较强抑制特异性. 这一抑制作用，在S4以1mg/L～10mg/L浓度范围内，24h～72h时限内，随浓度、时间增加而得到加强. 在另一项研究中，我们亦证实，S4抑制肿瘤细胞增殖是通过诱导细胞凋亡实现的，而这种诱导作用与调节p53，Fas，Bcl-2及c-myc基因的表达有密切关系. 其中Bcl-2基因的表达与否与强弱是十分重要的.
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S4作为一种天然提取、纯化的肝提取肽，有较强的诱导肿瘤细胞凋亡作用，并对肝细胞源的肿瘤细胞具有一定特异性，已具备天然提取物抑癌药物的基本标准，具有重要的研究与开发价值. 进一步探讨S4抑制肿瘤细胞增殖、诱导凋亡及调节基因表达的信号转导则有利于阐明细胞因子在肿瘤生物学治疗中的实际意义.
4 参考文献
1 孔祥平，邹清雁，杨联萍，尤玉琴，余宙耀，张宜俊 et al. 肝细胞提取物对肝癌细胞(BEL-7402)凋亡相关基因表达的影响.
中国病理生理杂志，1997；13(6)：570-573
2 简志翰, Kren Li, Stephen KW HO, P.J.Johnson, 张宜俊，孔祥平. 促肝细胞生(pHGF)对六种人癌细胞株的抑制作用及诱导HL-60白血病
细胞凋亡. 临床肝胆病杂志，1995；11(15)：20-28
3 魏育林，赵天德，金恩源，曹炜，牛建昭，刘德若 et al.促肝细胞生长素诱导人肝癌细胞(BEL-7402)凋亡. 上海免疫学杂志，1996；16(1)：33-36
4 孔祥平，邹清雁，杨联萍，张宜俊，曾平鲁，李灼亮. et al. 肝细胞提取物对正常肝和人肝癌细胞作用的研究. 上海免疫学杂志，1997；17(2)：108-111, http://www.100md.com(李茹冰 孔祥平 邹清雁 杨联萍 曾平鲁 张宜俊 余宙耀 李灼亮)