霍乱毒素及大肠杆菌不耐热肠毒素生物学特性的研究
1 中国人民解放军266医院检验科
2 中国人民解放军第三军医大学临床微生物教研室 重庆市 400038
项目负责人 郭学青中国人民解放军266医院检验科
收稿日期 1999-12-08 接收日期 2000-01-11
Subject headings cholera toxin; Escherichia coli; enterotoxin; immunogenicity
主题词 霍乱毒素；大肠杆菌；肠毒素；免疫原性
霍乱毒素(cholera toxin, CT)和大肠杆菌不耐热肠毒素(heat-labile enterotoxin, LT)随着传染病和流行病学的发展得以关注，近年由于疫苗的进展再次得到重视. 它们是细菌蛋白毒素家族成员，通过G蛋白的ADP-核糖基化而发挥其毒性[1]. 两者关系密切，氨基酸序列同源性约80%，均包括一个240个残基的A链和5个103个残基的B亚单位[2]，即AB5六聚体. B五聚体与GM1神经节苷脂受体结合，决定毒素对宿主细胞的选择亲和性. A亚单位有使上皮细胞G蛋白Gsα的一个精氨酸残基ADP-核糖基化的活性. 两者具有较强的粘膜免疫原性和粘膜免疫佐剂效应. 了解其结构、粘膜免疫机制，对于粘膜疫苗的发展有重要指导意义.
1 毒素结构、合成及作用机制
两种毒素均是A亚单位起生物学活性作用，分为A1和A2两个组成，A1是毒素的毒性部分，A2与B亚单位结合在一起. A1与A2间有二硫键联结. LT的Mr 88000，其中A1 22000，A2 5500，B亚单位11800，CT Mr 85000, 其中A1 22000，A2 5500，B亚单位11600. Ingeborg et al[2]研究了A链47～56环(loop)的作用. LT和CT的此环氨基酸序列相近，只是55位LT为酪氨酸，CT为组氨酸[3]. 使50位苏氨酸和53位缬氨酸分别被甘氨酸和脯氨酸代替，通过改变其空间构象可增加或减少这个环活动位点的动力. 结果表明所有突变体细胞毒性均比野生型降低，提示47～56环在LT和CT的毒性方面有显著作用. 它可以改变其空间构象与底物NAD和Gsα直接相连而引起一系列生物效应.
毒素合成A，B亚单位的前体后，穿过细胞膜以成熟的亚单位进入胞周质中，B亚单位聚合成五聚体，与A亚单位结合形成AB5全毒素. 霍乱弧苗存在一个毒素分泌装置(toxin secretory apparatus, TSA)使B五聚体或全毒素可穿过细胞外膜进入培养液中[4]. B亚单位与小肠粘膜GM1神经节苷脂受体结合，使毒素分子变构，A亚单位脱离B亚单位进入细胞膜. 随着二硫键降解，A1肽链活化，与其靶蛋白Gsα结合，Gsα与GTP结合被活化，Gsα：GTP复合体作用于腺苷酸环化酶，使细胞内ATP转变为cAMP. 平时，Gsα由于自身的GTP酶活性而以非活性形式存在，GTP水解为GDP，Gsα不再作用于腺苷酸环化酶. CT和LT使Gsα ADP-核糖基化，破坏了GTP酶活性，导致Gsα：GTP不停地作用于腺苷酸环化酶. 胞内cAMP浓度明显增加后，促使肠粘膜细胞的分泌功能增强，结果肠液大量分泌，引起严重的腹泻和呕吐. 致使体内水分和电解质大量丧失，临床上呈现严重脱水，外周循环衰竭，代谢性酸中毒，甚至休克、死亡.
LT与CT在免疫学、结构及功能上相近，然而有几处明显不同[4]：① CT的A亚单位被蛋白水解酶活化为一个缺口(nick),分为两个单位A1和A2，由半胱氨酸桥结，LT的A亚单位没有缺口，A1与A2各有一个半胱氨酸残基，由二硫键连结. 编码LT的重组质粒在霍乱弧菌表达可使LT分泌在培养液中，而分泌的LT的A亚单位是没有缺口的，说明缺口与毒素分泌无关联，毒素分泌与蛋白水解酶及分泌装置有关. ② LT的B亚单位可与糖蛋白受体或GM1神经节苷脂受体结合. ③ CT由霍乱弧菌分泌，LT则存在于大肠杆菌的胞周质中.
2 毒素的免疫原性
LT和CT的免疫反应分析显示大部分毒素中和抗体是针对B亚单位的[5,6]，但也有针对A亚单位的[7]. 一些实验者[6,8]证明通过局部免疫，全身或粘膜的抗LTB反应需要有LTA的存在. De Haan et al重组了一种带有组氨酸尾的LTA-LTA(His)10，并检测了它滴鼻后的免疫原性. 发现LTA(His)10 不能介导抗原特异性的抗体，而野生型LT或LT-E112K(Glu-112→lys)能明显诱导针对LTA的特异抗血清和粘膜抗体. 这提示A亚单位仅在全毒素中有免疫原性. De Haan et al[9]实验表明虽然LTA链在全身的抗-LTB反应有效产生中很重要，但LTA的ADP核糖基酶活性与毒素的致免疫反应间没有直接联系. 因为没有ADP核糖基活性的LT突变体通过鼻腔免疫小鼠仍然保留野生型毒素的致免疫特性，即突变体产生的血清IgG和IgA反应与粘膜S-IgA水平与野生型LT免疫小鼠后产生的水平相近. 虽然LTA的ADP核糖基酶活性在LT的免疫原反应中不占重要地位，但重组LTB单独使用比缺乏ADP-核糖基化活性的LT突变体的免疫原性弱，另外LT全毒素产生高水平的全身的IgG和粘膜S-IgA反应，包括肺、肠及泌尿系统等远端粘膜S-IgA反应，而等量LTB仅产生低水平的IgG反应，LT比LTB的免疫原性强，说明LTA起重要作用. LTA链刺激粘膜相关B细胞的同型转换，同时LTA参与粘膜免疫系统的初始阶段，使定型的IgA B细胞从产生部位迁移到远端效应位点[6].
LTB与GM1结合参与免疫反应. De Haan et al通过构建不具有GM1结合能力的B亚单位33位甘氨酸突变为天冬氨酸的突变体LT-G33D，LTB-G33D，通过鼻腔免疫小鼠，观察LT和LTB的免疫原性，发现与GM1结合是抗LTB抗体有效产生所必需的，在LT的免疫原性反应中起关键作用.
Nashar et al[10]发现LTB-G33D用皮下或口服途径免疫小鼠时没有免疫原性，而鼻饲免疫时有免疫原性，这表明在免疫原反应中免疫途径也很重要. CT与CTB均是强的免疫原，很大程度上决定于它们与肠粘膜表面受体的结合能力[11]，但CTB的免疫原性比全毒素CT弱[12].
3 毒素的粘膜佐剂活性
CT及LT的佐剂功能中A，B亚单位有不同的机制. Jobling et al[13]最早系统研究CTB的GM1结合特性. 发现33位的甘氨酸被天冬氨酸、谷氨酸或亮氨酸替代，CTB完全丧失与GM1的结合性，与Nashar[10]及Guidry et al[14]及De Haan et al[15]的实验结果一致.
为研究GM1结合能力在LT佐剂中的作用，De Haan et al用LT-G33D作为佐剂与流感亚单位抗原共同免疫小鼠. 发现它也具有与野生型LT一样的辅佐活性，因而他们认为与GM1结合的亲和力对LT的辅佐性不是必需的[13]. 由于LT-G33D为弱免疫原，结果提示LT的免疫原性与辅佐性之间没有必然联系. Guidry的实验显示LT-G33D缺乏对口服卵清蛋白(OVA)的辅佐性. 两者对比分析：①为给药途径不同，分别为口服及鼻饲. ②所用抗原类型及抗原对粘膜的亲和力不同，分别为流感亚单位抗原和OVA. De Haan et al又发现LT-G33D对匙孔血蓝蛋白(KLH)有辅佐性，而KLH对粘膜没有特异的结合特性，与OVA一样也是弱粘膜免疫原，这说明抗原与粘膜的亲和性在LT和LT突变体的免疫刺激中不起决定作用[16]，免疫途径很重要，鼻腔免疫是最有效的免疫途径[17]. 但我们不能排除LT-G33D与另外不同受体如非神经节苷脂受体或糖蛋白受体结合后起佐剂作用.
De Haan et al发现LT-G33D产生特异性亚单位抗原的IgG及粘膜S-IgA反应. 更重要的是，这个免疫反应不需LTA的ADP-核糖基酶活性. 因为缺乏ADP-核糖基酶活性和GM1结合力的LT突变体均存在辅佐性. 这些结果表示LT的辅佐性既不依赖于GM1结合力也不依赖于ADP-核糖基活性. LT全毒素(2.9μg)单独免疫或LTB中加入微量LT全毒素(2μg LTB+50ng LT)免疫小鼠，在远端粘膜组织包括肺、肠及泌尿生殖系统均产生S-IgA，而单独的LTB免疫则没有此作用，提示LTB和LT有协同作用[6]. 对感染猫胃螺杆菌(H. felis, Hf)的小鼠口服免疫，重组CTB不是有效的粘膜佐剂[18]，但CTB与BSA口服或鼻饲时，均产生IgG及IgA反应，鼻饲免疫时，抗体效价更高[19]. 这提示不同剂量的佐剂与不同抗原通过不同途径免疫动物，效果不一样.
4 免疫耐受
疫苗免疫机体的理想方法是口服免疫，口服免疫不但使受抗原刺激的粘膜部位产生免疫应答，还能在远处甚至全身诱导出免疫应答. 然而，大多数可溶性蛋白抗原口服免疫，其免疫原性低，而且常诱生免疫耐受. CT具有较强的粘膜免疫原性和佐剂作用，口服μg量CT，显著诱生S-IgA和IgG，并且诱生口服耐受性，但CT与其他不相关蛋白同时口服免疫，能消除机体对这些其免疫蛋白的耐受，也能诱导出针对CT和共免疫蛋白的长期免疫记忆. OVA+CT口服免疫后，能诱生小鼠发生超敏反应. 若将CT换CTB，可避免发生超敏反应. 然而某些抗原与CTB同时口服，可诱生低剂量口服耐受[20].
OVA+LT共同免疫，防止了对OVA的耐受产生，抗OVA IgA比OVA或PBS单独使用高30和90倍，此作用提示是LT的A亚单位酶活性作用的结果，因为单独的B亚单位不能产生耐受. 当动物在初次服用OVA后再服用OVA+LT时，血清抗OVAIgG和粘膜抗OVA S-IgA水平均明显降低，同时不能消除机体已经建立的免疫耐受. 动物对LT的血清IgG和粘膜IgA反应只在初次与抗原共同用药时起作用. 三次OVA/LT后反应趋向平稳，表明呈递反应只发生在早期和初次暴露给抗原[21].
5 参考文献
1 Burnette WN. AB5 ADP-ribosylating toxin: comparative anatomy and physiology. Structure, 1994;2:151-158
2 Ingborg KF, Raghava R, lolke de Haan, Ethan AM, Focco A, Daniel RS, Wilm GJH. Protein engineering studies of A-chain loop 47-56
of Escherichia coli heat-labile enterotoxin point to a prominent role of this loop for cytotoxicity. Mol Microbiol,
1996;20:823-832
3 Dykes CW, Haliday IJ, Harford S, Read MJ, Hobden AN. A comparison of the nucleotide sequence of the A subuit of
heat-labile enterotoxin and choleratoxin. FEMS Microbiol, 1985;26:171-174
4 Timothy RH, Joaquin S, James B. Mechanism of toxin secretion by Vibrio cholerae investigated in strains harboring plasmids
that encode heat-labile enterotoxins of Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci USA, 1984;81:7752-7756
5 Peterson A, Hejtmancik DE, Markel DE, Craig JP, Kutosky A. Antigenic specificity of neutralizing antibody to cholera toxin.
Infect Immun, 1979;24:774-781
6 DeHann L, Verweij WR, Holtrop M, Agsteribbe E, Wilschut J. Mucosal immunogenicity of the Escherichia coli
heat-labile enterotoxin: role of the A subunit. Vaccine, 1996;(4):260-266
7 Pizza M, Fontana MR, Giuliani MM. A genetically detoxified of heat-labile enterotoxin induces neutrulizing antibodies against the
A subunit. J Exp Med, 1994;180:2147-2153
8 Wilson, AD, Clarke, CJ, Stokes CR. Whole cholera toxin and B subunit act synergistically as an adjuvant for the mucosal
immune response of mice to keyhole limpet haemocyanin. Scand J Immunol, 1990;31:443-451
9 De Haan L, Verweij WR, Feil IK, Lijnema TH, Hol WGJ, Agsteribbe E, Wilschut J. Mutants of the Escherichia coli
heat-labile enterotoxin with reduced ADP-ribosylation activity or no activity retain the immunogenic properties of the
native holotoxin. Infect Immun, 1996;64:5413-5416
10 Nashar TO, Webb HM, Eaglestone S, Williams NAM, Hirst TR. Potent immunogenicity of the B subunits of Escherichia
coli heat-labile entertotoxin: receptor binding is essential and induces differential modulation of lymphocyte subsets.
Proc Natl Acad Sci USA, 1996;93:226-238
11 Lebens M, Holmgren J. Mucosal vaccines based on the use of cholera toxin B subunit as immunogen and antigen carrier.
Dev Biol Stand, 1994;82:215-227
12 Wilson AD, Robinson A, Irons L, Stokes CR. Adjuvant action of cholera toxin and pertussis toxin in the induction of IgA
antibody response to orally administered antigen. Vaccine, 1993;11:113-118
13 Jobing MG, Holmes RK. Analysis of stucture and function of the B subunit of cholera toxin by the use of site-directed
mutagenesis. Mol Microbiol, 1991;5:1755
14 Guidry JJ, Cardenas L, Cheng E, Clements JD. Role of recptor binding in toxicity, immunogenicity, and adjuvanticity of
Escherichia coli heat-labile enterotoxin. Infect Immun, 1997;65:4943-4950
15 De Hann L, Verweij WR, Feil IK, Holtrop M, Hol WGJ, Agsteribbe E, Wilschut J. Role of GM1 binding in the mucosal
immunogenicity and adjuvant activity of the Escherichia coli heat-labile enterotoxin and its B subunit.
Immunology, 1998;94:424-430
16 De Haan L, Feil IK, Verweij WR, Hol WGJ, Agsteribbe E, Wilschut J. Mutational analysis of the role of ADP-ribosylation activity
and GM1-binding activity in the adjuvant properties of the Escherichia coli heat-labile enterotoxin towards
intranasally administered keyhole limpet hemocyanin. Eur J Immunol, 1998;28:1243-1250
17 Di Tommaso A, Saletti G, Pizza M. Induction of antigen-specific antibodies in vaginal secretions by using a nontoxic mutant
of heat-labile enterotoxin as a mucosal adjuvant. Infect Immun, 1996;64:974-979
18 Blanchard TG, Lycke N, Czinn SJ, Martin Bol, Williams M. Recombinant cholera toxin B subunit is not an effective mucosal adjuvant
for oral immunization of mice against Helicobacter felis. Immunology, 1998;94:22-27
19 Tochikubo K, Isaka M, Yasuda Y, Hsanuma H, Tomita T, Tamura SI. Recombinant cholera toxin B subunit acts as an adjuvant for
the mucosal and systemic responses of mice to mucosally co-admicnistered bovine serum albumin. Vaccine, 1998;16:150-155
20 彭良平. 霍乱毒素的粘膜免疫佐剂效应机理. 国外医学预防、诊断、治疗用生物制品分册, 1997;20:203
21 Clements JD, Hartzog NM, Lyon FL. Adjuvant activity of Escherichia coli heat-labile enterotoxin and effect on the induction of
oral tolerance in mice to unrelated protein antigens. Vaccine, 1988;6:269-277, http://www.100md.com(郭学青1,2 邹全明2)
2 中国人民解放军第三军医大学临床微生物教研室 重庆市 400038
项目负责人 郭学青中国人民解放军266医院检验科
收稿日期 1999-12-08 接收日期 2000-01-11
Subject headings cholera toxin; Escherichia coli; enterotoxin; immunogenicity
主题词 霍乱毒素；大肠杆菌；肠毒素；免疫原性
霍乱毒素(cholera toxin, CT)和大肠杆菌不耐热肠毒素(heat-labile enterotoxin, LT)随着传染病和流行病学的发展得以关注，近年由于疫苗的进展再次得到重视. 它们是细菌蛋白毒素家族成员，通过G蛋白的ADP-核糖基化而发挥其毒性[1]. 两者关系密切，氨基酸序列同源性约80%，均包括一个240个残基的A链和5个103个残基的B亚单位[2]，即AB5六聚体. B五聚体与GM1神经节苷脂受体结合，决定毒素对宿主细胞的选择亲和性. A亚单位有使上皮细胞G蛋白Gsα的一个精氨酸残基ADP-核糖基化的活性. 两者具有较强的粘膜免疫原性和粘膜免疫佐剂效应. 了解其结构、粘膜免疫机制，对于粘膜疫苗的发展有重要指导意义.
1 毒素结构、合成及作用机制
两种毒素均是A亚单位起生物学活性作用，分为A1和A2两个组成，A1是毒素的毒性部分，A2与B亚单位结合在一起. A1与A2间有二硫键联结. LT的Mr 88000，其中A1 22000，A2 5500，B亚单位11800，CT Mr 85000, 其中A1 22000，A2 5500，B亚单位11600. Ingeborg et al[2]研究了A链47～56环(loop)的作用. LT和CT的此环氨基酸序列相近，只是55位LT为酪氨酸，CT为组氨酸[3]. 使50位苏氨酸和53位缬氨酸分别被甘氨酸和脯氨酸代替，通过改变其空间构象可增加或减少这个环活动位点的动力. 结果表明所有突变体细胞毒性均比野生型降低，提示47～56环在LT和CT的毒性方面有显著作用. 它可以改变其空间构象与底物NAD和Gsα直接相连而引起一系列生物效应.
毒素合成A，B亚单位的前体后，穿过细胞膜以成熟的亚单位进入胞周质中，B亚单位聚合成五聚体，与A亚单位结合形成AB5全毒素. 霍乱弧苗存在一个毒素分泌装置(toxin secretory apparatus, TSA)使B五聚体或全毒素可穿过细胞外膜进入培养液中[4]. B亚单位与小肠粘膜GM1神经节苷脂受体结合，使毒素分子变构，A亚单位脱离B亚单位进入细胞膜. 随着二硫键降解，A1肽链活化，与其靶蛋白Gsα结合，Gsα与GTP结合被活化，Gsα：GTP复合体作用于腺苷酸环化酶，使细胞内ATP转变为cAMP. 平时，Gsα由于自身的GTP酶活性而以非活性形式存在，GTP水解为GDP，Gsα不再作用于腺苷酸环化酶. CT和LT使Gsα ADP-核糖基化，破坏了GTP酶活性，导致Gsα：GTP不停地作用于腺苷酸环化酶. 胞内cAMP浓度明显增加后，促使肠粘膜细胞的分泌功能增强，结果肠液大量分泌，引起严重的腹泻和呕吐. 致使体内水分和电解质大量丧失，临床上呈现严重脱水，外周循环衰竭，代谢性酸中毒，甚至休克、死亡.
LT与CT在免疫学、结构及功能上相近，然而有几处明显不同[4]：① CT的A亚单位被蛋白水解酶活化为一个缺口(nick),分为两个单位A1和A2，由半胱氨酸桥结，LT的A亚单位没有缺口，A1与A2各有一个半胱氨酸残基，由二硫键连结. 编码LT的重组质粒在霍乱弧菌表达可使LT分泌在培养液中，而分泌的LT的A亚单位是没有缺口的，说明缺口与毒素分泌无关联，毒素分泌与蛋白水解酶及分泌装置有关. ② LT的B亚单位可与糖蛋白受体或GM1神经节苷脂受体结合. ③ CT由霍乱弧菌分泌，LT则存在于大肠杆菌的胞周质中.
2 毒素的免疫原性
LT和CT的免疫反应分析显示大部分毒素中和抗体是针对B亚单位的[5,6]，但也有针对A亚单位的[7]. 一些实验者[6,8]证明通过局部免疫，全身或粘膜的抗LTB反应需要有LTA的存在. De Haan et al重组了一种带有组氨酸尾的LTA-LTA(His)10，并检测了它滴鼻后的免疫原性. 发现LTA(His)10 不能介导抗原特异性的抗体，而野生型LT或LT-E112K(Glu-112→lys)能明显诱导针对LTA的特异抗血清和粘膜抗体. 这提示A亚单位仅在全毒素中有免疫原性. De Haan et al[9]实验表明虽然LTA链在全身的抗-LTB反应有效产生中很重要，但LTA的ADP核糖基酶活性与毒素的致免疫反应间没有直接联系. 因为没有ADP核糖基活性的LT突变体通过鼻腔免疫小鼠仍然保留野生型毒素的致免疫特性，即突变体产生的血清IgG和IgA反应与粘膜S-IgA水平与野生型LT免疫小鼠后产生的水平相近. 虽然LTA的ADP核糖基酶活性在LT的免疫原反应中不占重要地位，但重组LTB单独使用比缺乏ADP-核糖基化活性的LT突变体的免疫原性弱，另外LT全毒素产生高水平的全身的IgG和粘膜S-IgA反应，包括肺、肠及泌尿系统等远端粘膜S-IgA反应，而等量LTB仅产生低水平的IgG反应，LT比LTB的免疫原性强，说明LTA起重要作用. LTA链刺激粘膜相关B细胞的同型转换，同时LTA参与粘膜免疫系统的初始阶段，使定型的IgA B细胞从产生部位迁移到远端效应位点[6].
LTB与GM1结合参与免疫反应. De Haan et al通过构建不具有GM1结合能力的B亚单位33位甘氨酸突变为天冬氨酸的突变体LT-G33D，LTB-G33D，通过鼻腔免疫小鼠，观察LT和LTB的免疫原性，发现与GM1结合是抗LTB抗体有效产生所必需的，在LT的免疫原性反应中起关键作用.
Nashar et al[10]发现LTB-G33D用皮下或口服途径免疫小鼠时没有免疫原性，而鼻饲免疫时有免疫原性，这表明在免疫原反应中免疫途径也很重要. CT与CTB均是强的免疫原，很大程度上决定于它们与肠粘膜表面受体的结合能力[11]，但CTB的免疫原性比全毒素CT弱[12].
3 毒素的粘膜佐剂活性
CT及LT的佐剂功能中A，B亚单位有不同的机制. Jobling et al[13]最早系统研究CTB的GM1结合特性. 发现33位的甘氨酸被天冬氨酸、谷氨酸或亮氨酸替代，CTB完全丧失与GM1的结合性，与Nashar[10]及Guidry et al[14]及De Haan et al[15]的实验结果一致.
为研究GM1结合能力在LT佐剂中的作用，De Haan et al用LT-G33D作为佐剂与流感亚单位抗原共同免疫小鼠. 发现它也具有与野生型LT一样的辅佐活性，因而他们认为与GM1结合的亲和力对LT的辅佐性不是必需的[13]. 由于LT-G33D为弱免疫原，结果提示LT的免疫原性与辅佐性之间没有必然联系. Guidry的实验显示LT-G33D缺乏对口服卵清蛋白(OVA)的辅佐性. 两者对比分析：①为给药途径不同，分别为口服及鼻饲. ②所用抗原类型及抗原对粘膜的亲和力不同，分别为流感亚单位抗原和OVA. De Haan et al又发现LT-G33D对匙孔血蓝蛋白(KLH)有辅佐性，而KLH对粘膜没有特异的结合特性，与OVA一样也是弱粘膜免疫原，这说明抗原与粘膜的亲和性在LT和LT突变体的免疫刺激中不起决定作用[16]，免疫途径很重要，鼻腔免疫是最有效的免疫途径[17]. 但我们不能排除LT-G33D与另外不同受体如非神经节苷脂受体或糖蛋白受体结合后起佐剂作用.
De Haan et al发现LT-G33D产生特异性亚单位抗原的IgG及粘膜S-IgA反应. 更重要的是，这个免疫反应不需LTA的ADP-核糖基酶活性. 因为缺乏ADP-核糖基酶活性和GM1结合力的LT突变体均存在辅佐性. 这些结果表示LT的辅佐性既不依赖于GM1结合力也不依赖于ADP-核糖基活性. LT全毒素(2.9μg)单独免疫或LTB中加入微量LT全毒素(2μg LTB+50ng LT)免疫小鼠，在远端粘膜组织包括肺、肠及泌尿生殖系统均产生S-IgA，而单独的LTB免疫则没有此作用，提示LTB和LT有协同作用[6]. 对感染猫胃螺杆菌(H. felis, Hf)的小鼠口服免疫，重组CTB不是有效的粘膜佐剂[18]，但CTB与BSA口服或鼻饲时，均产生IgG及IgA反应，鼻饲免疫时，抗体效价更高[19]. 这提示不同剂量的佐剂与不同抗原通过不同途径免疫动物，效果不一样.
4 免疫耐受
疫苗免疫机体的理想方法是口服免疫，口服免疫不但使受抗原刺激的粘膜部位产生免疫应答，还能在远处甚至全身诱导出免疫应答. 然而，大多数可溶性蛋白抗原口服免疫，其免疫原性低，而且常诱生免疫耐受. CT具有较强的粘膜免疫原性和佐剂作用，口服μg量CT，显著诱生S-IgA和IgG，并且诱生口服耐受性，但CT与其他不相关蛋白同时口服免疫，能消除机体对这些其免疫蛋白的耐受，也能诱导出针对CT和共免疫蛋白的长期免疫记忆. OVA+CT口服免疫后，能诱生小鼠发生超敏反应. 若将CT换CTB，可避免发生超敏反应. 然而某些抗原与CTB同时口服，可诱生低剂量口服耐受[20].
OVA+LT共同免疫，防止了对OVA的耐受产生，抗OVA IgA比OVA或PBS单独使用高30和90倍，此作用提示是LT的A亚单位酶活性作用的结果，因为单独的B亚单位不能产生耐受. 当动物在初次服用OVA后再服用OVA+LT时，血清抗OVAIgG和粘膜抗OVA S-IgA水平均明显降低，同时不能消除机体已经建立的免疫耐受. 动物对LT的血清IgG和粘膜IgA反应只在初次与抗原共同用药时起作用. 三次OVA/LT后反应趋向平稳，表明呈递反应只发生在早期和初次暴露给抗原[21].
5 参考文献
1 Burnette WN. AB5 ADP-ribosylating toxin: comparative anatomy and physiology. Structure, 1994;2:151-158
2 Ingborg KF, Raghava R, lolke de Haan, Ethan AM, Focco A, Daniel RS, Wilm GJH. Protein engineering studies of A-chain loop 47-56
of Escherichia coli heat-labile enterotoxin point to a prominent role of this loop for cytotoxicity. Mol Microbiol,
1996;20:823-832
3 Dykes CW, Haliday IJ, Harford S, Read MJ, Hobden AN. A comparison of the nucleotide sequence of the A subuit of
heat-labile enterotoxin and choleratoxin. FEMS Microbiol, 1985;26:171-174
4 Timothy RH, Joaquin S, James B. Mechanism of toxin secretion by Vibrio cholerae investigated in strains harboring plasmids
that encode heat-labile enterotoxins of Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci USA, 1984;81:7752-7756
5 Peterson A, Hejtmancik DE, Markel DE, Craig JP, Kutosky A. Antigenic specificity of neutralizing antibody to cholera toxin.
Infect Immun, 1979;24:774-781
6 DeHann L, Verweij WR, Holtrop M, Agsteribbe E, Wilschut J. Mucosal immunogenicity of the Escherichia coli
heat-labile enterotoxin: role of the A subunit. Vaccine, 1996;(4):260-266
7 Pizza M, Fontana MR, Giuliani MM. A genetically detoxified of heat-labile enterotoxin induces neutrulizing antibodies against the
A subunit. J Exp Med, 1994;180:2147-2153
8 Wilson, AD, Clarke, CJ, Stokes CR. Whole cholera toxin and B subunit act synergistically as an adjuvant for the mucosal
immune response of mice to keyhole limpet haemocyanin. Scand J Immunol, 1990;31:443-451
9 De Haan L, Verweij WR, Feil IK, Lijnema TH, Hol WGJ, Agsteribbe E, Wilschut J. Mutants of the Escherichia coli
heat-labile enterotoxin with reduced ADP-ribosylation activity or no activity retain the immunogenic properties of the
native holotoxin. Infect Immun, 1996;64:5413-5416
10 Nashar TO, Webb HM, Eaglestone S, Williams NAM, Hirst TR. Potent immunogenicity of the B subunits of Escherichia
coli heat-labile entertotoxin: receptor binding is essential and induces differential modulation of lymphocyte subsets.
Proc Natl Acad Sci USA, 1996;93:226-238
11 Lebens M, Holmgren J. Mucosal vaccines based on the use of cholera toxin B subunit as immunogen and antigen carrier.
Dev Biol Stand, 1994;82:215-227
12 Wilson AD, Robinson A, Irons L, Stokes CR. Adjuvant action of cholera toxin and pertussis toxin in the induction of IgA
antibody response to orally administered antigen. Vaccine, 1993;11:113-118
13 Jobing MG, Holmes RK. Analysis of stucture and function of the B subunit of cholera toxin by the use of site-directed
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