异搏定增强阿霉素抗大肠癌作用的体外研究
南京医科大学第一附属医院普外科 江苏省南京市 210029
*江苏省自然科学基金资助项目, No.96040.
项目负责人 沈历宗南京医科大学第一附属医院普外科 江苏省南京市 210029
收稿日期 1998-11-09 接收日期 1998-12-18
Subject headings verapamil; doxorubicin; colorectal neoplasms/drug therapy
主题词 异搏定；阿霉素；结肠直肠肿瘤/药物疗法
, http://www.100md.com
肿瘤多药耐药性(multidrug resistance, MDR)是肿瘤治疗的一大障碍，MDR主要是由mdrl基因介导的，而且MDR是可以逆转的，许多研究发现异搏定(vera pamil, VER)可以逆转MDR[1]. 本研究采用MTT法观察VER对阿霉素(doxorubicin, DOX)抗体外培养的大肠癌细胞株RKO的作用的影响.
1 材料和方法
1.1 细胞及培养 人大肠癌细胞株RKO由美国国立癌症研究院建株(本院中心实验室汪承亚研究员提供)，培养于RPMI1640完全培养液中(含15% FBS).
1.2 RT-PCR检测RKO细胞mdrl mRNA的表达 总RNA的提取采用Trizol一步法[2].
, 百拇医药
1.3 细胞抗药性试验(MTT)法 取对数生长期细胞接种于96孔细胞培养板内，每孔2×104个细胞，37℃孵育约24h后加入相应浓度的药物
(以RPMI1640稀释)，设不含细胞的本底孔，实验组包括DOX组、VER组、DOX+VER(0.01g/L)组和DOX+VER(0.05g/L)组，置37℃、含5% CO2及饱和湿度的孵箱中孵育72h，每孔再加入用无FBS的RPMI1640配制的MTT溶液(1mg/mL)，每孔50μL，37℃再孵育6h，倾去上清，每孔加异丙醇100μL，待蓝色结晶完全溶解后在570nm处测定每个小孔的光密度值(OD值).
2 结果
2.1 RT-PCR检测 结果显示RKO细胞不表达mdrl基因(图1)，说明RKO细胞不具MDR表型，不是多药耐药细胞株.
, 百拇医药
2.2 VER的直接抑癌作用 当培养液中VER的浓度在0.05g/L或以下时对RKO细胞生长无明显影响，当VER浓度>0.05g/L时对细胞生长有明显抑制作用，当VER浓度为0.1g/L时，RKO细胞生长抑制率为56.7%(图2).
图1 RT-PCR检测结果.1. DNA ladder (100bp) 2. 阳性mdr1 cDNA参照 3. 阴性参照，A549细胞 4. RKO细胞扩增结果.
图2 不同浓度VER对RKO细胞生长增殖的影响.
2.3 非抑制剂量VER对DOX抗RKO细胞的增敏作用 (表1).
, 百拇医药
表1 非抑制剂量VER对DOX的增敏作用(OD值)
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本底OD值(完全RPMI1640加MTT，无细胞)为0.424±0.027，将各测试孔的OD值减去本底OD值，各重复孔的OD值取均数±标准差. 方差分析显示DOX组、DOX+VER(0.01g/L)组、DOX+VER(0.05g/L)组各组间OD值均有显著性差异，可见非抑制剂量VER对DOX抗RKO细胞有明显增敏作用，VER可使DOX的IC50 明显降低，明显增强了DOX的细胞毒作用.
3 讨论
异搏定(verapamil)是一种选择性钙离子通道阻滞剂，临床应用于治疗心血管疾病及其他系统疾病，取得良好疗效. 本研究发现VER浓度超过0.05g/L时，对大肠癌细胞株RKO的生长增殖有明显的抑制作用，但该浓度大大超出了机体的耐受范围，因此在临床上难以获得类似作用. MDR是指肿瘤细胞对多种结构及作用机制各不相同的化疗药物产生交叉耐药，现在认为MDR主要是由mdrl基因编码的P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)介导的，而且MDR是可以逆转的[1]. 许多研究证实VER等钙阻滞剂能有效地逆转MDR[3，4]，并将VER作为筛选MDR逆转剂的参考标准[5]. 本研究显示大肠癌细胞株RKO并不表达mdrl基因，非抑制剂量VER(0.01g/L)也能增强DOX对RKO细胞的细胞毒作用，在VER存在时，DOX抗RKO的IC50 明显降低，且在一定范围内随着VER浓度增加，DOX的IC50也相应降低，因此将VER作为筛选MDR逆转剂的参考标准可能不恰当. 当然有可能VER对MDR表型阳性细胞的逆转作用与对MDR阴性细胞的增敏作用在量上存在某种差异，有关问题有待进一步研究.
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4 参考文献
1 Goldstein L. Clinical reversal of drug resistance. Curr Probl Cancer, 1995;XIX:67
2 Domenica S. TRIzol: a new reagent for optimal singlestep isolation of RNA Focus, 1993;15:99
3 Huet S, Robbert J. The reversal of doxoruicin resistance by verap amil is not due to an effect on calcinum channels.
Int J Cancer, 1988;41:283-286
, 百拇医药
4 Tsuruo T, Iida H, Tsukagoshi S, Sakurai Y. Overcoming of VCR resistance in P338 leukemia in vivo and in vitro
through enhanced cytotoxicity of VCR and VDS by verapamil. Cancer Res, 1981;41:1967-1972
5 潘宏铭，胡汛，吴金民，郑树. 大肠癌抗多药耐药性细胞株SW1116/DOX的建立及茶多酚复合体的逆转作用研究.
肿瘤，1997；17：213-216, 百拇医药(沈历宗 吴文溪 范 萍 华一兵 武正炎)
*江苏省自然科学基金资助项目, No.96040.
项目负责人 沈历宗南京医科大学第一附属医院普外科 江苏省南京市 210029
收稿日期 1998-11-09 接收日期 1998-12-18
Subject headings verapamil; doxorubicin; colorectal neoplasms/drug therapy
主题词 异搏定；阿霉素；结肠直肠肿瘤/药物疗法
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肿瘤多药耐药性(multidrug resistance, MDR)是肿瘤治疗的一大障碍，MDR主要是由mdrl基因介导的，而且MDR是可以逆转的，许多研究发现异搏定(vera pamil, VER)可以逆转MDR[1]. 本研究采用MTT法观察VER对阿霉素(doxorubicin, DOX)抗体外培养的大肠癌细胞株RKO的作用的影响.
1 材料和方法
1.1 细胞及培养 人大肠癌细胞株RKO由美国国立癌症研究院建株(本院中心实验室汪承亚研究员提供)，培养于RPMI1640完全培养液中(含15% FBS).
1.2 RT-PCR检测RKO细胞mdrl mRNA的表达 总RNA的提取采用Trizol一步法[2].
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1.3 细胞抗药性试验(MTT)法 取对数生长期细胞接种于96孔细胞培养板内，每孔2×104个细胞，37℃孵育约24h后加入相应浓度的药物
(以RPMI1640稀释)，设不含细胞的本底孔，实验组包括DOX组、VER组、DOX+VER(0.01g/L)组和DOX+VER(0.05g/L)组，置37℃、含5% CO2及饱和湿度的孵箱中孵育72h，每孔再加入用无FBS的RPMI1640配制的MTT溶液(1mg/mL)，每孔50μL，37℃再孵育6h，倾去上清，每孔加异丙醇100μL，待蓝色结晶完全溶解后在570nm处测定每个小孔的光密度值(OD值).
2 结果
2.1 RT-PCR检测 结果显示RKO细胞不表达mdrl基因(图1)，说明RKO细胞不具MDR表型，不是多药耐药细胞株.
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2.2 VER的直接抑癌作用 当培养液中VER的浓度在0.05g/L或以下时对RKO细胞生长无明显影响，当VER浓度>0.05g/L时对细胞生长有明显抑制作用，当VER浓度为0.1g/L时，RKO细胞生长抑制率为56.7%(图2).
图1 RT-PCR检测结果.1. DNA ladder (100bp) 2. 阳性mdr1 cDNA参照 3. 阴性参照，A549细胞 4. RKO细胞扩增结果.
图2 不同浓度VER对RKO细胞生长增殖的影响.
2.3 非抑制剂量VER对DOX抗RKO细胞的增敏作用 (表1).
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表1 非抑制剂量VER对DOX的增敏作用(OD值)
| DOX浓度(g/L) | DOX组 | DOX+VER(0.01g/L)组 | DOX+VER(0.05g/L组) |
| 0 | 0.57±0.030 | ||
| 1×10-5 | 0.58±0.022 | 0.47±0.008 | 0.34±0.022 |
| 1×10-4 | 0.45±0.025 | 0.41±0.008 | 0.27±0.008 |
| 5×10-4 | 0.41±0.012 | 0.29±0.025 | 0.22±0.021 |
| 1×10-3 | 0.36±0.017 | 0.24±0.012 | 0.17±0.008 |
| 5×10-3 | 0.32±0.016 | 0.21±0.012 | 0.15±0.008 |
| 1×10-2 | 0.27±0.008 | 0.19±0.012 | 0.11±0.012 |
| 5×10-2 | 0.21±0.024 | 0.16±0.005 | 0.09±0.008 |
| 1×10-1 | 0.19±0.029 | 0.14±0.008 | 0.05±0.017 |
| IC50(g/L) | 8.73×10-3 | 1×10-3 | 4.6×10-5 |
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本底OD值(完全RPMI1640加MTT，无细胞)为0.424±0.027，将各测试孔的OD值减去本底OD值，各重复孔的OD值取均数±标准差. 方差分析显示DOX组、DOX+VER(0.01g/L)组、DOX+VER(0.05g/L)组各组间OD值均有显著性差异，可见非抑制剂量VER对DOX抗RKO细胞有明显增敏作用，VER可使DOX的IC50 明显降低，明显增强了DOX的细胞毒作用.
3 讨论
异搏定(verapamil)是一种选择性钙离子通道阻滞剂，临床应用于治疗心血管疾病及其他系统疾病，取得良好疗效. 本研究发现VER浓度超过0.05g/L时，对大肠癌细胞株RKO的生长增殖有明显的抑制作用，但该浓度大大超出了机体的耐受范围，因此在临床上难以获得类似作用. MDR是指肿瘤细胞对多种结构及作用机制各不相同的化疗药物产生交叉耐药，现在认为MDR主要是由mdrl基因编码的P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)介导的，而且MDR是可以逆转的[1]. 许多研究证实VER等钙阻滞剂能有效地逆转MDR[3，4]，并将VER作为筛选MDR逆转剂的参考标准[5]. 本研究显示大肠癌细胞株RKO并不表达mdrl基因，非抑制剂量VER(0.01g/L)也能增强DOX对RKO细胞的细胞毒作用，在VER存在时，DOX抗RKO的IC50 明显降低，且在一定范围内随着VER浓度增加，DOX的IC50也相应降低，因此将VER作为筛选MDR逆转剂的参考标准可能不恰当. 当然有可能VER对MDR表型阳性细胞的逆转作用与对MDR阴性细胞的增敏作用在量上存在某种差异，有关问题有待进一步研究.
, http://www.100md.com
4 参考文献
1 Goldstein L. Clinical reversal of drug resistance. Curr Probl Cancer, 1995;XIX:67
2 Domenica S. TRIzol: a new reagent for optimal singlestep isolation of RNA Focus, 1993;15:99
3 Huet S, Robbert J. The reversal of doxoruicin resistance by verap amil is not due to an effect on calcinum channels.
Int J Cancer, 1988;41:283-286
, 百拇医药
4 Tsuruo T, Iida H, Tsukagoshi S, Sakurai Y. Overcoming of VCR resistance in P338 leukemia in vivo and in vitro
through enhanced cytotoxicity of VCR and VDS by verapamil. Cancer Res, 1981;41:1967-1972
5 潘宏铭，胡汛，吴金民，郑树. 大肠癌抗多药耐药性细胞株SW1116/DOX的建立及茶多酚复合体的逆转作用研究.
肿瘤，1997；17：213-216, 百拇医药(沈历宗 吴文溪 范 萍 华一兵 武正炎)