核酶对人HCC细胞内HBeAg的抑制作用
第四军医大学唐都医院传染科 陕西省西安市 710038
李谨革，男，1967-12-04生，内蒙古呼和浩特市人，汉族. 1992年第四军医大学本科毕业，1998年第四军医大学传染科硕士研究生毕业，1998年第四军医大学传染科博士研究生，助教，医师，主要从事传染病专业研究工作，发表论文1篇，综述4篇.
*国家自然科学基金资助项目，No.39570652.
项目负责人 李谨革，710038，第四军医大学唐都医院传染科，陕西省西安市新寺路.
*Supported by the National Natural Science Foundation of China, No.39570652.
, 百拇医药 Correspondence to Jin-Ge Li, Department of Infectious Diseases, Tangdu Hospital, The Fourth Military Medical University, Xi'an 710038, Shaanxi Province, China
Tel. +86·29·3524578 Ext. 77595
收稿日期 1998-08-05
Inhibitory effect of ribozyme on HBeAg in human HCC cells*
Jin-Ge Li, Yong-Xing Zhou, Jian-Qi Lian, Zhan-Sheng Jia and Zhi-HuaFeng
, 百拇医药
Department of Infectious Diseases, Tangdu Hospital, The Fourth Military Medical University, Xi'an 710038, Shaanxi Province, China
Abstract
AIM To observe the inhibition of HBeAg expression in the human hepatic carcinoma cell (HCC) transfected by HBV genome with two-unit ribozyme against HBV.
METHODS By using subclone technique, the two-unit ribozyme gene cut from pGEM-Rz 123 was ligated into the eukaryotic expression vector pBBS212. The recombinant plasmid pBBS212-Rz and p1.2Ⅱ plasmid carrying genome of adr-subtype HBV were cotransfected into the human HCC cell using lipofectamine. The endocellular e antigen of HBV was detected by ELISA.
, http://www.100md.com
RESULTS The cotransfection cell did express HBV e antigen, and two-unit ribozyme lowered the level of HBeAg expressed in coinfected cells by up to 65%.
CONCLUSION The two-unit ribozyme can inhibit HBV expression in cotransfected cell.
Subject headings ribozyme; liver neoplasms; hepatitis B virus; hepatitis B surface antigens
Li JG, Zhou YX, Lian JQ, Jia ZS, Feng ZH. Inhibitory effect of ribozyme on HBeAg in human HCC cells.
, 百拇医药
Shijie Huaren Xiaohua Zazhi, 1999;7(1):28-30
摘要
目的 观察针对HBVC区双位点核酶对HBeAg在细胞内表达的抑制作用.
方法 利用亚克隆技术,从质粒pGEM-Rz123切下EcoRⅠ-BamHⅠ片段,双粘端克隆于真核表达质粒pBBS212中,将该质粒与p1.2Ⅱ(含HBV全序列),共转染人HCC细胞(人肝癌细胞株),观察该核酶在细胞内对HBeAg合成的抑制作用.
结果 在人HCC细胞中p1.2Ⅱ可表达出HBeAg;该核酶对HBeAg的合成抑制率达65%.
, http://www.100md.com
结论 该双位点核酶可能通过针对HBVC区基因的剪切作用,阻断C区基因的表达,抑制了HBeAg的合成.
主题词 核酶;肝肿瘤;乙型肝炎病毒;肝炎表面抗原,乙型
李谨革, 周永兴, 连建奇, 贾战生, 冯志华.核酶对人HCC细胞内HBeAg的抑制作用.世界华人消化杂志,1999;7(1):28-30
0 引言
核酶(ribozyme, Rz)是一种具有独特作用的RNA分子，可序列特异性地与靶RNA配对，切割而使其失去生物功能[1]. 人们利用这一特点，通过合理的设计及操作，可以特异地剪切靶RNA，成为基因治疗的重要手段. 传统的药物抗乙型肝炎病毒(HBV)疗效欠佳，而基因治疗提供了一条新的途径. 本实验构建抗HBV的双位点核酶真核表达载体，观察细胞内核酶对HBV表达HBeAg的抑制作用.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 脂质体(lipofectamine)、DMEM为Gibco公司产品，潮霉素B(hygromycin B)为Sigma公司产品，T4 DNA连接酶为Promaga公司产品，各种工具酶购自华美公司. HBsAg，HBeAg酶联检测盒为科华公司产品，进口胎牛血清购自Gibco公司. 人HCC细胞由本室保存，Ecoli JM 109为本室保存，pBBS212由全军消化研究所郭建成博士惠赠，pGEMRz 123(含针对HBV C区双位点核酶)质粒由本室连建奇博士构建. 核苷酸序列见图1[2].
1.2 方法
1.2.1 含针对HBV C区核酶的真核表达质粒的构建 pGEM Rz 123及pBBS 212均用EcoRⅠ及BamHⅠ进行双酶切，分别回收88bp及10535bp片段，用双粘法进行连接[3]，构建流程图见图2. 连接产物转化JM 109菌. 挑取克隆，用EcoRⅠ及BamHⅠ，KpnⅠ及HindⅢ对筛选重组体进行酶切鉴定，用聚丙烯酰胺凝胶电泳.
, 百拇医药
1.2.2 含核酶真核表达载体pBBS212-Rz的转染 人HCC细胞在6孔培养板中，用含100mL/L胎牛血清的1×DMEM，在37℃ 50mL/L CO2条件下培养至细胞密度为60%～80%. 采用脂质体介导基因转染的方法(按产品说明书操作). 准备溶液A：于100μL无血清DMEM液中6μg pBBS212-Rz或pBBS212. 准备溶液B：于85μL无血清DMEM液中加15μL脂质体，轻轻混匀A，B液，室温放置35min，补足1mL无血清DMEM，加入用DMEM洗过两次的细胞单层上，37℃，50mL/L CO2培养18h. 换用含100mL/L胎牛血清的培养基，37℃，50mL/L CO2培养48h，按1∶4传代，加含200mg/L潮霉素B的培养基进行筛选，直到筛选出阳性克隆. 混合所有阳性克隆，再扩增培养.
1.2.3 胞质裂解液的制备 细胞用冰浴的PBS缓冲液洗3次，加1mL含10mmol/L EDTA的PBS缓冲液消化细胞，加1mL～10mL PBS悬浮细胞计数，离心去除上清，悬浮细胞于0.25mmol/L Tris-HCl (pH 7.5)·1010个/L上清即为胞质裂解液，用于测定HBeAg.
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1.2.4 HBeAg测定 用科华ELISA检测试剂盒检测细胞培养上清，A(OD值)在A450下读取，结果均以阳性孔A/阴性孔A(P/N)表示，抑制率按下式计算：
实验孔P/n值-对照孔P/N值
抑制率= ×100%
对照孔P/N值-2.1
1.2.5 免疫荧光检测 细胞爬片固定后，测加1∶10稀释人的HBe/HBcAg抗体，37℃，30min，洗涤5次，加羊抗人IgG荧光抗体，37℃， 30min，洗片，吹干，加甘油，在荧光显微镜下观察拍片.
, 百拇医药
2 结果
2.1 含针对HBV C区核酶真核表达载体的构建 经酶切、连接、转化后筛选出阳性克隆pBBS212-Rz，用EcoRⅠ,BamHⅠ及KpnⅠ,HindⅢ两组酶切鉴定，可分别切出88bp及214bp片段. 用聚丙烯酰胺凝胶电泳可见一清晰条带(图3).
2.2 共转染人HCC细胞的鉴定 在将p1.2Ⅱ与pBBS212-Rz及pBBS212共转染人HCC细胞后7d胞质中测到HBeAg，经潮霉素B筛选后表达量达最大，1∶4阳性，同时发现HBeAg在转染的人HCC细胞中可稳定表达2mo以上.
2.3 在共转染细胞中，核酶对HBeAg作用 将样本分4组(含空载质粒与p1.2Ⅱ共转染组)，每组取4份样本. 由表1可以看出针对HBV C区双位点核酶对细胞内HBeAg的表达有明显的抑制作用. 最高达65%.
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表1 针对HBV C区双位点核酶对HBeAg表达的作用
图1 Rz及靶mRNA的核苷酸序列
, 百拇医药
图2 pBBS212-Rz真核表达载体构建流程图
图3 pBBS212-Rz重组质粒限制性内切酶酶切分析1.pBBS212-Rz/kpnⅠ+HindⅢ 2.Marker: pGEM-7Zf(+)/HeaⅢ Marks:(657,458,434,328,389,367,174,142,102,80) 3.pBBS212-Rz/EcoRⅠ+BamHⅠ
2.4 免疫荧光的检测结果 针对HBV C区核酶与p1.2Ⅱ共转染之人HCC细胞表达HBeAg的量为+，而空载体(pBBS212)与p1.2Ⅱ共转染之人HCC细胞表达HBeAg的量为++，说明针对HBV C区mRNA的双位点核酶可明确抑制HBeAg的表达(图4，5).
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图4 pBBS212-Rz与p1.2Ⅱ共转染人HCC细胞(普通荧光)
图5 pBBS212与p1.2Ⅱ共转染人HCC细胞(普通荧光)
3 讨论
目前，核酶的研究是分子生物学领域的热点之一. 核酶的发现不仅对生物的起源与进化具有极大的意义，同时为基因的表达与调控的研究及抗病毒、抗肿瘤的基因治疗提供了新的思路和手段[4]. 本实验室已构建抗HBV C区双位点核酶，体外对HBV C区转录物进行切割，效率达80%. 本实验正是利用该核酶构建一个真核表达载体pBBS212-Rz，由于pBBS212质粒含两个高效增强子及CMV启动子，不但可以高效表达该核酶，而且具有稳定表达的特点[5]. 采用共转染的方法，将该核酶与乙肝病毒全序列转入人HCC细胞，结果发现其对HBeAg的抑制率可达65%，免疫荧光也证实该结果. 说明核酶作为一种抗HBV的新方法是有效的.
, 百拇医药
对于抗HBV核酶的细胞内研究，1992年Weizsacker et al[8]使用联结型(connected type)三位点核酶，体外切割效果显著，文中提及正在进行体内研究. 1997年Welch et al[9]则使用三个发夹状核酶，导入Huh 7细胞，与HBV共表达. 结果使病毒颗粒下降66%～83%. 这一结果与本结果类似，国内也有类似报道[6，7]. 由于针对HBV C区mRNA的剪切作用，可使HBV复制过程中逆转录步骤中-3.5kbm RNA发生缺陷，直接可影响HBV的复制. 本实验结果提示该双位点核酶用于抑制HBV的复制、表达有效，可为进一步的抗HBV基因治疗提供基础.
4 参考文献
1 Haseloff J, Getlach WL. Simple RNA enzymes with new and highly specific endoribonuclease activites. Nature, 1988;344:585-591
, http://www.100md.com
2 连建奇，周永兴，金由辛. 抗HBV C基因核酶自剪切转录载体的构建. 第四军医大学学报，1997；8：376-377
3 姜泊，张亚历，周殿元，主编. 分子生物学常用实验方法. 第1版.北京：人民军医出版社.1996：19-23
4 李谨革，连建奇. 抗HBV核酶的研究进展. 现代诊断与治疗，1998；9：87-88
5 Lin JH, Wang M, Androws WH, Wydro R, Morser J. Expression efficiency of the human thrombomdulin encodimg gene in
various vector and host systems. Gene, 1994;147:287-292
, 百拇医药
6 竺来发，易荣大，陆长德，汪垣，祁国荣. 乙型肝炎病毒adr，亚型核心抗原RNA片段的体外ribozyme定点切割.
生物化学与生物物理学报，1993；25：323-327
7 王平，徐炜，曾力宇，孙晓梅，童葵塘，侯云德. 核酶Ripc对HBV基因体外转
录物的作用. 病毒学报，1993；9：278-280
8 Weizsacker FV, Blum HE, Wands JR. Cleavage of hepatitis B virus RNA by
three ribozyme transcribed from a single DNA templete. Biochem Biophys Res
Commun, 1992;189:743-748
9 Welch PJ, Tritz R, Yei S, Barber J, Yu M. Intracellular appliction of
hairpin ribozyme genes against hepatitis B virus. Gene Ther, 1997;4:736-740, http://www.100md.com(李谨革 周永兴 连建奇 贾战生 冯志华)
李谨革，男，1967-12-04生，内蒙古呼和浩特市人，汉族. 1992年第四军医大学本科毕业，1998年第四军医大学传染科硕士研究生毕业，1998年第四军医大学传染科博士研究生，助教，医师，主要从事传染病专业研究工作，发表论文1篇，综述4篇.
*国家自然科学基金资助项目，No.39570652.
项目负责人 李谨革，710038，第四军医大学唐都医院传染科，陕西省西安市新寺路.
*Supported by the National Natural Science Foundation of China, No.39570652.
, 百拇医药 Correspondence to Jin-Ge Li, Department of Infectious Diseases, Tangdu Hospital, The Fourth Military Medical University, Xi'an 710038, Shaanxi Province, China
Tel. +86·29·3524578 Ext. 77595
收稿日期 1998-08-05
Inhibitory effect of ribozyme on HBeAg in human HCC cells*
Jin-Ge Li, Yong-Xing Zhou, Jian-Qi Lian, Zhan-Sheng Jia and Zhi-HuaFeng
, 百拇医药
Department of Infectious Diseases, Tangdu Hospital, The Fourth Military Medical University, Xi'an 710038, Shaanxi Province, China
Abstract
AIM To observe the inhibition of HBeAg expression in the human hepatic carcinoma cell (HCC) transfected by HBV genome with two-unit ribozyme against HBV.
METHODS By using subclone technique, the two-unit ribozyme gene cut from pGEM-Rz 123 was ligated into the eukaryotic expression vector pBBS212. The recombinant plasmid pBBS212-Rz and p1.2Ⅱ plasmid carrying genome of adr-subtype HBV were cotransfected into the human HCC cell using lipofectamine. The endocellular e antigen of HBV was detected by ELISA.
, http://www.100md.com
RESULTS The cotransfection cell did express HBV e antigen, and two-unit ribozyme lowered the level of HBeAg expressed in coinfected cells by up to 65%.
CONCLUSION The two-unit ribozyme can inhibit HBV expression in cotransfected cell.
Subject headings ribozyme; liver neoplasms; hepatitis B virus; hepatitis B surface antigens
Li JG, Zhou YX, Lian JQ, Jia ZS, Feng ZH. Inhibitory effect of ribozyme on HBeAg in human HCC cells.
, 百拇医药
Shijie Huaren Xiaohua Zazhi, 1999;7(1):28-30
摘要
目的 观察针对HBVC区双位点核酶对HBeAg在细胞内表达的抑制作用.
方法 利用亚克隆技术,从质粒pGEM-Rz123切下EcoRⅠ-BamHⅠ片段,双粘端克隆于真核表达质粒pBBS212中,将该质粒与p1.2Ⅱ(含HBV全序列),共转染人HCC细胞(人肝癌细胞株),观察该核酶在细胞内对HBeAg合成的抑制作用.
结果 在人HCC细胞中p1.2Ⅱ可表达出HBeAg;该核酶对HBeAg的合成抑制率达65%.
, http://www.100md.com
结论 该双位点核酶可能通过针对HBVC区基因的剪切作用,阻断C区基因的表达,抑制了HBeAg的合成.
主题词 核酶;肝肿瘤;乙型肝炎病毒;肝炎表面抗原,乙型
李谨革, 周永兴, 连建奇, 贾战生, 冯志华.核酶对人HCC细胞内HBeAg的抑制作用.世界华人消化杂志,1999;7(1):28-30
0 引言
核酶(ribozyme, Rz)是一种具有独特作用的RNA分子，可序列特异性地与靶RNA配对，切割而使其失去生物功能[1]. 人们利用这一特点，通过合理的设计及操作，可以特异地剪切靶RNA，成为基因治疗的重要手段. 传统的药物抗乙型肝炎病毒(HBV)疗效欠佳，而基因治疗提供了一条新的途径. 本实验构建抗HBV的双位点核酶真核表达载体，观察细胞内核酶对HBV表达HBeAg的抑制作用.
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1 材料和方法
1.1 材料 脂质体(lipofectamine)、DMEM为Gibco公司产品，潮霉素B(hygromycin B)为Sigma公司产品，T4 DNA连接酶为Promaga公司产品，各种工具酶购自华美公司. HBsAg，HBeAg酶联检测盒为科华公司产品，进口胎牛血清购自Gibco公司. 人HCC细胞由本室保存，Ecoli JM 109为本室保存，pBBS212由全军消化研究所郭建成博士惠赠，pGEMRz 123(含针对HBV C区双位点核酶)质粒由本室连建奇博士构建. 核苷酸序列见图1[2].
1.2 方法
1.2.1 含针对HBV C区核酶的真核表达质粒的构建 pGEM Rz 123及pBBS 212均用EcoRⅠ及BamHⅠ进行双酶切，分别回收88bp及10535bp片段，用双粘法进行连接[3]，构建流程图见图2. 连接产物转化JM 109菌. 挑取克隆，用EcoRⅠ及BamHⅠ，KpnⅠ及HindⅢ对筛选重组体进行酶切鉴定，用聚丙烯酰胺凝胶电泳.
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1.2.2 含核酶真核表达载体pBBS212-Rz的转染 人HCC细胞在6孔培养板中，用含100mL/L胎牛血清的1×DMEM，在37℃ 50mL/L CO2条件下培养至细胞密度为60%～80%. 采用脂质体介导基因转染的方法(按产品说明书操作). 准备溶液A：于100μL无血清DMEM液中6μg pBBS212-Rz或pBBS212. 准备溶液B：于85μL无血清DMEM液中加15μL脂质体，轻轻混匀A，B液，室温放置35min，补足1mL无血清DMEM，加入用DMEM洗过两次的细胞单层上，37℃，50mL/L CO2培养18h. 换用含100mL/L胎牛血清的培养基，37℃，50mL/L CO2培养48h，按1∶4传代，加含200mg/L潮霉素B的培养基进行筛选，直到筛选出阳性克隆. 混合所有阳性克隆，再扩增培养.
1.2.3 胞质裂解液的制备 细胞用冰浴的PBS缓冲液洗3次，加1mL含10mmol/L EDTA的PBS缓冲液消化细胞，加1mL～10mL PBS悬浮细胞计数，离心去除上清，悬浮细胞于0.25mmol/L Tris-HCl (pH 7.5)·1010个/L上清即为胞质裂解液，用于测定HBeAg.
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1.2.4 HBeAg测定 用科华ELISA检测试剂盒检测细胞培养上清，A(OD值)在A450下读取，结果均以阳性孔A/阴性孔A(P/N)表示，抑制率按下式计算：
实验孔P/n值-对照孔P/N值
抑制率= ×100%
对照孔P/N值-2.1
1.2.5 免疫荧光检测 细胞爬片固定后，测加1∶10稀释人的HBe/HBcAg抗体，37℃，30min，洗涤5次，加羊抗人IgG荧光抗体，37℃， 30min，洗片，吹干，加甘油，在荧光显微镜下观察拍片.
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2 结果
2.1 含针对HBV C区核酶真核表达载体的构建 经酶切、连接、转化后筛选出阳性克隆pBBS212-Rz，用EcoRⅠ,BamHⅠ及KpnⅠ,HindⅢ两组酶切鉴定，可分别切出88bp及214bp片段. 用聚丙烯酰胺凝胶电泳可见一清晰条带(图3).
2.2 共转染人HCC细胞的鉴定 在将p1.2Ⅱ与pBBS212-Rz及pBBS212共转染人HCC细胞后7d胞质中测到HBeAg，经潮霉素B筛选后表达量达最大，1∶4阳性，同时发现HBeAg在转染的人HCC细胞中可稳定表达2mo以上.
2.3 在共转染细胞中，核酶对HBeAg作用 将样本分4组(含空载质粒与p1.2Ⅱ共转染组)，每组取4份样本. 由表1可以看出针对HBV C区双位点核酶对细胞内HBeAg的表达有明显的抑制作用. 最高达65%.
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表1 针对HBV C区双位点核酶对HBeAg表达的作用
| 样 本 编 号 | P/N值x±s | 抑制率 |
| pBBS212与p1.2Ⅱ共转染组 | 3.95±0.06 | |
| pBBS212-Rz与p1.2Ⅱ共转染组Ⅰ | 2.84±0.11 | 60% |
| pBBS212-Rz与p1.2Ⅱ共转染组Ⅱ | 3.12±0.10 | 50% |
| pBBS212-Rz与p1.2Ⅱ共转染组Ⅲ | 2.75±0.25 | 65% |
图1 Rz及靶mRNA的核苷酸序列
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图2 pBBS212-Rz真核表达载体构建流程图
图3 pBBS212-Rz重组质粒限制性内切酶酶切分析1.pBBS212-Rz/kpnⅠ+HindⅢ 2.Marker: pGEM-7Zf(+)/HeaⅢ Marks:(657,458,434,328,389,367,174,142,102,80) 3.pBBS212-Rz/EcoRⅠ+BamHⅠ
2.4 免疫荧光的检测结果 针对HBV C区核酶与p1.2Ⅱ共转染之人HCC细胞表达HBeAg的量为+，而空载体(pBBS212)与p1.2Ⅱ共转染之人HCC细胞表达HBeAg的量为++，说明针对HBV C区mRNA的双位点核酶可明确抑制HBeAg的表达(图4，5).
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图4 pBBS212-Rz与p1.2Ⅱ共转染人HCC细胞(普通荧光)
图5 pBBS212与p1.2Ⅱ共转染人HCC细胞(普通荧光)
3 讨论
目前，核酶的研究是分子生物学领域的热点之一. 核酶的发现不仅对生物的起源与进化具有极大的意义，同时为基因的表达与调控的研究及抗病毒、抗肿瘤的基因治疗提供了新的思路和手段[4]. 本实验室已构建抗HBV C区双位点核酶，体外对HBV C区转录物进行切割，效率达80%. 本实验正是利用该核酶构建一个真核表达载体pBBS212-Rz，由于pBBS212质粒含两个高效增强子及CMV启动子，不但可以高效表达该核酶，而且具有稳定表达的特点[5]. 采用共转染的方法，将该核酶与乙肝病毒全序列转入人HCC细胞，结果发现其对HBeAg的抑制率可达65%，免疫荧光也证实该结果. 说明核酶作为一种抗HBV的新方法是有效的.
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对于抗HBV核酶的细胞内研究，1992年Weizsacker et al[8]使用联结型(connected type)三位点核酶，体外切割效果显著，文中提及正在进行体内研究. 1997年Welch et al[9]则使用三个发夹状核酶，导入Huh 7细胞，与HBV共表达. 结果使病毒颗粒下降66%～83%. 这一结果与本结果类似，国内也有类似报道[6，7]. 由于针对HBV C区mRNA的剪切作用，可使HBV复制过程中逆转录步骤中-3.5kbm RNA发生缺陷，直接可影响HBV的复制. 本实验结果提示该双位点核酶用于抑制HBV的复制、表达有效，可为进一步的抗HBV基因治疗提供基础.
4 参考文献
1 Haseloff J, Getlach WL. Simple RNA enzymes with new and highly specific endoribonuclease activites. Nature, 1988;344:585-591
, http://www.100md.com
2 连建奇，周永兴，金由辛. 抗HBV C基因核酶自剪切转录载体的构建. 第四军医大学学报，1997；8：376-377
3 姜泊，张亚历，周殿元，主编. 分子生物学常用实验方法. 第1版.北京：人民军医出版社.1996：19-23
4 李谨革，连建奇. 抗HBV核酶的研究进展. 现代诊断与治疗，1998；9：87-88
5 Lin JH, Wang M, Androws WH, Wydro R, Morser J. Expression efficiency of the human thrombomdulin encodimg gene in
various vector and host systems. Gene, 1994;147:287-292
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6 竺来发，易荣大，陆长德，汪垣，祁国荣. 乙型肝炎病毒adr，亚型核心抗原RNA片段的体外ribozyme定点切割.
生物化学与生物物理学报，1993；25：323-327
7 王平，徐炜，曾力宇，孙晓梅，童葵塘，侯云德. 核酶Ripc对HBV基因体外转
录物的作用. 病毒学报，1993；9：278-280
8 Weizsacker FV, Blum HE, Wands JR. Cleavage of hepatitis B virus RNA by
three ribozyme transcribed from a single DNA templete. Biochem Biophys Res
Commun, 1992;189:743-748
9 Welch PJ, Tritz R, Yei S, Barber J, Yu M. Intracellular appliction of
hairpin ribozyme genes against hepatitis B virus. Gene Ther, 1997;4:736-740, http://www.100md.com(李谨革 周永兴 连建奇 贾战生 冯志华)