大黄对胃粘膜细胞功能的影响
江西医学院第一附属医院消化所 江西省南昌市 330006
国家自然科学基金资助，No.39360033
项目负责人 祝金泉江西医学院第一附属医院消化所 江西省南昌市 330006
收稿日期 1999-04-28 接收日期 1999-11-15
Subject headings gastric mucosa/pathology; rhubarb/pharmacology; stomach diseases/TDM
主题词 胃粘膜细胞/病理学；大黄/药理学；胃疾病/中药疗法
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临床实践表明小剂量大黄具有健胃[1,2]，增进食欲，促进消化功效，对慢性胃炎有较好的疗效[3]. 为阐明其作用机制，我们采用大黄与胃粘膜细胞共同培养，观察对胃粘膜细胞增殖、泌酸、泌胃蛋白酶的影响.
1 材料和方法
1.1 大黄的制备 取生大黄80g(本院中药房提供，剂量为实验用方)，切成小块，用75%酒精500mL在4℃浸泡2d后用高速捣碎机(10000r/min)捣碎成匀浆. 4℃冰箱静置1wk. 匀浆以4000r/min离心20min取上清，冷冻干燥，称重.
1.2 199培养基的制备 199培养粉11g，碳酸氢钠0.35g，小牛垂体浸出液25mL(含蛋白100mg)，氢化可的松10mg，胰岛素40U，丙酮酸钠100mg，青、链霉素各10万U，Hepes 5.95g，加蒸馏水至1000mL.
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1.3 大黄培养液 取上述制备的大黄冻干粉分别用199培养基配制成0.1%，1%，10%的大黄培养基.
1.4 胃粘膜细胞的制备 取外科手术切除的新鲜胃标本，用眼科剪分离大致正常胃粘膜，用含青、链霉素的Hank＇s液反复洗涮3～5次，再剪成1mm～2mm的小块，再离心洗二次，置0.5g/L的Ⅰ型胶原酶中，37℃消化1h离心收集细胞. 用台盼蓝液计数活细胞，分别用199培养基和0.1%，1%，10%的大黄培养液配成1×104/mL单细胞悬液. 先后共取6个不同个体的胃粘膜组织，分批进行试验.
1.5 细胞培养及实验设计 96孔细胞培养板培养细胞. 实验分为实验组和对照组；其中实验组又分为0.1%，1%，10%三个大黄浓度组. 实验组每孔加入0.1mL大黄培养液配制的细胞悬液. 对照组每孔加入199培养基的细胞悬液0.1mL. 置37℃， 50mL/L CO2细胞培养箱培养. 每隔3d换相应培养基一次.
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1.6 3H-胸腺嘧啶核苷掺入试验(3H-TdR) 细胞培养48h，生长旺盛时，实验组和对照组各取10孔细胞换含37kBq3H-TdR(上海原子能研究所提供)的相应培养基，隔日试验一次，培养24h后，按常规测定细胞每分钟放射核素闪烁仪数值(cpm). 每批共测9次，取各孔及各次的均值.
1.7 胃蛋白酶测定 取实验组和对照组培养d3～d22隔日培养上清，采用改良李氏法[4]测定胃蛋白酶含量. 每组取10个复孔上清，每批测定9次的均数. 计算公式：胃蛋白酶(μ/h)=10U/(HVS). 其中μ/h为每小时产胃蛋白酶的单位数：U为培养液总量/孔(mL)；H为培养时间(h)；V为试验用上清的量(mL)；S为反应终点时间(s).
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1.8 胃酸测定 取实验组和对照组培养d2～d22隔天培养上清，立即用XYD-3型pH测定仪测定pH值. 每组测定10个复孔，共测9次，取均值.
2 结果
2.1 细胞增殖 显微镜观察见经胶原酶消化的胃粘膜细胞成为单个细胞，活细胞达92%以上. 培养3d观察各组细胞生长情况，可见部分细胞贴壁生长，细胞呈多角形或梭形；6d后呈岛状生长，并可见腺体样结构. 但多数细胞呈悬浮生长，6d后悬浮细胞呈现团块样生长. 培养液中见大量粘液,d10左右为增殖高峰，d20细胞开始退化死亡.
实验组与对照组不同时间测定cmp值结果见表1. 实验组中不同浓度组cmp均数与对照组比较无明显差异(P>0.05)，但1%浓度组培养d8,10,12的cmp值与对照组比较差异有显著意义(P<0.05).
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表1 3H-TdR法各组cmp值(x±s)
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aP<0.05，vs 对照组.
2.2 胃蛋白酶测定 各组上清中胃蛋白酶含量见表2. 实验组除0.1%组以外，其他二组胃蛋白酶含量均显著高于对照组(P<0.05)，含量最高者为1%浓度组.
2.3 培养上清pH值 开放放置在50mL/L CO2孵箱中无细胞的199培养基pH值变化在7.2～7.4之间. 实验组及对照组培养上清pH值见表2. 实验组中3种不同浓度大黄培养上清pH值绝对数均低于对照组，但无统计学意义.
表2 胃蛋白酶、pH值测定结果(x±s)
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3 讨论
大黄属泻下药，味苦性寒，归胃、大肠、肝经. 具有泻热通便，活血祛瘀，健胃之功效. 《内经》谓本品能“荡涤肠胃，推陈致新，通利水谷”. 其有效成分为蒽醌衍生物及鞣酸. 现代医学方法研究证实大黄除刺激胃肠蠕动加快外[5]，还具有抑制金黄色葡萄球菌，大肠杆菌、痢疾杆菌，绿脓杆菌，肺炎双球菌等的生长繁殖. 但大黄对胃粘膜细胞功能代谢影响的研究尚少见报道. 我们的研究结果表明，大黄促进胃粘膜主细胞分泌胃蛋白酶和轻度增加胃粘膜细胞增殖作用，但对胃粘膜壁细胞分泌胃酸无影响. 结果显示，1%大黄浓度对胃蛋白酶和细胞增殖作用比0.1%和10%显著，特别是对胃蛋白酶作用更明显. 对胃粘膜细胞增殖作用，实验组中3种不同浓度cpm均值与对照组均无差异，但1%浓度组中培养d8,10,12时cpm显著高于对照组. 因此，大黄对胃功能的影响存在适宜剂量问题. 从我们研究结果的绝对数和统计资料显示1%大黄浓度对胃较适宜，有健胃作用. 这些结果与临床应用小剂量大黄健脾益胃，增进食欲，帮助消化等作用相符. 我们的体会，所谓小剂量大黄个体差异较大，一般3g～10g/次，原则上服用后大便稍软而不泻.
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4 参考文献
1 颜正华主编. 临床实用中药学. 北京：人民卫生出版社，1984：337-340
2 崔树德主编. 中药大全. 哈尔滨：黑龙江科学技术出版社，1989：177-181
3 张俊庭主编. 中国中医特治新法大全. 北京：中国中医药出版社，1996：144-145
4 上海市医学检验所. 临床生化检验(下册). 上海：上海科技出版社，1982：52-53
5 张俊庭主编. 中国中医药最新研创大全. 北京：中医古藉出版社，1996：2005-2006, 百拇医药(祝金泉 谢 勇 张 火昆和 黄德强 陈 江 王旭安 王崇文)
国家自然科学基金资助，No.39360033
项目负责人 祝金泉江西医学院第一附属医院消化所 江西省南昌市 330006
收稿日期 1999-04-28 接收日期 1999-11-15
Subject headings gastric mucosa/pathology; rhubarb/pharmacology; stomach diseases/TDM
主题词 胃粘膜细胞/病理学；大黄/药理学；胃疾病/中药疗法
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临床实践表明小剂量大黄具有健胃[1,2]，增进食欲，促进消化功效，对慢性胃炎有较好的疗效[3]. 为阐明其作用机制，我们采用大黄与胃粘膜细胞共同培养，观察对胃粘膜细胞增殖、泌酸、泌胃蛋白酶的影响.
1 材料和方法
1.1 大黄的制备 取生大黄80g(本院中药房提供，剂量为实验用方)，切成小块，用75%酒精500mL在4℃浸泡2d后用高速捣碎机(10000r/min)捣碎成匀浆. 4℃冰箱静置1wk. 匀浆以4000r/min离心20min取上清，冷冻干燥，称重.
1.2 199培养基的制备 199培养粉11g，碳酸氢钠0.35g，小牛垂体浸出液25mL(含蛋白100mg)，氢化可的松10mg，胰岛素40U，丙酮酸钠100mg，青、链霉素各10万U，Hepes 5.95g，加蒸馏水至1000mL.
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1.3 大黄培养液 取上述制备的大黄冻干粉分别用199培养基配制成0.1%，1%，10%的大黄培养基.
1.4 胃粘膜细胞的制备 取外科手术切除的新鲜胃标本，用眼科剪分离大致正常胃粘膜，用含青、链霉素的Hank＇s液反复洗涮3～5次，再剪成1mm～2mm的小块，再离心洗二次，置0.5g/L的Ⅰ型胶原酶中，37℃消化1h离心收集细胞. 用台盼蓝液计数活细胞，分别用199培养基和0.1%，1%，10%的大黄培养液配成1×104/mL单细胞悬液. 先后共取6个不同个体的胃粘膜组织，分批进行试验.
1.5 细胞培养及实验设计 96孔细胞培养板培养细胞. 实验分为实验组和对照组；其中实验组又分为0.1%，1%，10%三个大黄浓度组. 实验组每孔加入0.1mL大黄培养液配制的细胞悬液. 对照组每孔加入199培养基的细胞悬液0.1mL. 置37℃， 50mL/L CO2细胞培养箱培养. 每隔3d换相应培养基一次.
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1.6 3H-胸腺嘧啶核苷掺入试验(3H-TdR) 细胞培养48h，生长旺盛时，实验组和对照组各取10孔细胞换含37kBq3H-TdR(上海原子能研究所提供)的相应培养基，隔日试验一次，培养24h后，按常规测定细胞每分钟放射核素闪烁仪数值(cpm). 每批共测9次，取各孔及各次的均值.
1.7 胃蛋白酶测定 取实验组和对照组培养d3～d22隔日培养上清，采用改良李氏法[4]测定胃蛋白酶含量. 每组取10个复孔上清，每批测定9次的均数. 计算公式：胃蛋白酶(μ/h)=10U/(HVS). 其中μ/h为每小时产胃蛋白酶的单位数：U为培养液总量/孔(mL)；H为培养时间(h)；V为试验用上清的量(mL)；S为反应终点时间(s).
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1.8 胃酸测定 取实验组和对照组培养d2～d22隔天培养上清，立即用XYD-3型pH测定仪测定pH值. 每组测定10个复孔，共测9次，取均值.
2 结果
2.1 细胞增殖 显微镜观察见经胶原酶消化的胃粘膜细胞成为单个细胞，活细胞达92%以上. 培养3d观察各组细胞生长情况，可见部分细胞贴壁生长，细胞呈多角形或梭形；6d后呈岛状生长，并可见腺体样结构. 但多数细胞呈悬浮生长，6d后悬浮细胞呈现团块样生长. 培养液中见大量粘液,d10左右为增殖高峰，d20细胞开始退化死亡.
实验组与对照组不同时间测定cmp值结果见表1. 实验组中不同浓度组cmp均数与对照组比较无明显差异(P>0.05)，但1%浓度组培养d8,10,12的cmp值与对照组比较差异有显著意义(P<0.05).
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表1 3H-TdR法各组cmp值(x±s)
| 组别浓 度 (%) | 2d | 4d | 6d | 8d | 10d | 12d | 14d | 16d | 18d | 20d | 22d |
| 对照 0 | 2715±167 | 2746±214 | 3254±68 | 3467±2 53 | 4917±301 | 5601±434 | 5221±239 | 4439±460 | 4050±379 | 3755±191 | 3896±148 |
| 实验0.1 | 2064±98 | 2841±74 | 2790±108 | 3184±175 | 4234±319 | 5881±390 | 5464±277 | 5217±388 | 4655±415 | 4005±280 | 3344±126 |
| 1 | 2515±112 | 3248±154 | 3917±89 | 4676±254 | 8657±894a | 8480±1512a | 6054±567a | 5861±216 | 5114±476 | 4856±655 | 4122±390 |
| 10 | 2625±40 | 2976±76 | 3756±265 | 3506±297 | 8370 ±901 | 6231±585 | 5874±644 | 5075±345 | 4771±640 | 3755±357 | 3522±279 |
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aP<0.05，vs 对照组.
2.2 胃蛋白酶测定 各组上清中胃蛋白酶含量见表2. 实验组除0.1%组以外，其他二组胃蛋白酶含量均显著高于对照组(P<0.05)，含量最高者为1%浓度组.
2.3 培养上清pH值 开放放置在50mL/L CO2孵箱中无细胞的199培养基pH值变化在7.2～7.4之间. 实验组及对照组培养上清pH值见表2. 实验组中3种不同浓度大黄培养上清pH值绝对数均低于对照组，但无统计学意义.
表2 胃蛋白酶、pH值测定结果(x±s)
| 组别 | 浓度(%) | 胃蛋白酶(μ/h) | pH |
| 对照组 | 0 | 0.38±0.08 | 6.90±0.57 |
| 实验组 | 0.1 | 0.40±0.05 | 6.40±0.32 |
| 1 | 0.58±0.15 | 6.10±0.09 | |
| 10 | 0.48±0.13 | 6.06±0.18 |
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3 讨论
大黄属泻下药，味苦性寒，归胃、大肠、肝经. 具有泻热通便，活血祛瘀，健胃之功效. 《内经》谓本品能“荡涤肠胃，推陈致新，通利水谷”. 其有效成分为蒽醌衍生物及鞣酸. 现代医学方法研究证实大黄除刺激胃肠蠕动加快外[5]，还具有抑制金黄色葡萄球菌，大肠杆菌、痢疾杆菌，绿脓杆菌，肺炎双球菌等的生长繁殖. 但大黄对胃粘膜细胞功能代谢影响的研究尚少见报道. 我们的研究结果表明，大黄促进胃粘膜主细胞分泌胃蛋白酶和轻度增加胃粘膜细胞增殖作用，但对胃粘膜壁细胞分泌胃酸无影响. 结果显示，1%大黄浓度对胃蛋白酶和细胞增殖作用比0.1%和10%显著，特别是对胃蛋白酶作用更明显. 对胃粘膜细胞增殖作用，实验组中3种不同浓度cpm均值与对照组均无差异，但1%浓度组中培养d8,10,12时cpm显著高于对照组. 因此，大黄对胃功能的影响存在适宜剂量问题. 从我们研究结果的绝对数和统计资料显示1%大黄浓度对胃较适宜，有健胃作用. 这些结果与临床应用小剂量大黄健脾益胃，增进食欲，帮助消化等作用相符. 我们的体会，所谓小剂量大黄个体差异较大，一般3g～10g/次，原则上服用后大便稍软而不泻.
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4 参考文献
1 颜正华主编. 临床实用中药学. 北京：人民卫生出版社，1984：337-340
2 崔树德主编. 中药大全. 哈尔滨：黑龙江科学技术出版社，1989：177-181
3 张俊庭主编. 中国中医特治新法大全. 北京：中国中医药出版社，1996：144-145
4 上海市医学检验所. 临床生化检验(下册). 上海：上海科技出版社，1982：52-53
5 张俊庭主编. 中国中医药最新研创大全. 北京：中医古藉出版社，1996：2005-2006, 百拇医药(祝金泉 谢 勇 张 火昆和 黄德强 陈 江 王旭安 王崇文)