顺铂诱导人胃癌SGC-7901细胞凋亡的体外实验
1第四军医大学唐都医院消化科 陕西省西安市 710038
2武警山东总队医院内二科 山东省济南市 250101
辛召平，男，1962-06-27生，山东省济南市人，汉族. 1983年菏泽医专大专毕业，主治医师，主要从事消化内科临床工作，发表论文5篇.
项目负责人 辛召平，250101，武警山东总队医院内二科，山东省济南市历城区英雄山路18号.
Correspondence to Zhao-Ping Xin, Department of Internal Medicine, Shandong Provincial Crops Hospital, Chinese People＇s Armed Police, 18 Yingxiong Shanlu, Licheng District, Jinan 250101, Shandong Province, China
, 百拇医药
Tel. +86·531·8985068-6273或4222(O)
收稿日期 1998-07-06
Experimental study on induction of apoptosis by cisplatin in human gastric carcinoma cell line SGC-7901
Zhao-Ping Xin1,2, Cai-Fu Xu1, Yu-Xin Huang1, Qin-Sheng Wen1, Chao-Zhen Xu2 and Yong-Feng Zhao1
, 百拇医药
1Department of Gastroenterology, Tangdu Hospital, The Fourth Military Medical University, Xi＇an 710038, Sha'anxi Province, China2Department of Internal Medicine, Shandong Provincial Crops Hospital, Chinese People＇s Armed Police, Jinan 250101, Shandong Province, China
Abstract
AIM To investigate the induction of apoptosis by cisplatin (CDDP) in gastric carcinoma cell line for demonstration of mechanism of treatment of gastric carcinoma with CDDP.
, http://www.100md.com
METHODS A human gastric carcinoma cell line SGC-7901 was cultured in full medium with variable doses of cisplatin for different hours. The treated cells were examined under light microscope and transmission electron microscope (TEM). Cell cycle analysis was performed on flow cytometry (FCM).
RESULTS After treatment with CDDP, the cells became smaller and condensed. Their chromatin clinged to the periphery of the nuclear. Apoptotic bodies were observed. There were apoptotic peaks in cell cycle analysis on FCM. The percentages of apoptotic cell were 9.3% and 14.9% after being treated with CDDP at 25mg/L for 24h and 50mg/L for 16h.
, 百拇医药
CONCLUSION CDDP may induce apoptosis in the gastric carcinoma cell line SGC-7901 which led to the death of the cancer cell.
Subject headings stomach neoplasms; apoptosis; cisplatin; tumor cell, cultured; flow cytometry
Xin ZP, Xu CF, Huang YX, Wen QS, Xu CZ, Zhao YF. Experimental study on induction of apoptosis by cisplatin in human gastric carcinoma cell line SGC-7901.Huaren Xiaohua Zazhi, 1998;6(10):844-846
, 百拇医药
摘要
目的 探讨顺铂对胃癌(SGC-7901)细胞凋亡的诱导作用，以揭示顺铂治疗胃癌的作用机制.
方法 选用不同剂量顺铂与人胃癌细胞系SGC-7901共同孵育不同时间后，应用光镜、电镜进行细胞形态学观察；细胞DNA经特异性荧光染色后，用流式细胞仪分析细胞周期变化.
结果 细胞经顺铂处理后浓缩、深染、致密的染色质沿核膜下凝集、有凋亡小体形成. 细胞周期分析G1期峰前出现典型的细胞凋亡峰，以25mg/L顺铂作用24h，50mg/L作用16h为例，定量分析凋亡细胞发生率分别为9.3%和14.9%.
结论 顺铂可通过诱导人胃癌细胞系SGC-7901发生细胞凋亡达到消灭肿瘤细胞的目的.
, http://www.100md.com
主题词 胃肿瘤；细胞凋亡；顺铂；肿瘤细胞，培养的；流式细胞术
辛召平, 许才绂, 黄裕新, 闻勤生, 许朝珍,赵永锋.顺铂诱导人胃癌SGC-7901细胞凋亡的体外实验.华人消化杂志,1998;6(10):844-846
0 引言
细胞凋亡(apoptosis)是一种生理性细胞程序化死亡(programmed cell death, PCD)，它不仅对保持机体自身稳定具有重要意义，还与肿瘤的发生、发展密切相关. 肿瘤细胞凋亡的研究对进一步探讨肿瘤发病机制及肿瘤的预防和治疗具有十分重要的意义. 我们应用光镜、电镜及流式细胞术，分析了顺铂对人胃癌细胞系SGC-7901细胞凋亡的诱导作用，从另一侧面为探讨胃癌治疗机制提供实验资料.
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 材料 人胃癌细胞系SGC-7901为中分化腺癌(由第四军医大学口腔医院生物系提供). 将细胞接种于含100mL/L热灭活小牛血清的RPMI 1640(美国GIBCO公司)培养液中，置于37℃含50mL/L CO2的饱和湿度孵箱内连续培养，2d～3d换液一次，2.5g/L胰蛋白酶常规消化传代，取对数生长期细胞实验.
1.2 方法 ①顺铂处理细胞：将预溶于生理盐水中的顺铂(济南齐鲁制药厂)加入培养细胞的新鲜培养液中，使终浓度达到不同实验要求. 与细胞共同孵育不同时间后送检. 设常规培养细胞为对照. ②光镜观察：取药物处理后的单层附壁细胞，弃去培养液，常规HE染色后观察形态学变化. ③电镜观察：细胞经磷酸缓冲液(PBS)洗涤后离心成团，4℃ 30mL/L戊二醛固定，10g/L四氧化锇后固定，梯度乙醇脱水，树脂包埋，制备成超薄切片，电子染色，JEM-2000EX(日本JEOL)电镜下观察超微结构. ④流式细胞仪分析：离心收集细胞，PBS洗涤后制成单细胞悬液(1×109/L)，加-20℃ 700mL/L乙醇固定，碘化丙锭(PI) 300μL染色30min，350目筛网过滤，EPICS-profile Ⅱ流式细胞仪(美国coulter)进行DNA含量及细胞周期分析，Multicycle(美国phoenix)计算机软件处理结果.
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2 结果
2.1 光镜结果 细胞经顺铂作用后，体积缩小，核固缩深染，最终裂解成碎片而形成膜被小体，即凋亡小体(apoptosis body,图1). 对照组细胞生长良好无此现象(图2).
2.2 电镜结果 细胞凋亡早期核仁消失，致密的染色质沿核膜下凝集(图3). 固缩核裂解成胞膜包绕的碎块，电子密度较大，细胞器密集压缩，即凋亡小体(图4). 对照组细胞呈现恶性肿瘤细胞特征，无凋亡小体形成(图5).
2.3 流式细胞仪分析 细胞周期直方图上，G1峰前出现的亚二倍体峰，即凋亡细胞所形成的凋亡峰(AP峰)[1]，是凋亡细胞核固缩、DNA裂解的特征结果，可通过凋亡峰的面积测出凋亡细胞在整个细胞群中所占比例. 流式细胞仪分析显示25mg/L顺铂作用细胞24h后，G1峰前出现了凋亡峰，凋亡细胞占9.3%(图6)，50mg/L顺铂作用16h后，凋亡细胞占14.9%(图7). 而对照组细胞G1峰前无凋亡峰存在(图8).
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图1 SGC-7901细胞凋亡光镜观察↑示凋亡小体. HE×400
图2 SGC-7901细胞光镜形态. HE×400
图3 SGC-7901细胞凋亡早期形态特征. TEM×6000
图4 ↑示凋亡小体形成. TEM×4000
图5 SGC-7901细胞电镜形态. TEM×4000
, http://www.100md.com 图6 25mg/L CDDP作用24h后细胞周期直方图，凋亡细胞占9.3%.
图7 50mg/L CDDP作用16h后细胞周期直方图，凋亡细胞占14.9%.
图8 常规培养SGC-7901细胞的细胞周期分析.
3 讨论
1972年Kerr et al[2]首次提出细胞凋亡的概念，迄今细胞凋亡的发生机制仍不十分清楚. 目前认为细胞凋亡发生后有以下形态学特征[3]：在早期表现为内质网和细胞膜上出现一些小泡，细胞体积缩小，胞膜皱缩，但其细胞内膜结构尚完整，没有细胞内溶物的释放，与细胞坏死过程中出现的自溶现象截然不同. 中期细胞核发生固缩，染色质浓缩边集，形成由膜状物包裹内溶物的小体，称之为凋亡小体. 后期凋亡小体被邻近的正常细胞或吞噬细胞识别、吞噬而消失. 我们选用顺铂处理SGC-7901细胞后，细胞发生明显的形态学改变，与Kerr描述的特征相一致. 药物处理后的原附壁生长的培养细胞发生凋亡时，相邻细胞间失去彼此连接，收缩变圆，轮廓更加清晰可见，细胞附壁能力减弱，易从培养瓶壁上脱落下来，这些特征应作为判断培养细胞的细胞凋亡的形态学标准之一.
, 百拇医药
研究表明，流式细胞测量法可使凋亡的研究由定性发展为定量分析，同时既可检测出凋亡细胞的比例，又可将凋亡与坏死同时存在的细胞群加以区分，尤其为抗癌药物诱导凋亡的研究提供了较为理想的分析方法. 实验结果显示，25mg/L顺铂作用24h及50mg/L顺铂作用16h，G1峰前均出现了明显的凋亡峰(AP峰).
目前研究抗癌药物对肿瘤细胞的凋亡作用，在国内外已成为热点. 顺铂是多种联合化疗方案的核心药物，在胃癌治疗中效果肯定. 研究表明顺铂对多种肿瘤细胞有诱导凋亡作用，马向东et al[4]应用顺铂作用卵巢癌细胞，使卵巢癌细胞发生了广泛的凋亡. 陈卫星et al[5]应用热疗和顺铂合用诱导人胃癌细胞株MKN28细胞，采用电镜观察发现细胞出现了凋亡特征. 本实验单独采用顺铂同样使人胃癌细胞系SGC-7901细胞出现了凋亡现象，国内尚未见报道. 通过本实验研究从另一侧面揭示了顺铂治疗胃癌的作用机制，也为胃癌的化疗提供了实验资料.
, 百拇医药
4 参考文献
1 Telford WC, King LE, Fraker PJ. Rapid quantitation of apoptosis in pure heterogeneous cell populations using flow cylometry. J
Immunol Method, 1994;172(1):1-6
2 Kerr JFR, Harmon BV. Apoptosis: its significance in cancer and cancer therapy. Cancer, 1994;73(8):2013-2026
3 Martin ST, Gree DR, Cotter TG. Dieing with death: dissecting the components of the apoptosis machinery. TIBS,
1994;19(1):26-32
4 马向东，陈必良，叶永清，郑维国，辛晓燕，王德堂. 顺铂诱导人卵巢癌细胞系HO-8910细胞凋亡. 癌症，1997；16(3)：180-182
5 陈卫星，黄怀德，季峰. 热疗和顺铂合用诱导人胃癌细胞株MKN28凋谢的研究. 实用肿瘤杂志，1995；10(4)：221-222, 百拇医药(辛召平1,2 许才绂1 黄裕新1 闻勤生1 许朝珍2 赵永锋1)
2武警山东总队医院内二科 山东省济南市 250101
辛召平，男，1962-06-27生，山东省济南市人，汉族. 1983年菏泽医专大专毕业，主治医师，主要从事消化内科临床工作，发表论文5篇.
项目负责人 辛召平，250101，武警山东总队医院内二科，山东省济南市历城区英雄山路18号.
Correspondence to Zhao-Ping Xin, Department of Internal Medicine, Shandong Provincial Crops Hospital, Chinese People＇s Armed Police, 18 Yingxiong Shanlu, Licheng District, Jinan 250101, Shandong Province, China
, 百拇医药
Tel. +86·531·8985068-6273或4222(O)
收稿日期 1998-07-06
Experimental study on induction of apoptosis by cisplatin in human gastric carcinoma cell line SGC-7901
Zhao-Ping Xin1,2, Cai-Fu Xu1, Yu-Xin Huang1, Qin-Sheng Wen1, Chao-Zhen Xu2 and Yong-Feng Zhao1
, 百拇医药
1Department of Gastroenterology, Tangdu Hospital, The Fourth Military Medical University, Xi＇an 710038, Sha'anxi Province, China2Department of Internal Medicine, Shandong Provincial Crops Hospital, Chinese People＇s Armed Police, Jinan 250101, Shandong Province, China
Abstract
AIM To investigate the induction of apoptosis by cisplatin (CDDP) in gastric carcinoma cell line for demonstration of mechanism of treatment of gastric carcinoma with CDDP.
, http://www.100md.com
METHODS A human gastric carcinoma cell line SGC-7901 was cultured in full medium with variable doses of cisplatin for different hours. The treated cells were examined under light microscope and transmission electron microscope (TEM). Cell cycle analysis was performed on flow cytometry (FCM).
RESULTS After treatment with CDDP, the cells became smaller and condensed. Their chromatin clinged to the periphery of the nuclear. Apoptotic bodies were observed. There were apoptotic peaks in cell cycle analysis on FCM. The percentages of apoptotic cell were 9.3% and 14.9% after being treated with CDDP at 25mg/L for 24h and 50mg/L for 16h.
, 百拇医药
CONCLUSION CDDP may induce apoptosis in the gastric carcinoma cell line SGC-7901 which led to the death of the cancer cell.
Subject headings stomach neoplasms; apoptosis; cisplatin; tumor cell, cultured; flow cytometry
Xin ZP, Xu CF, Huang YX, Wen QS, Xu CZ, Zhao YF. Experimental study on induction of apoptosis by cisplatin in human gastric carcinoma cell line SGC-7901.Huaren Xiaohua Zazhi, 1998;6(10):844-846
, 百拇医药
摘要
目的 探讨顺铂对胃癌(SGC-7901)细胞凋亡的诱导作用，以揭示顺铂治疗胃癌的作用机制.
方法 选用不同剂量顺铂与人胃癌细胞系SGC-7901共同孵育不同时间后，应用光镜、电镜进行细胞形态学观察；细胞DNA经特异性荧光染色后，用流式细胞仪分析细胞周期变化.
结果 细胞经顺铂处理后浓缩、深染、致密的染色质沿核膜下凝集、有凋亡小体形成. 细胞周期分析G1期峰前出现典型的细胞凋亡峰，以25mg/L顺铂作用24h，50mg/L作用16h为例，定量分析凋亡细胞发生率分别为9.3%和14.9%.
结论 顺铂可通过诱导人胃癌细胞系SGC-7901发生细胞凋亡达到消灭肿瘤细胞的目的.
, http://www.100md.com
主题词 胃肿瘤；细胞凋亡；顺铂；肿瘤细胞，培养的；流式细胞术
辛召平, 许才绂, 黄裕新, 闻勤生, 许朝珍,赵永锋.顺铂诱导人胃癌SGC-7901细胞凋亡的体外实验.华人消化杂志,1998;6(10):844-846
0 引言
细胞凋亡(apoptosis)是一种生理性细胞程序化死亡(programmed cell death, PCD)，它不仅对保持机体自身稳定具有重要意义，还与肿瘤的发生、发展密切相关. 肿瘤细胞凋亡的研究对进一步探讨肿瘤发病机制及肿瘤的预防和治疗具有十分重要的意义. 我们应用光镜、电镜及流式细胞术，分析了顺铂对人胃癌细胞系SGC-7901细胞凋亡的诱导作用，从另一侧面为探讨胃癌治疗机制提供实验资料.
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 材料 人胃癌细胞系SGC-7901为中分化腺癌(由第四军医大学口腔医院生物系提供). 将细胞接种于含100mL/L热灭活小牛血清的RPMI 1640(美国GIBCO公司)培养液中，置于37℃含50mL/L CO2的饱和湿度孵箱内连续培养，2d～3d换液一次，2.5g/L胰蛋白酶常规消化传代，取对数生长期细胞实验.
1.2 方法 ①顺铂处理细胞：将预溶于生理盐水中的顺铂(济南齐鲁制药厂)加入培养细胞的新鲜培养液中，使终浓度达到不同实验要求. 与细胞共同孵育不同时间后送检. 设常规培养细胞为对照. ②光镜观察：取药物处理后的单层附壁细胞，弃去培养液，常规HE染色后观察形态学变化. ③电镜观察：细胞经磷酸缓冲液(PBS)洗涤后离心成团，4℃ 30mL/L戊二醛固定，10g/L四氧化锇后固定，梯度乙醇脱水，树脂包埋，制备成超薄切片，电子染色，JEM-2000EX(日本JEOL)电镜下观察超微结构. ④流式细胞仪分析：离心收集细胞，PBS洗涤后制成单细胞悬液(1×109/L)，加-20℃ 700mL/L乙醇固定，碘化丙锭(PI) 300μL染色30min，350目筛网过滤，EPICS-profile Ⅱ流式细胞仪(美国coulter)进行DNA含量及细胞周期分析，Multicycle(美国phoenix)计算机软件处理结果.
, http://www.100md.com
2 结果
2.1 光镜结果 细胞经顺铂作用后，体积缩小，核固缩深染，最终裂解成碎片而形成膜被小体，即凋亡小体(apoptosis body,图1). 对照组细胞生长良好无此现象(图2).
2.2 电镜结果 细胞凋亡早期核仁消失，致密的染色质沿核膜下凝集(图3). 固缩核裂解成胞膜包绕的碎块，电子密度较大，细胞器密集压缩，即凋亡小体(图4). 对照组细胞呈现恶性肿瘤细胞特征，无凋亡小体形成(图5).
2.3 流式细胞仪分析 细胞周期直方图上，G1峰前出现的亚二倍体峰，即凋亡细胞所形成的凋亡峰(AP峰)[1]，是凋亡细胞核固缩、DNA裂解的特征结果，可通过凋亡峰的面积测出凋亡细胞在整个细胞群中所占比例. 流式细胞仪分析显示25mg/L顺铂作用细胞24h后，G1峰前出现了凋亡峰，凋亡细胞占9.3%(图6)，50mg/L顺铂作用16h后，凋亡细胞占14.9%(图7). 而对照组细胞G1峰前无凋亡峰存在(图8).
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图1 SGC-7901细胞凋亡光镜观察↑示凋亡小体. HE×400
图2 SGC-7901细胞光镜形态. HE×400
图3 SGC-7901细胞凋亡早期形态特征. TEM×6000
图4 ↑示凋亡小体形成. TEM×4000
图5 SGC-7901细胞电镜形态. TEM×4000
, http://www.100md.com 图6 25mg/L CDDP作用24h后细胞周期直方图，凋亡细胞占9.3%.
图7 50mg/L CDDP作用16h后细胞周期直方图，凋亡细胞占14.9%.
图8 常规培养SGC-7901细胞的细胞周期分析.
3 讨论
1972年Kerr et al[2]首次提出细胞凋亡的概念，迄今细胞凋亡的发生机制仍不十分清楚. 目前认为细胞凋亡发生后有以下形态学特征[3]：在早期表现为内质网和细胞膜上出现一些小泡，细胞体积缩小，胞膜皱缩，但其细胞内膜结构尚完整，没有细胞内溶物的释放，与细胞坏死过程中出现的自溶现象截然不同. 中期细胞核发生固缩，染色质浓缩边集，形成由膜状物包裹内溶物的小体，称之为凋亡小体. 后期凋亡小体被邻近的正常细胞或吞噬细胞识别、吞噬而消失. 我们选用顺铂处理SGC-7901细胞后，细胞发生明显的形态学改变，与Kerr描述的特征相一致. 药物处理后的原附壁生长的培养细胞发生凋亡时，相邻细胞间失去彼此连接，收缩变圆，轮廓更加清晰可见，细胞附壁能力减弱，易从培养瓶壁上脱落下来，这些特征应作为判断培养细胞的细胞凋亡的形态学标准之一.
, 百拇医药
研究表明，流式细胞测量法可使凋亡的研究由定性发展为定量分析，同时既可检测出凋亡细胞的比例，又可将凋亡与坏死同时存在的细胞群加以区分，尤其为抗癌药物诱导凋亡的研究提供了较为理想的分析方法. 实验结果显示，25mg/L顺铂作用24h及50mg/L顺铂作用16h，G1峰前均出现了明显的凋亡峰(AP峰).
目前研究抗癌药物对肿瘤细胞的凋亡作用，在国内外已成为热点. 顺铂是多种联合化疗方案的核心药物，在胃癌治疗中效果肯定. 研究表明顺铂对多种肿瘤细胞有诱导凋亡作用，马向东et al[4]应用顺铂作用卵巢癌细胞，使卵巢癌细胞发生了广泛的凋亡. 陈卫星et al[5]应用热疗和顺铂合用诱导人胃癌细胞株MKN28细胞，采用电镜观察发现细胞出现了凋亡特征. 本实验单独采用顺铂同样使人胃癌细胞系SGC-7901细胞出现了凋亡现象，国内尚未见报道. 通过本实验研究从另一侧面揭示了顺铂治疗胃癌的作用机制，也为胃癌的化疗提供了实验资料.
, 百拇医药
4 参考文献
1 Telford WC, King LE, Fraker PJ. Rapid quantitation of apoptosis in pure heterogeneous cell populations using flow cylometry. J
Immunol Method, 1994;172(1):1-6
2 Kerr JFR, Harmon BV. Apoptosis: its significance in cancer and cancer therapy. Cancer, 1994;73(8):2013-2026
3 Martin ST, Gree DR, Cotter TG. Dieing with death: dissecting the components of the apoptosis machinery. TIBS,
1994;19(1):26-32
4 马向东，陈必良，叶永清，郑维国，辛晓燕，王德堂. 顺铂诱导人卵巢癌细胞系HO-8910细胞凋亡. 癌症，1997；16(3)：180-182
5 陈卫星，黄怀德，季峰. 热疗和顺铂合用诱导人胃癌细胞株MKN28凋谢的研究. 实用肿瘤杂志，1995；10(4)：221-222, 百拇医药(辛召平1,2 许才绂1 黄裕新1 闻勤生1 许朝珍2 赵永锋1)