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编号:10696362
用分级定量RT-PCR测定中国人血清中HCV RNA
http://www.100md.com 1999年9月15日 《世界华人消化杂志》 1999年第9期
     中国人民解放军第四军医大学全军基因诊断技术研究所 陕西省西安市 710033

    项目负责人
郭晏海中国人民解放军第四军医大学全军基因诊断技术研究所 陕西省西安市 710033

    收稿日期 1999-05-25 接收日期 1999-07-24

    

    Subject headings
hepatitis C virus; RNA, viral/analysis; polymerase chain reaction

    主题词
丙型肝炎病毒;RNA,病毒/分析;聚合酶链反应

, http://www.100md.com     基因的定量分析对分子生物的研究有着重要的作用,而采用PCR方法进行基因定量已成为一种有效的方式. 并且,目前已有多种利用PCR进行基因定量的方法,其中以竞争PCR定量和PE公司既时定量PCR方法测定结果较为准确,应用较多既时定量PCR方法采用了特殊设计的荧光-淬灭探针和精密的既时荧光检测设备进行定量. 该方法简化的操作,提高的测定的灵敏性和准确性,但其试剂和仪器的价值目前相当昂贵,一般实验室难于承担[1]. 而竞争PCR方法虽然操作比较麻烦,但也能进行较准确的定量,适合一般实验室使用,为了进一步简化竞争PCR方法,我们对实验进行了改进,建立分级定量的方法,只用3种浓度的竞争模板与样品RNA的恒定cDNA混合进行3个PCR反应,通过测定待测模板与竞争模板的终产物荧光强度比值来确定待测RNA的初始量. 该方法也适合多个样品同时测定.

    1 材料和方法

    1.1 材料 GQS-960凝胶成象分析系统(第四军医大学基因诊断技术应用研究所),Thermolyne PCR扩增仪(美国),Taq DNA聚合酶、dNTP和Tth酶(Promega公司). 用Beckman Du640核酸和蛋白分析仪(美国). 引物出自HCV RNA 5’端非编码区,经oligo软件设计,引物位置和序列为:C1:(51~70)5’-GTCTTCACGCAGAAAGCGTC,C2:(308~290)5’-GGGCACTCGCAAGCACC扩增片段长度为260bp由上海深工生物工程公司合成. 竞争模板为一段克隆于PUC 19的DNA序列,其两端为C1,C2引物的互补区,其中部与相应的HCV RNA序列只差40bp序列,为代插入片段,目的是最终分离竞争模板和HCV RNA扩增产物.
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    1.2 方法 竞争模板的pUC 19质粒的提取方法按文献[2]方法,用EcoRⅠ酶切使质粒线性化,用Beckman Du640核酸和蛋白分析仪进行竞争模板的定量标定. 血清按酚/氯仿抽提,乙醇沉淀方法进行血清HCV RNA提取. 反转录合成cDNA:将HCV RNA用Tth酶反转录合成HCV RNA的cDNA具体过程按文献[3]的方法. 分级定量PCR扩增:将反转录合成的cDNA等量取3份分别与3个定量反应管的PCR反应液混合,3个PCR反应液中分别含有102cop,104cop,106cop的竞争模板. PCR反应成分为50mmol/L KCl,100mmol/L Tris-HCl pH 8.3,1.5mmol/L MgCl2,200μmol/L dNTP,C1和C2引物各30pmol, Taq DNA聚合酶1U,反应总体积30μL,反应程序:94℃,预变性2min,然后94℃ 30s,55℃ 40s,71℃ 50s循环35次,最后72℃延伸5min,最后各准确取10μL PCR反应物. 进行3%琼脂凝胶电泳,荧光强度测定:将用溴化乙锭染色的凝胶板置于GQS-960型凝胶定象分析系统上扫描,测定待测模板和竞争模板的PCR产物的荧光强度比值,并用微机计算结果.
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    2 结果

    2.1 竞争模板与待测模板cDNA扩增效率 对3个待测模板cDNA与竞争模板PCR产物荧光强度比分别为10∶1,1∶1,1∶10的反应液进行106倍稀释,各取3μL稀释后的溶液进行再次PCR扩增,扩增条件与原PCR相同,循环35次最后测定两者荧光强度之比仍为10∶1,1∶1,1∶10,说明所用引物对待测模板和竞争模板的扩增效率相等.

    2.2 引物对两种模板的检测灵敏度 用传统的竞争PCR方法测定一血清提取HCV DNA反转录合成cDNA,cDNA分别与竞争模板102,104,106cop/tub的PCR荧光强度为1∶1,将这些样品稀释成1×105,1×104,1×103,1×102,1×106,分别进行PCR扩增反应,扩增35次,结果两种模板都被检测到1×101cop的模板量.
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    2.3 三个反应的试性范围 通过用已知拷贝数的cDNA配制101,5×101,102,5×102,1×103,5×103,1×104,5×104,1×105,5×105,1×106,5×106,1×107. 分别用102cop的竞争模板与1×101,5×101,1×102,5×102,1×103;104cop竞争模板与1×103,5×103,1×104,5×104,1×105cop;106cop竞争模板与1×105,5×105,1×106,5×106,1×107 cop分别混合进行PCR扩增,结果所得图形线形良好
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    (图1).

    1 竞争模板和待测模板初始量与荧光强度比的标准曲线.

    当竞争模板为102cop时,方程式为lgAx/A0=lgX-lgM0,Ax为待测模板扩增产物光密度值,A0为竞争模板扩增产物光密度值,M0为竞争模板初始量,X为待测模板初始量,当竞争模板为104cop,106cop时标准曲线与上图类似(未给出,只是lgM0=4,6).

    2.4 临床样品的检测结果 用该定量法对20份HCV感染者的血清进行定量测定,结果平均血清HCV RNA的含量为5×107cop/L,最少含量为1×105cop/L,最高含量为5×108cop/L.
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    3 讨论


    用竞争模板定量需要有一个前提条件,既竞争模板和待测模板的扩增效率相等[5],在实验中对模板和待测模板一定比例的3个反应体系进行再扩增,发现两者扩增产物的比值在扩增前后没有明显改变,说明两者的扩增效率是相等的. 该实验中竞争模板比待测模板长40bp,引物结合区序列完全相同. 在实验中,为了便于最后的凝胶电泳分离,我们增加了两者的差距(70bp,100bp),但发现竞争模板与待测模板长度相差越大扩增效率差别越大,尤其是在两者初始模板量相差较大时(10∶1或1∶10)扩增会出现大的偏差,而相差40bp时偏差最小. 不过在该情况下,要求扩增的特异高,同时要走高浓度(30g/L)的琼脂糖凝胶才可将待测与竞争模板扩增产物分离开.

    实验中采用的是Tth DNA聚合酶进行一步RT-PCR方法,该方法在65℃情况下先进反转录合成cDNA,因而减少了非特异产物的出现[2]. 而传统的巢式RT-PCR方法虽然有更高的灵敏度和特异性. 由于操作麻烦而且定量误差较大,在本实验中未被采纳. 另外我们用Tth的同时又用了Taq DNA聚合酶,是为了提高扩增过程中的保险系数. 该方法的理论基础是Ax/A0=(265Yx)/(305Y0)=[265×(1+e)]/[305M0(1+e)],Ax/A0为待测模板与竞争模板的扩增产物带荧光强度比;Yx/Y0为待测模板与竞争模板的扩增产物拷贝数之比,,265为待测模板的碱基数305为竞争模板的硷数,X为待测模板的初始量,M0为竞争模板的初始量,e为扩增效率;n为扩增次数. 当两种模板扩增效率相同,循环次数相等时,上式可变为lg(Ax/A0)=lgx+lg(265/305M0),因此,lgX与lg(Ax/A0)是呈线性关系[4-6]. 在实际中由于采用GQS 9600型凝胶呈象分析仪进行凝胶荧光扫描测定,可以保证在竞争模板与待测模板差1个数量级之内,上述等式呈线性关系[7,8]. 而超过1个数量级则偏离线性,这可能是由于超出检测系统的线性范围.
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    用该定量方法对HCV血清进行测定,结果血清中HCV RNA含量在3×105~6×108cop/L,平均在1×106cop/L,这一结果与文献报道的一致. 但我们认为这一结果要比实际值低,因为该方法中采用的竞争模板是DNA,没有从RNA开始进行竞争反应,忽略了反转录过程的因素.

    4 参考文献


    1 Heid CA, Stevens J, Livak KJ, Williams PM. Real time quantitative PCR, genome research. Cold Spring Harbor Laboratory

    Press, 1996;6:986-994

    2 Kumar U, Thomas HC, Monjardino J. Serum HCV RNA levels in chronic HCV hepatitis measured by quantitative PCR assay;
, 百拇医药
    correlation with serum AST. J Virol Meth, 1994;47:95-102

    3 Chomeyanski P, Sacchi NA. Single-step method of RNA isolation by acid guanidine thiocyanate-phenol-chlorofrom extraction. 

    Anal Biochem, 1987;162:156-159

    4 Kricka LJ. Chemiluminescent and bioluminescent techniques. Clin Chem, 1991;37:1472-1481

    5 Martin CS, Butler L, Bronstein I. Quantitation of PCR products with chemiluminescence. Biotechniques, 1995;18:908-913
, 百拇医药
    6 Chen B, Cheng ZH, Zhu JF. A novel method of detecting products of PCR. Chin J Med Lab Sci, 1996;19:151-159

    7 Dewey WC, Thompson LL, Trinh ML, Latz DL, Ward JF. A charg-coupled-device camera image analysis system for quantifying

    DNA distributions in agarose gels after pulsed-field gel electrophoresis. Radiat Res, 1994;140:37-47

    8 Minamikawa-Tachino R, Ishii K, Sakuraba H, Suzuki S, Kaminuma K. Quantitative analysis of dystrophin gene amplification

    products using a PC-based image analysis system. Int J Bio Med Comput, 1993;33:277-286, http://www.100md.com(郭晏海 闫小君 侯 瑜 任峰玲 赵锦荣 崔大祥 韩锋产 段 杰 )