山东人群TTV感染状况及TTV山东株部分基因序列分析
1 中国人民解放军88医院传染科济南军区肝病研究所 山东省泰安市 271000
2 山东省泰安市中心医院传染科
3 山东省泰山医学院附属医院传染科
项目负责人 于建国中国人民解放军88医院传染科济南军区肝病研究所 山东省泰安市 271000
收稿日期 1999-07-14 接收日期 1999-11-28
Subject headings TTV virus, hepatitis C; hepatitis G; polymerase chain reaction; DNA sequence analysis
, http://www.100md.com
主题词 TTV病毒；丙型肝炎；庚型肝炎；聚合酶链反应；DNA序列分析
1997-10 Nishizawa et al[1]发表了第一篇关于人类肝炎相关DNA病毒基因，暂命名为输血传播病毒(transfusion transmitted virus, TTV)的论文，周育森et al[2]在国内首先测定了中国人TTV部分基因克隆序列. 迄今国内少数实验室也相继开展了TTV感染的分子流行病学、临床和实验研究. 初步研究结果表明，TTV感染同输血或血液制品密切相关，可能是导致肝功长期损害ALT异常又一重要致病因子. 为探讨山东地区TTV感染存在和基因变异的情况及TTV在人类肝炎中作用和地位. 我们以套式聚合酶链反应(nested-PCR)法，对输血后丙型肝炎和非甲～庚型肝炎患者进行TTV检测，并对部分病例进行序列分析，现将结果报告如下.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 血清标本57份来自本院与泰安市中心医院住院和门诊随访患者，系1996-09/1998-10临床与病理确诊的输血后丙型肝炎41例和非甲～庚型肝炎患者16例，其中健康普查ALT异常人群2例，慢性肾衰血液透析患者3例，ALT异常献血员5例，原因不明ALT异常慢性肝病患者6例. 男29例，女18例，年龄18岁～61岁. 诊断按1995年北京第五次全国传染病与寄生虫病会议修订的诊断标准. 空腹抽血5mL，离心分离血清，分装后置-30℃保存备用. 采血的同时进行流行病学调查.
1.2 方法 对所有标本均用套式-PCR方法检测TTVDNA. 标本DNA的提取方法及PCR方法，所用的引物均参见文献[3]. 引物序列分别为：P1：5＇-GACAGAGGAGAAGGCAACATGT-3＇；P2：5＇-CT/CTTACTACTACCTCCTGGCAT-3＇；P3：5＇-CATATACAGACATAAGTATCC-3＇；P4：5＇￣CTATGGTAATCGAGAGTAAGA￣3＇. 其中P1/P2为外引物，P3/P4为内引物. P1/P2为第1轮用引物，P3/P4为第2轮用引物，试剂购自军科院微生物流行病学研究所. 除检测TTVDNA外，同时应用实验室常规方法确定16例非甲～庚型肝炎均已排除甲～庚型肝炎病毒感染及EBV，CMV等引起肝炎. TTV部分基因的克隆及序列测定：选择2例TTVDNA阳性者，对PCR扩增的产物直接纯化，连接到PGEM-T载体上，转化XL1-Blue宿主菌. 经鉴定后提取质粒进行序列测定. 采用Sanger末端终止法用ABI377型自动序列分析方法. 用常规方法进行统计学分析. 将测定的序列用BLAST工具和军科院编制的GOLDKEY软件进行分析.
, 百拇医药
统计学处理 用常规方法进行统计学分析. 将测定的序列用Blast工具和军科院编制的GOLDKEY软件进行分析.
2 结果
2.1 TTVDNA的PCR检测结果 采用套式PCR法检测57份血清，TTVDNA阳性率为22.8%(13/57). 其中41份输血后丙型肝炎和16例非甲～庚型肝谆颊哐粜约斐雎史直鹞9.5%(8/41)和31.3%(5/16).
2.2 TTVDNA部分基因序列测定结果 经纯化后阳性PCR产物直接克隆T到载体，提取质粒进行双链测序. 测定2例阳性标本，从输血后丙型肝炎中分离到TTV山东第一株(TTVShan1)与日本株(AB008394)和中国第一株(TTVCHNO1)相比较核苷酸同源性均为94%，而从另一例非甲～非庚型肝炎患者中分离到的TTV山东第二株(TTVShan2)与日本株和中国第一株TTV同源性分别为91%和93%；山东TTV的两株间同源性均为91%(图1).
, 百拇医药
图1 TTV山东株(Shan1,2)与日本株和中国第一株序列比较结果.
3 讨论
TTV是近几年来继丙、戊和庚型肝炎病毒之后日本科学家运用代表性差异(Representational difference analysis)技术新近发现的一种单链无包膜DNA病毒，暂称为TTV. 由于现代分子生物学技术的快速发展，有关TTV的研究比过去对其他人类肝炎病毒研究速度快得多. 现已知道，TTV分布同HBV，HCV和HGV一样广泛，呈全球性分布[4]，它的生物特性很可能似HBV与HCV，即可能与急、慢性肝炎、暴发性肝炎，肝硬变和肝细胞癌有关，还可能造成慢性携带者，与肝功能持续性损伤ALT异常密切相关. 目前研究初步认为，TTV传播方式同HBV和HCV可能一样，临床上常有重叠感染，主要经输血或输血制品传播[5]. 本文检出阳性患者9例(69.2%)均有输血或输血制品史，另检出4例(30.8%)确无输血或输血制品史，说明在我国输血后丙型肝炎和非甲～庚型肝炎患者不仅存在TTV感染，而且在非甲～庚型肝炎患者中TTV感染率相当高，TTV感染除血源途径传播外，可能还存在生活密切接触非血源性传播途径，是导致高比例人群慢性携带该病毒的主要原因之一.
, 百拇医药
我们根据Okamoto et al[6]报道的TTV序列，选择保守区设计两对引物，采用RT-PCR法对山东地区41例输血后丙型肝炎和16例非甲～非庚型肝炎患者血清进行TTVDNA检测，其中41例输血后丙肝和16例非甲～非庚型肝炎阳性检出率分别为19.5%(8/14)和31.3%(5/16). 这41例输血后丙型肝炎均有输血或输血制品史，抗-HCV和HCVRNA均阳性，提示TTV不仅与HCV易发生重叠感染，也可能同HBV，HCV和HGV一样易发生重叠感染. 而16例非甲～非庚型肝炎阳性率为31.3%，高于北京而低于深圳两地区报道[3]的结果，提示在自然人群和ALT异常献血员、血液透析患者及原因不明ALT升高慢性肝病患者中均有较高TTV感染，表明TTV感染除同尚无输血或输血制品以外的途径传播如生活密切接触传播存在的可能性.
本文16例非甲～非庚型肝炎临床观察与甲、戊型肝炎不同，临床症状轻，2例(12.5%)有轻度黄疸，5例(31.3%)腹胀，13例(81.3%)化验单项ALT轻、中度升高，肝活检以汇管区炎症，淋巴细胞浸润为主，并可见脂肪性变的病理改变. TTV感染是否确切为导致非甲～非庚型肝炎主要病原，TTV是否在肝脏中复制，TTV的致病机制，是否和原因不明的慢性肝炎和肝硬变相关，仍待于更进一步研究证实.
, 百拇医药
为进一步确定PCR所扩增的基因片段的特异性，排除PCR假阳性所造成的污染，我们先后对2例PCR产物进行TTVDNA克隆和序列测定，结果TTV山东第一株与日本株和中国第一株TTV的核苷酸同源性均为94%；TTV山东第二株与日本株和中国第一株TTV的同源性序列分别为91%，提示TTV Shan1,和Shan2株和中国第一株(TTVCHNO1)与日本株(AB008394)可否能归属于一个亚型，但因目前国内外研究的资料较少，因此暂无法分析是否完全属于同一基因型. 本项研究结果为我国山东地区首次证实TTV感染及TTV分子流行病学部分核酸序列分析报道，这些初步研究的结果将为我国和山东地区病毒性肝炎的防治可提供一些重要参考资料.
4 参考文献
1 Nishizawa T, Okamoto H, Konishi K, Yoshizawa H, Miyakawa Y, Mayumi M. A novel DNA virus (TTV) associated with
, 百拇医药
elevated transaminase levels in posttransfusion hepatitis of unknown etiology. Biochem Biophys Res Commun,1997;241:92-97
2 周育森，何忠平，董京芳，王海涛. 中国人TTV部分基因克隆及序列测定. 军事医学科学院院刊，1998；22：81-83
3 周育森，董京度，周乙华，黄呈辉，何忠平，王海涛. 中国部分地区新型肝炎病毒TTV感染的分子流行病学. 中华预防医学杂志，1998；32：352-355
4 Naoumov NV, Petrova EP, Thomas MG, Williams R. Presence of a newly described human DNA virus (TTV) in patients with
, 百拇医药
liver disease. Lancet, 1998;352:195-197
5 马为民，周伯平，王火生，徐六妹，袁静，付涌水，孙彤. 一种新的可经输血传播病毒(TTV)的分子流行病学研究. 中华肝脏病杂志，1998；6：167-169
6 Okamoto H, Nishizawa T, Kato N, Ukita M, Ikeda H, Iizuka H, Miyakawa Y, Mayumi M. Molecular cloning and characterization of a
novel DNA virus (TTV) associated with posttransfusion hepatitis of unknown etiology. Hepatol Res, 1998;10:1-16, http://www.100md.com(于建国1 韩纪举1 肖德明2 尹燕明3 商庆华1 周秀梅1 杜庆苓1 张光曙1 )
2 山东省泰安市中心医院传染科
3 山东省泰山医学院附属医院传染科
项目负责人 于建国中国人民解放军88医院传染科济南军区肝病研究所 山东省泰安市 271000
收稿日期 1999-07-14 接收日期 1999-11-28
Subject headings TTV virus, hepatitis C; hepatitis G; polymerase chain reaction; DNA sequence analysis
, http://www.100md.com
主题词 TTV病毒；丙型肝炎；庚型肝炎；聚合酶链反应；DNA序列分析
1997-10 Nishizawa et al[1]发表了第一篇关于人类肝炎相关DNA病毒基因，暂命名为输血传播病毒(transfusion transmitted virus, TTV)的论文，周育森et al[2]在国内首先测定了中国人TTV部分基因克隆序列. 迄今国内少数实验室也相继开展了TTV感染的分子流行病学、临床和实验研究. 初步研究结果表明，TTV感染同输血或血液制品密切相关，可能是导致肝功长期损害ALT异常又一重要致病因子. 为探讨山东地区TTV感染存在和基因变异的情况及TTV在人类肝炎中作用和地位. 我们以套式聚合酶链反应(nested-PCR)法，对输血后丙型肝炎和非甲～庚型肝炎患者进行TTV检测，并对部分病例进行序列分析，现将结果报告如下.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 血清标本57份来自本院与泰安市中心医院住院和门诊随访患者，系1996-09/1998-10临床与病理确诊的输血后丙型肝炎41例和非甲～庚型肝炎患者16例，其中健康普查ALT异常人群2例，慢性肾衰血液透析患者3例，ALT异常献血员5例，原因不明ALT异常慢性肝病患者6例. 男29例，女18例，年龄18岁～61岁. 诊断按1995年北京第五次全国传染病与寄生虫病会议修订的诊断标准. 空腹抽血5mL，离心分离血清，分装后置-30℃保存备用. 采血的同时进行流行病学调查.
1.2 方法 对所有标本均用套式-PCR方法检测TTVDNA. 标本DNA的提取方法及PCR方法，所用的引物均参见文献[3]. 引物序列分别为：P1：5＇-GACAGAGGAGAAGGCAACATGT-3＇；P2：5＇-CT/CTTACTACTACCTCCTGGCAT-3＇；P3：5＇-CATATACAGACATAAGTATCC-3＇；P4：5＇￣CTATGGTAATCGAGAGTAAGA￣3＇. 其中P1/P2为外引物，P3/P4为内引物. P1/P2为第1轮用引物，P3/P4为第2轮用引物，试剂购自军科院微生物流行病学研究所. 除检测TTVDNA外，同时应用实验室常规方法确定16例非甲～庚型肝炎均已排除甲～庚型肝炎病毒感染及EBV，CMV等引起肝炎. TTV部分基因的克隆及序列测定：选择2例TTVDNA阳性者，对PCR扩增的产物直接纯化，连接到PGEM-T载体上，转化XL1-Blue宿主菌. 经鉴定后提取质粒进行序列测定. 采用Sanger末端终止法用ABI377型自动序列分析方法. 用常规方法进行统计学分析. 将测定的序列用BLAST工具和军科院编制的GOLDKEY软件进行分析.
, 百拇医药
统计学处理 用常规方法进行统计学分析. 将测定的序列用Blast工具和军科院编制的GOLDKEY软件进行分析.
2 结果
2.1 TTVDNA的PCR检测结果 采用套式PCR法检测57份血清，TTVDNA阳性率为22.8%(13/57). 其中41份输血后丙型肝炎和16例非甲～庚型肝谆颊哐粜约斐雎史直鹞9.5%(8/41)和31.3%(5/16).
2.2 TTVDNA部分基因序列测定结果 经纯化后阳性PCR产物直接克隆T到载体，提取质粒进行双链测序. 测定2例阳性标本，从输血后丙型肝炎中分离到TTV山东第一株(TTVShan1)与日本株(AB008394)和中国第一株(TTVCHNO1)相比较核苷酸同源性均为94%，而从另一例非甲～非庚型肝炎患者中分离到的TTV山东第二株(TTVShan2)与日本株和中国第一株TTV同源性分别为91%和93%；山东TTV的两株间同源性均为91%(图1).
, 百拇医药
图1 TTV山东株(Shan1,2)与日本株和中国第一株序列比较结果.
3 讨论
TTV是近几年来继丙、戊和庚型肝炎病毒之后日本科学家运用代表性差异(Representational difference analysis)技术新近发现的一种单链无包膜DNA病毒，暂称为TTV. 由于现代分子生物学技术的快速发展，有关TTV的研究比过去对其他人类肝炎病毒研究速度快得多. 现已知道，TTV分布同HBV，HCV和HGV一样广泛，呈全球性分布[4]，它的生物特性很可能似HBV与HCV，即可能与急、慢性肝炎、暴发性肝炎，肝硬变和肝细胞癌有关，还可能造成慢性携带者，与肝功能持续性损伤ALT异常密切相关. 目前研究初步认为，TTV传播方式同HBV和HCV可能一样，临床上常有重叠感染，主要经输血或输血制品传播[5]. 本文检出阳性患者9例(69.2%)均有输血或输血制品史，另检出4例(30.8%)确无输血或输血制品史，说明在我国输血后丙型肝炎和非甲～庚型肝炎患者不仅存在TTV感染，而且在非甲～庚型肝炎患者中TTV感染率相当高，TTV感染除血源途径传播外，可能还存在生活密切接触非血源性传播途径，是导致高比例人群慢性携带该病毒的主要原因之一.
, 百拇医药
我们根据Okamoto et al[6]报道的TTV序列，选择保守区设计两对引物，采用RT-PCR法对山东地区41例输血后丙型肝炎和16例非甲～非庚型肝炎患者血清进行TTVDNA检测，其中41例输血后丙肝和16例非甲～非庚型肝炎阳性检出率分别为19.5%(8/14)和31.3%(5/16). 这41例输血后丙型肝炎均有输血或输血制品史，抗-HCV和HCVRNA均阳性，提示TTV不仅与HCV易发生重叠感染，也可能同HBV，HCV和HGV一样易发生重叠感染. 而16例非甲～非庚型肝炎阳性率为31.3%，高于北京而低于深圳两地区报道[3]的结果，提示在自然人群和ALT异常献血员、血液透析患者及原因不明ALT升高慢性肝病患者中均有较高TTV感染，表明TTV感染除同尚无输血或输血制品以外的途径传播如生活密切接触传播存在的可能性.
本文16例非甲～非庚型肝炎临床观察与甲、戊型肝炎不同，临床症状轻，2例(12.5%)有轻度黄疸，5例(31.3%)腹胀，13例(81.3%)化验单项ALT轻、中度升高，肝活检以汇管区炎症，淋巴细胞浸润为主，并可见脂肪性变的病理改变. TTV感染是否确切为导致非甲～非庚型肝炎主要病原，TTV是否在肝脏中复制，TTV的致病机制，是否和原因不明的慢性肝炎和肝硬变相关，仍待于更进一步研究证实.
, 百拇医药
为进一步确定PCR所扩增的基因片段的特异性，排除PCR假阳性所造成的污染，我们先后对2例PCR产物进行TTVDNA克隆和序列测定，结果TTV山东第一株与日本株和中国第一株TTV的核苷酸同源性均为94%；TTV山东第二株与日本株和中国第一株TTV的同源性序列分别为91%，提示TTV Shan1,和Shan2株和中国第一株(TTVCHNO1)与日本株(AB008394)可否能归属于一个亚型，但因目前国内外研究的资料较少，因此暂无法分析是否完全属于同一基因型. 本项研究结果为我国山东地区首次证实TTV感染及TTV分子流行病学部分核酸序列分析报道，这些初步研究的结果将为我国和山东地区病毒性肝炎的防治可提供一些重要参考资料.
4 参考文献
1 Nishizawa T, Okamoto H, Konishi K, Yoshizawa H, Miyakawa Y, Mayumi M. A novel DNA virus (TTV) associated with
, 百拇医药
elevated transaminase levels in posttransfusion hepatitis of unknown etiology. Biochem Biophys Res Commun,1997;241:92-97
2 周育森，何忠平，董京芳，王海涛. 中国人TTV部分基因克隆及序列测定. 军事医学科学院院刊，1998；22：81-83
3 周育森，董京度，周乙华，黄呈辉，何忠平，王海涛. 中国部分地区新型肝炎病毒TTV感染的分子流行病学. 中华预防医学杂志，1998；32：352-355
4 Naoumov NV, Petrova EP, Thomas MG, Williams R. Presence of a newly described human DNA virus (TTV) in patients with
, 百拇医药
liver disease. Lancet, 1998;352:195-197
5 马为民，周伯平，王火生，徐六妹，袁静，付涌水，孙彤. 一种新的可经输血传播病毒(TTV)的分子流行病学研究. 中华肝脏病杂志，1998；6：167-169
6 Okamoto H, Nishizawa T, Kato N, Ukita M, Ikeda H, Iizuka H, Miyakawa Y, Mayumi M. Molecular cloning and characterization of a
novel DNA virus (TTV) associated with posttransfusion hepatitis of unknown etiology. Hepatol Res, 1998;10:1-16, http://www.100md.com(于建国1 韩纪举1 肖德明2 尹燕明3 商庆华1 周秀梅1 杜庆苓1 张光曙1 )