原发性肝癌患者手术前后外周血AFPmRNA测定的意义
中国人民解放军总医院消化科 北京市 100853
九五军队科技攻关项目，No.96Q105
项目负责人 刘迎娣中国人民解放军总医院消化科 北京市 100853
收稿日期 1999-06-03
Subject headings liver neoplasms/surgery; carcinoma, hepatocellular; RNA, messenger; alpha-fetoproteins
主题词 肝肿瘤/外科学；癌，肝细胞；RNA，信使；甲胎蛋白类
, 百拇医药
肝移植后肝癌复发率很高；手术后短期内即发现复发或转移为临床提出了新的课题，即手术本身是否与肝癌的转移有关. 我们通过对肝癌患者围手术期外周血AFPmRNA的定量检测，探讨围手术期外周血AFPmRNA水平变化规律极其临床意义.
1 临床资料
1998-10/1999-06我科肝细胞癌住院患者12例. 手术治疗前及治疗后1，3，5，7，14d分别采取外周血5mL，进行AFPmRNA定量检测，采用人类肝癌细胞系HepG2作为检测结果阳性对照，人类胃癌细胞系作为阴性对照. 总RNA提取、反转录cDNA均参照有关文献. 引物设计：根据Oligo引物设计软件设计引物. 采用定点突变(G→A，C→T)方法从AFPmRNA阳性组织中制备并纯化模板. 此模板已引入AA∧GCTTHindⅢ酶切位点，与其竞争PCR产物酶切后进行对比. 本实验模板A(OD值)为0.077，计算其模板浓度为5.0×1017 copies/L. 将其浓度稀释为2.5×1017copies/L. 分别取4μL模板与待测标本于一个反应体系里进行PCR. 扩增片段长度为184bp. 经HindⅢ酶酶切，产物长度分别为90bp，94bp. 20g/L琼脂糖凝胶电泳，在紫外透射下观察结果，以条带量度最接近的模板数为待测标本浓度. 采用SNK检验. 以P<0.05为显著越性界值，结果见表1.
, http://www.100md.com
表1 肝癌切除术前后AFPmRNA检测结果(copies/mL)
, http://www.100md.com
经SDAS统计软件SNK检验，各组与术前比较除术后d1呈显著性差异外(P<0.05)，差异均不显著(P>0.05).
模板拷贝数计算公式：OD×125×50/1000 × 6.02×1023 / 649×357×1000copies/μL
2 讨论
本结果表明，虽然不同患者手术前后AFPmRNA水平不同，但其AFPmRNA的含量变化具有一定的倾向性，术后1d外周血AFPmRNA含量较高，经SNK检验具有显著性意义(P<0.05). 以后逐渐下降，1wk后恢复到术前水平，有2例2wk以后转为阴性. 原因可能有：肝癌组织细胞间粘附作用较正常组织下降，肿瘤细胞之间粘附因子缺乏；肿瘤的新生血管异常及动静脉瘘的发生，也促进手术外力下肿瘤细胞入血；手术过程肝癌组织和正常肝组织的挤压而造成的直接损伤；手术使机体免疫力下降，使本身具有免疫逃避功能的肿瘤细胞得以在血液中存活. 有2例患者术后2wk转为阴性，显示出手术切除治疗效果较满意，可能会有较好的预后.从本结果看出，手术后1d外周血AFPmRNA含量较高，提示此时外周血中肝癌细胞脱落入血增多，有可能导致日后发生转移. 指导临床在术后近期内给予全身化疗，杀灭血液中的肿瘤细胞，预防和(或)减缓转移的发生., 百拇医药(刘迎娣 杨德利 梁 敏 梁 浩 孙晓华 程留芳 汪鸿志)
九五军队科技攻关项目，No.96Q105
项目负责人 刘迎娣中国人民解放军总医院消化科 北京市 100853
收稿日期 1999-06-03
Subject headings liver neoplasms/surgery; carcinoma, hepatocellular; RNA, messenger; alpha-fetoproteins
主题词 肝肿瘤/外科学；癌，肝细胞；RNA，信使；甲胎蛋白类
, 百拇医药
肝移植后肝癌复发率很高；手术后短期内即发现复发或转移为临床提出了新的课题，即手术本身是否与肝癌的转移有关. 我们通过对肝癌患者围手术期外周血AFPmRNA的定量检测，探讨围手术期外周血AFPmRNA水平变化规律极其临床意义.
1 临床资料
1998-10/1999-06我科肝细胞癌住院患者12例. 手术治疗前及治疗后1，3，5，7，14d分别采取外周血5mL，进行AFPmRNA定量检测，采用人类肝癌细胞系HepG2作为检测结果阳性对照，人类胃癌细胞系作为阴性对照. 总RNA提取、反转录cDNA均参照有关文献. 引物设计：根据Oligo引物设计软件设计引物. 采用定点突变(G→A，C→T)方法从AFPmRNA阳性组织中制备并纯化模板. 此模板已引入AA∧GCTTHindⅢ酶切位点，与其竞争PCR产物酶切后进行对比. 本实验模板A(OD值)为0.077，计算其模板浓度为5.0×1017 copies/L. 将其浓度稀释为2.5×1017copies/L. 分别取4μL模板与待测标本于一个反应体系里进行PCR. 扩增片段长度为184bp. 经HindⅢ酶酶切，产物长度分别为90bp，94bp. 20g/L琼脂糖凝胶电泳，在紫外透射下观察结果，以条带量度最接近的模板数为待测标本浓度. 采用SNK检验. 以P<0.05为显著越性界值，结果见表1.
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表1 肝癌切除术前后AFPmRNA检测结果(copies/mL)
| 编号/d | 0 | 1 | 3 | 5 | 7 | 14 |
| 1 | 106 | 108 | 107 | 107 | 106 | 104 |
| 2 | 107 | 108 | 107 | 107 | 106 | 106 |
| 3 | 107 | 109 | 107 | 107 | 107 | 107 |
| 4 | 107 | 108 | 107 | 106 | 106 | 106 |
| 5 | 106 | 108 | 107 | 107 | 106 | 105 |
| 6 | 107 | 109 | 107 | 107 | 107 | 108 |
| 7 | 106 | 107 | 106 | 104 | 103 | 0 |
| 8 | 106 | 109 | 107 | 107 | 106 | 106 |
| 9 | 107 | 109 | 107 | 107 | 107 | 106 |
| 10 | 107 | 109 | 108 | 108 | 108 | 108 |
| 11 | 107 | 109 | 107 | 107 | 107 | 107 |
| 12 | 106 | 109 | 107 | 106 | 104 | 0 |
| x±s | 6.25×106 | 5.01×108 | 1.68×107 | 1.52×107 | 1.21×107 | 1.87×107 |
| 4.63×106 | 4.79×108 | 2.52×107 | 2.70×107 | 2.80×107 | 3.82×107 |
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经SDAS统计软件SNK检验，各组与术前比较除术后d1呈显著性差异外(P<0.05)，差异均不显著(P>0.05).
模板拷贝数计算公式：OD×125×50/1000 × 6.02×1023 / 649×357×1000copies/μL
2 讨论
本结果表明，虽然不同患者手术前后AFPmRNA水平不同，但其AFPmRNA的含量变化具有一定的倾向性，术后1d外周血AFPmRNA含量较高，经SNK检验具有显著性意义(P<0.05). 以后逐渐下降，1wk后恢复到术前水平，有2例2wk以后转为阴性. 原因可能有：肝癌组织细胞间粘附作用较正常组织下降，肿瘤细胞之间粘附因子缺乏；肿瘤的新生血管异常及动静脉瘘的发生，也促进手术外力下肿瘤细胞入血；手术过程肝癌组织和正常肝组织的挤压而造成的直接损伤；手术使机体免疫力下降，使本身具有免疫逃避功能的肿瘤细胞得以在血液中存活. 有2例患者术后2wk转为阴性，显示出手术切除治疗效果较满意，可能会有较好的预后.从本结果看出，手术后1d外周血AFPmRNA含量较高，提示此时外周血中肝癌细胞脱落入血增多，有可能导致日后发生转移. 指导临床在术后近期内给予全身化疗，杀灭血液中的肿瘤细胞，预防和(或)减缓转移的发生., 百拇医药(刘迎娣 杨德利 梁 敏 梁 浩 孙晓华 程留芳 汪鸿志)