大量分离乳猪肝细胞的方法
第三军医大学西南医院传染病专科中心 重庆市 400038
王英杰，男，1960-10-03生，陕西省延安市人，汉族. 1985年延安大学医学系本科毕业，1992年与1997年在第三军医大学获医学硕士和博士学位，传染病学副教授，副主任医师，硕士生导师，中华医学会重庆分会传染病与寄生虫病学专委会委员，重庆市生物医学工程学会生物材料与人工器官专委会副主任委员，《肝脏》杂志编委. 负责国家“九五”攻关项目“生物人工肝”课题研究，获军队科技进步二等奖2项(第一完成人)，发表论文70篇.
国家“九五”攻关项目，No.96-920-12-02
项目负责人 王英杰，400038，重庆市，第三军医大学西南医院传染病专科中心.
Supported by “9·5” National Major Project, No,96-920-12-02
, 百拇医药
Correspondence to Ying-Jie Wang, Center of Infectious Diseases, Southwest Hospital, Third Military Medical University,Chongqing 400038, China
Tel. +86·23·68754217, Fax. +86·23·68754475
收稿日期 1999-04-08 接收日期 1999-06-22
Large-scale isolation of suckling pig hepatocytes
Ying-Jie Wang, Guo-Dong Liu, Jun Liu and Meng-Dong Li
, 百拇医药
Clinical Center of Infectious Diseases, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China
Abstract
AIM To study the method for large scale isolation of suckling pig hepatocytes.
METHODS Liver cells of suckling pig were harvested by two-step perfusion with ethulenediaminetetraacetate and collagenase by using an extracorporeal perfusion apparatus. The cell yield, viability, purity, and proliferation were observed and detected respectively.
, 百拇医药
RESULTS The total yield of isolating hepatocytes reached to 109 in each pig liver with the viability of 94% to 98% and purity of more than 96%. Isolated hepatocytes demonstrated by transmission electron microscopy showing integrity of plasma membranes and intracellular organelles. Cultured hepatocytes isolated by the method proliferated significantly. Lactate dehydrogenase in the media showed a slight increase.
CONCLUSION This method allows isolation of large numbers of suckling pig hepatocytes with higher viability.
, 百拇医药
Subject headings hepatocytes; cell isolation; bioartificial liver
Wang YJ, Liu GD, Liu J, Li MD. Large scale isolation of suckling pig hepatocytes.Shijie Huaren Xiaohua Zazhi,1999;7(8):661-662
摘要
目的 探讨大量分离乳猪肝细胞的方法.
方法 用体外灌流装置,EDTA和胶原酶两步灌流法消化分离乳猪肝细胞,综合方法观察判断肝细胞产量、活力、纯度及增殖能力.
, 百拇医药
结果 分离肝细胞的总产量达到109/肝,细胞活力94%～98%,纯度大于96%.分离乳猪肝细胞胞膜完整、细胞器丰富,培养肝细胞有活跃的增殖能力,培养上清中乳酸脱氢酶浓度仅有轻度升高,24h平均浓度17.8U/L±5.4U/L.
结论 采用体外灌流装置两步分离法可获得大量高活性的乳猪肝细胞.
主题词 肝细胞;细胞分离;生物人工肝
王英杰, 刘国栋, 刘俊, 李梦东.大量分离乳猪肝细胞的方法.世界华人消化杂志,1999;7(8):661-662
0 引言
目前，生物人工肝已成为肝衰竭治疗研究领域的热门课题，愈来愈引起人们的重视. 由于这种新型人工肝系统是以肝细胞为生物材料，因此，随着该研究的不断深入和广泛开展，迫切需要理想的细胞来源与制备技术[1]. 我们选择乳猪为对象，进行了大规模分离肝细胞的初步研究，现将结果报道如下.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 10日～15日龄健康乳猪5只，体重1.2kg～2.0kg，购自本地专业养殖场. 实验前4h断奶，送实验室清洁后备用. 主要试剂collagenase Ⅳ，EDTA，trypsin inhibitor等为Sigma产品. RPMI 1640培养液为Gibco产品，培养板为Nunc公司产品.
1.2 方法 戊巴比妥钠(30mg/kg) ip麻醉动物，固定，常规方法消毒皮肤，开腹，暴露门静脉并注入肝素钠100U～150U. 游离肝脏，于肝门处剪下取出，置自制的体外灌流系统(另文介绍)进行整体肝两步循环灌流. 前灌流液为含EDTA、无*"Ca, Mg离子的Hanks液，共500mL，其中300mL灌流后丢弃(因含大量红细胞)，另200mL循环使用，速度80mL/min～100mL/min，时间10min～15min. 第二步灌流液为胶原酶液，浓度0.5g/L，灌速50mL/min～70mL/min,时间10min. 两种灌流液在系统内均保持37℃～38℃. 灌流结束后，用剪刀划破肝包膜，剔除大块纤维结缔组织，收集细胞悬液，酌情再置37℃条件下消化10min～15min. 用RPMI 1640培养液终止消化，三层纱布过滤，50g反复离心3次～4次获取肝细胞. 在倒置相差显微镜下，使用血细胞计数板计数肝细胞产量，4g/L台盼兰拒染试验判断细胞活率. 低速离心收集新分离的肝细胞，0.3mol/L戊二醛固定4h，0.039mol/L锇酸后固定，乙醇脱水，Epon618包埋，超薄切片，柠檬酸铅染色，JEM_2000 SX透射电镜观察. 按1×105[wang 1]/mL接种于12孔培养板，使用相差显微镜观察细胞纯度和增殖生长能力，生化分析仪检测培养上清乳酸脱氢酶(LDH)含量.
, 百拇医药
2 结果
用体外循环灌流装置对离体乳猪肝脏进行两步灌流，分离肝细胞的总产量为3.8×109～4.7×109/肝. 用台盼兰染色，肝细胞存活率94%～98%，接种24h，镜下连续计数每100个肝细胞中有非实质细胞2个～4个，肝细胞纯度达96%～98%. 肝细胞接种培养4h后，培养上清中LDH的平均值为13.2U/L±4.1U/L，24h后略有升高，平均浓度17.8U/L±5.4U/L，培养48h的LDH为23.7U/L±3.9U/L.
图1 新分离肝细胞呈“葡萄样”. ×100
图2 培养24h的乳猪肝细胞，镜下见大量双核细胞. ×200
, 百拇医药
新分离的乳猪肝细胞大多呈“葡萄样”相互粘附聚集，单个肝细胞较少见，聚集体内肝细胞数目可高达30个～40个以上(图1). 接种1h，肝细胞均已附壁，聚集体肝细胞先以堆积的形式附壁，随后逐渐铺开，向外伸展，最终呈典型的多边形单层贴壁生长. 培养16h～20h后，肝细胞开始活跃增殖，镜下见大量双核细胞，直至长满培养板，接触抑制为止(图2).
电镜观察显示，分离乳猪肝细胞呈簇状分布，肝细胞具有正常肝细胞的超微结构特征，表现为肝细胞膜及核膜完整，胞质均匀一致，各种细胞器清晰可辨. 其中，线粒体较丰富，可见糖原颗粒. 电镜下所见肝非实质细胞数目与光镜情况相似.
3 讨论
迄今国外已有不少临床与动物实验资料显示，在人肝细胞来源困难的情况下，猪肝细胞可做为良好的细胞材料，用于生物人工肝，发挥解毒和生物合成功能，为暴发性肝衰竭患者提供有效的过渡支持[2]. 国内曾有研究者从乳猪肝组织中提取出促肝再生物质，治疗重症肝炎获得较好的疗效. 我们在以往的研究中发现，分离培养的胎肝细胞具有良好的体外增殖生长能力，能分泌生物活性物质，同样可起到保护肝损伤，治疗肝衰竭的作用[3]. 因此推测，如果使用培养的乳猪肝细胞，可使体外生物人工肝系统发挥较好的人工肝支持与治疗作用.
, 百拇医药
已知制备大量高活性的肝细胞是生物人工肝系统的关键技术之一. 目前，肝细胞分离方法多采用Seglen的原位肝灌流法[4]，我们在多年的细胞培养工作中注意到，对于较大动物，尤其是难消化的动物肝(猪)，此法多有不便. 我们应用自制的体外肝灌流装置，对乳猪肝进行离体两步灌流，消化分离的猪肝细胞产量较多、活性好、纯度高，肝细胞具有正常肝细胞的超微结构特征，接种培养后增殖生长旺盛，从而为乳猪肝细胞用于生物人工肝提供了条件，有关研究正在深入进行之中.
4 参考文献
1 Dixit V. Development of a bioartificial liver using isolated hepatocytes. Artif Organs, 1994;18:371-384
2 Watanabe FD, Mullon CJ, Hewitt WR, Arkadopoulos N, Kahaku E, Eguchi S, Khalili T, Arnaout W, Shackleton CR, Rozga J,Solomon B, Demetriou AA. Clinical experience with a bioartificial liver in the treatment of severe liver failure. A phase I clinical trial.
, 百拇医药
Ann Surg, 1997;225:484-491
3 Wang YJ, Wang XH, Wang YU, Li MD, Ding J. Effects of supernatant from fetal hepatocyte culture on the mice survival
fulminant hepatic failure. Xin Xiaohua Bingxue Zazhi, 1997;5:77-78
4 Seglen PO. Preparation of isolated rat liver cells. Methods Cell Biol, 1976;13:29-83, http://www.100md.com(王英杰 刘国栋 刘俊 李梦东)
王英杰，男，1960-10-03生，陕西省延安市人，汉族. 1985年延安大学医学系本科毕业，1992年与1997年在第三军医大学获医学硕士和博士学位，传染病学副教授，副主任医师，硕士生导师，中华医学会重庆分会传染病与寄生虫病学专委会委员，重庆市生物医学工程学会生物材料与人工器官专委会副主任委员，《肝脏》杂志编委. 负责国家“九五”攻关项目“生物人工肝”课题研究，获军队科技进步二等奖2项(第一完成人)，发表论文70篇.
国家“九五”攻关项目，No.96-920-12-02
项目负责人 王英杰，400038，重庆市，第三军医大学西南医院传染病专科中心.
Supported by “9·5” National Major Project, No,96-920-12-02
, 百拇医药
Correspondence to Ying-Jie Wang, Center of Infectious Diseases, Southwest Hospital, Third Military Medical University,Chongqing 400038, China
Tel. +86·23·68754217, Fax. +86·23·68754475
收稿日期 1999-04-08 接收日期 1999-06-22
Large-scale isolation of suckling pig hepatocytes
Ying-Jie Wang, Guo-Dong Liu, Jun Liu and Meng-Dong Li
, 百拇医药
Clinical Center of Infectious Diseases, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China
Abstract
AIM To study the method for large scale isolation of suckling pig hepatocytes.
METHODS Liver cells of suckling pig were harvested by two-step perfusion with ethulenediaminetetraacetate and collagenase by using an extracorporeal perfusion apparatus. The cell yield, viability, purity, and proliferation were observed and detected respectively.
, 百拇医药
RESULTS The total yield of isolating hepatocytes reached to 109 in each pig liver with the viability of 94% to 98% and purity of more than 96%. Isolated hepatocytes demonstrated by transmission electron microscopy showing integrity of plasma membranes and intracellular organelles. Cultured hepatocytes isolated by the method proliferated significantly. Lactate dehydrogenase in the media showed a slight increase.
CONCLUSION This method allows isolation of large numbers of suckling pig hepatocytes with higher viability.
, 百拇医药
Subject headings hepatocytes; cell isolation; bioartificial liver
Wang YJ, Liu GD, Liu J, Li MD. Large scale isolation of suckling pig hepatocytes.Shijie Huaren Xiaohua Zazhi,1999;7(8):661-662
摘要
目的 探讨大量分离乳猪肝细胞的方法.
方法 用体外灌流装置,EDTA和胶原酶两步灌流法消化分离乳猪肝细胞,综合方法观察判断肝细胞产量、活力、纯度及增殖能力.
, 百拇医药
结果 分离肝细胞的总产量达到109/肝,细胞活力94%～98%,纯度大于96%.分离乳猪肝细胞胞膜完整、细胞器丰富,培养肝细胞有活跃的增殖能力,培养上清中乳酸脱氢酶浓度仅有轻度升高,24h平均浓度17.8U/L±5.4U/L.
结论 采用体外灌流装置两步分离法可获得大量高活性的乳猪肝细胞.
主题词 肝细胞;细胞分离;生物人工肝
王英杰, 刘国栋, 刘俊, 李梦东.大量分离乳猪肝细胞的方法.世界华人消化杂志,1999;7(8):661-662
0 引言
目前，生物人工肝已成为肝衰竭治疗研究领域的热门课题，愈来愈引起人们的重视. 由于这种新型人工肝系统是以肝细胞为生物材料，因此，随着该研究的不断深入和广泛开展，迫切需要理想的细胞来源与制备技术[1]. 我们选择乳猪为对象，进行了大规模分离肝细胞的初步研究，现将结果报道如下.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 10日～15日龄健康乳猪5只，体重1.2kg～2.0kg，购自本地专业养殖场. 实验前4h断奶，送实验室清洁后备用. 主要试剂collagenase Ⅳ，EDTA，trypsin inhibitor等为Sigma产品. RPMI 1640培养液为Gibco产品，培养板为Nunc公司产品.
1.2 方法 戊巴比妥钠(30mg/kg) ip麻醉动物，固定，常规方法消毒皮肤，开腹，暴露门静脉并注入肝素钠100U～150U. 游离肝脏，于肝门处剪下取出，置自制的体外灌流系统(另文介绍)进行整体肝两步循环灌流. 前灌流液为含EDTA、无*"Ca, Mg离子的Hanks液，共500mL，其中300mL灌流后丢弃(因含大量红细胞)，另200mL循环使用，速度80mL/min～100mL/min，时间10min～15min. 第二步灌流液为胶原酶液，浓度0.5g/L，灌速50mL/min～70mL/min,时间10min. 两种灌流液在系统内均保持37℃～38℃. 灌流结束后，用剪刀划破肝包膜，剔除大块纤维结缔组织，收集细胞悬液，酌情再置37℃条件下消化10min～15min. 用RPMI 1640培养液终止消化，三层纱布过滤，50g反复离心3次～4次获取肝细胞. 在倒置相差显微镜下，使用血细胞计数板计数肝细胞产量，4g/L台盼兰拒染试验判断细胞活率. 低速离心收集新分离的肝细胞，0.3mol/L戊二醛固定4h，0.039mol/L锇酸后固定，乙醇脱水，Epon618包埋，超薄切片，柠檬酸铅染色，JEM_2000 SX透射电镜观察. 按1×105[wang 1]/mL接种于12孔培养板，使用相差显微镜观察细胞纯度和增殖生长能力，生化分析仪检测培养上清乳酸脱氢酶(LDH)含量.
, 百拇医药
2 结果
用体外循环灌流装置对离体乳猪肝脏进行两步灌流，分离肝细胞的总产量为3.8×109～4.7×109/肝. 用台盼兰染色，肝细胞存活率94%～98%，接种24h，镜下连续计数每100个肝细胞中有非实质细胞2个～4个，肝细胞纯度达96%～98%. 肝细胞接种培养4h后，培养上清中LDH的平均值为13.2U/L±4.1U/L，24h后略有升高，平均浓度17.8U/L±5.4U/L，培养48h的LDH为23.7U/L±3.9U/L.
图1 新分离肝细胞呈“葡萄样”. ×100
图2 培养24h的乳猪肝细胞，镜下见大量双核细胞. ×200
, 百拇医药
新分离的乳猪肝细胞大多呈“葡萄样”相互粘附聚集，单个肝细胞较少见，聚集体内肝细胞数目可高达30个～40个以上(图1). 接种1h，肝细胞均已附壁，聚集体肝细胞先以堆积的形式附壁，随后逐渐铺开，向外伸展，最终呈典型的多边形单层贴壁生长. 培养16h～20h后，肝细胞开始活跃增殖，镜下见大量双核细胞，直至长满培养板，接触抑制为止(图2).
电镜观察显示，分离乳猪肝细胞呈簇状分布，肝细胞具有正常肝细胞的超微结构特征，表现为肝细胞膜及核膜完整，胞质均匀一致，各种细胞器清晰可辨. 其中，线粒体较丰富，可见糖原颗粒. 电镜下所见肝非实质细胞数目与光镜情况相似.
3 讨论
迄今国外已有不少临床与动物实验资料显示，在人肝细胞来源困难的情况下，猪肝细胞可做为良好的细胞材料，用于生物人工肝，发挥解毒和生物合成功能，为暴发性肝衰竭患者提供有效的过渡支持[2]. 国内曾有研究者从乳猪肝组织中提取出促肝再生物质，治疗重症肝炎获得较好的疗效. 我们在以往的研究中发现，分离培养的胎肝细胞具有良好的体外增殖生长能力，能分泌生物活性物质，同样可起到保护肝损伤，治疗肝衰竭的作用[3]. 因此推测，如果使用培养的乳猪肝细胞，可使体外生物人工肝系统发挥较好的人工肝支持与治疗作用.
, 百拇医药
已知制备大量高活性的肝细胞是生物人工肝系统的关键技术之一. 目前，肝细胞分离方法多采用Seglen的原位肝灌流法[4]，我们在多年的细胞培养工作中注意到，对于较大动物，尤其是难消化的动物肝(猪)，此法多有不便. 我们应用自制的体外肝灌流装置，对乳猪肝进行离体两步灌流，消化分离的猪肝细胞产量较多、活性好、纯度高，肝细胞具有正常肝细胞的超微结构特征，接种培养后增殖生长旺盛，从而为乳猪肝细胞用于生物人工肝提供了条件，有关研究正在深入进行之中.
4 参考文献
1 Dixit V. Development of a bioartificial liver using isolated hepatocytes. Artif Organs, 1994;18:371-384
2 Watanabe FD, Mullon CJ, Hewitt WR, Arkadopoulos N, Kahaku E, Eguchi S, Khalili T, Arnaout W, Shackleton CR, Rozga J,Solomon B, Demetriou AA. Clinical experience with a bioartificial liver in the treatment of severe liver failure. A phase I clinical trial.
, 百拇医药
Ann Surg, 1997;225:484-491
3 Wang YJ, Wang XH, Wang YU, Li MD, Ding J. Effects of supernatant from fetal hepatocyte culture on the mice survival
fulminant hepatic failure. Xin Xiaohua Bingxue Zazhi, 1997;5:77-78
4 Seglen PO. Preparation of isolated rat liver cells. Methods Cell Biol, 1976;13:29-83, http://www.100md.com(王英杰 刘国栋 刘俊 李梦东)