原发性肝癌的体内基因治疗研究与进展
中国人民解放军第一军医大学珠江医院消化科 广东省广州市 510282
项目负责人 宁晓燕中国人民解放军第一军医大学珠江医院消化科 广东省广州市 510282
收稿日期 1999-10-25 接收日期 1999-12-01
Subject headings liver neoplasms/therapy; carcinoma, hepatocellular/therapy; gene therapy
主题词 肝肿瘤/治疗；癌，肝细胞/治疗；基因治疗
原发性肝癌恶性程度高，预后差，治疗效果不理想. 肝癌的基因治疗是针对基因表达异常的病因治疗，因而有望成为一种理想的治疗方法，或成为肝癌综合治疗中一个重要的方面. 原发性肝癌的体外基因治疗已有大量研究报道，近年来肝癌的体内基因治疗研究也取得一些进展，为肝癌的基因治疗过渡到临床应用提供了更直接的依据，综述近年来这方面的研究与进展.
1 目的基因的选择
1.1 自杀基因 是肝癌基因治疗中应用最多的目的基因，自杀基因是病毒、细菌等原核生物中具有特殊功能的酶类基因，此类基因转入哺乳动物细胞后产生的酶能将无毒或毒性极低的药物前体转化成细胞毒性代谢产物，导致肿瘤细胞自杀，因此又称为病毒导向酶解药物前体疗法(VDEPT). 研究较多的有胸苷激酶基因HSV-tk，VIV-tk和胞嘧啶脱氨酶基因CD，它们分别将无毒的丙氧鸟苷GCV转化成毒性磷酸化GCV，将无毒的6甲基嘌呤阿拉伯糖核苷(araM)转变成毒性6甲基嘌呤阿拉伯糖三磷酸核苷(araATP)、将无毒的5氟胞嘧啶(5-FC)生成毒性5氟脲嘧啶(5-FU). 其中HSV-tk与GCV体系应用最多，GCV变成磷酸化GCV后可结合于延长的DNA链，阻止DNA的合成，杀死分裂细胞. 自杀基因用于体内、体外杀伤肝癌细胞的作用均很强，这与旁观者效应有很大关系，旁观者效应也叫临近细胞杀伤效应，即转染自杀基因的tk+细胞不但自杀，而且还能杀伤临近未转染自杀基因的tk-细胞. 其机制尚不十分明确，有人认为与细胞间的缝隙连接有关[1]，还有人认为与肿瘤细胞坏死后肿瘤抗原诱导的免疫反应有关[2，3]. 研究发现在体外仅有10%的tk+细胞就足以将一起培养的所有肿瘤细胞杀伤，体内动物实验中同样仅有10%细胞转染自杀基因就足以使肿瘤生长受抑制[4，5]这是自杀基因治疗的一大优势，但同时又要求自杀基因的转染要对肝癌细胞具有靶向性，使自杀基因的转染仅限于肝癌细胞.
1.2 抑癌基因 目前发现的抑癌基因有20多种，其中位于染色体17P 13.1的P53基因研究较多，正常P53基因产物野生型P53蛋白，能抑制某些促使细胞进入有丝分裂的酶活性，阻止细胞进入DNA合成期，抑制细胞的分裂和增殖，并且使细胞DNA损伤时有充分的时间修复，即使不能修复，野生型P53蛋白还能启动细胞的程序性死亡过程，防止细胞的恶性转化. 半数的肝癌中有P53基因突变，而且p53基因突变与肝癌的分化程度、转移及术后复发有密切关系；Xu et al[6]还发现，通过导入正常P53基因恢复肝癌细胞中野生型P53蛋白功能，可增强化疗药物敏感性. 因此导入正常P53基因对于治疗肝癌、防止肝癌术后复发均有重要意义.
1.3 反义基因 反义基因的应用包括反义RNA，反义DNA，ribozyme三大技术，是根据碱基互补原理，利用与目标基因特定序列互补的短链核苷酸片段来封闭目标基因的表达 ，从而达到基因治疗的目的. 研究发现原癌基因N-ras, C-myc, C-ets-2, C-fms的激活，肝癌自分泌生长因子如转化生长因子(TGF-α)及其受体、表皮生长因子(EGF)受体、集落刺激因子Ⅰ(CSF-Ⅰ)受体、胰岛素样生长因子Ⅱ(IGF-Ⅱ)及其受体(IGF-ⅡR)的过度表达均与肝癌的发生、发展关系密切，将这些基因的反义基因作为基因封条导入肝癌细胞，抑制原癌基因和肝脏自分泌生长因子的表达与过度表达，达到治疗肝癌的目的.
1.4 免疫基因 将具有免疫调节作用的细胞因子(白介素类ILs、干扰素族INFs、肿瘤坏死因子TNF-α等)基因、肝癌单链抗体基因、MHC-Ⅰ类抗原基因等转入肿瘤细胞，使肿瘤局部产生较高浓度的细胞因子或抗肝癌抗体，通过免疫抗肿瘤作用达到治疗肝癌的目的.
1.5 联合基因 将自杀基因、反义基因、抑癌基因、细胞因子基因等联合应用进行肝癌基因治疗，各种目的基因协同发挥各自不同的抗肿瘤作用，更能有效地达到抑制肿瘤的目的.
2 基因转染的载体
2.1 病毒载体 ①逆转录病毒：主要作用于分裂增殖细胞，因此对肝癌细胞具有相对靶向性，可整合于细胞染色体基因组而持续、稳定地表达，体内应用极少引起免疫反应，但难于制备高滴度的病毒，转染效率不高，而且有诱发插入性突变的可能. ②腺病毒：既可感染分裂细胞也可感染处于静止期的细胞，因此对肝癌细胞靶向性不强，可在非肿瘤组织中产生毒性反应，尤其是在应用自杀基因治疗时，AFP增强子/启动子序列、AFP增强子/清蛋白启动子序列及CEA启动子序列的调控可达到靶向肝癌细胞的目的[7，8]；腺病毒不整合入宿主基因组，故不能长期稳定表达，但更具安全性，并可制备出高滴度的病毒，转染效率较高，故应用最多. ③腺相关病毒：是一种复制缺陷病毒，它的特点是对人类没有致病性，能感染非分裂S相细胞，还能将基因转入非周期肿瘤细胞并能整合到宿主DNA的特定部位，也被用于肝癌的体内基因治疗.
2.2 脂质体 脂质体较病毒载体转染效率低，但具有安全低毒、操作简便、无免疫原性、能感染分裂细胞也能感染非分裂细胞、携带外源基因大小不受限制的特点. 脂质体包括两类，一类是将阳离子脂质体(lipofectin, lipofectamine等)与带负电荷的质粒DNA混合，另一类是将质粒DNA包入单层或复层脂质体(阴离子、阳离子或中性)，前者为商品脂质体，应用简便、规则，后者可根据需要制备成温度敏感脂质体、PH敏感脂质体或靶向性脂质体等.
3 用法、疗效
3.1 给药途径 ①瘤内注射：是一种直接、简单的用药途径，可使肿瘤局部有较高的目的基因表达，发挥较强的抗肿瘤作用，并且减少目的基因在各系统的暴露和毒、副反应的发生. ②血管系统给药：静脉注射：此全身给药途径较适用于靶向性载体如靶向脂质体介导的基因治疗.门静脉注射或选择性肝动脉灌注：肝脏接受门静脉和肝动脉双重血液供应，正常肝组织以门静脉供血为主，肝癌组织则以肝动脉供血为主，在基因转染效率和抑制肿瘤生长的比较中，选择性肝动脉灌注给药均明显优于门静脉注射[9]，但后者具有手术操作简单的优点.
3.2 疗效 在不同的动物模型上，自杀基因[10]、野生型P53基因[11]、IL-2基因[12]、TNF-α基因[13]、反义血管内皮生长因子(VEGF)基因[14]等，通过瘤内注射、肝动脉灌注、门静脉注射、静脉注射等途径进行基因治疗，均取得动物生存期延长，肿瘤生长受抑制甚至肿瘤完全消退的治疗效果. 在自杀基因与IL-2基因联合[15]、自杀基因与粒单核集落刺激因子(GM-CSF)基因联合[16]的治疗中，抗肿瘤作用均显著高于单用一种基因治疗.
Cheng et al用二乙基亚硝胺诱发大鼠多结节性肝癌，经门静脉注射自杀基因HSV-tk、继之每天ip GCV，治疗组肿瘤生长明显受到抑制甚至完全消退，但肿瘤完全消退的大鼠中多数出现肝功能受损、部分死于肝功能衰竭，可见虽然自杀基因治疗组肿瘤生长明显受到抑制，但同时出现了严重的、致命的肝损害，通过检测分裂细胞核抗原发现，二乙基亚硝胺诱发肝癌的同时也诱导肝细胞的分裂，而分裂的肝细胞对自杀基因敏感，因此大量正常肝细胞被杀伤导致严重的肝功能损害[17]，这一点也说明动物模型上的肝癌基因治疗与临床人肝癌基因治疗在某些方面仍有较大差异.
总之，肝癌体内基因治疗的研究虽然取得一些令人鼓舞的结果，但动物实验与临床应用实际上还存在较大的距离，而且目前基因治疗还存在许多有待解决的问题，如载体的安全性、有效性及靶向性问题，外源基因能否持续、稳定表达的问题，因此过渡到临床应用还需进行大量的探索与研究. 但肝癌的基因治疗是针对基因突变的病因治疗，最终仍有望成为一种能够彻底治疗肝癌的方法，或成为肝癌综合治疗中一个重要的手段.
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