缺氧对肝星状细胞产生胶原及胶原降解酶的影响
上海医科大学病理教研室 上海市 200032
高校博士点基金资助,No.9837
项目负责人 陈平圣 翟为溶，200032，上海市医学院路138号.
收稿日期 1999-11-29 接收日期 1999-12-19
Subject headings hypoxia; hepatic stellate cell; matrix metalloproteinase; collagen
主题词 缺氧；肝星状细胞；基质金属蛋白酶；胶原
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陈平圣,翟为溶,张月娥,张锦生. 缺氧对肝星状细胞产生胶原及胶原降解酶的影响. 世界华人消化杂志，2000；8(5)：586-587
多种致病因子长期作用均可致肝纤维化，其形成是细胞外基质(extracellular matrix, ECM)产生和降解不平衡的结果[1]. 星状细胞(hepatic stellate cell, HSC)活化是肝纤维化发生的中心环节[2]. 缺氧是最常见的致病或伴随因素之一，其对HSC产生胶原及胶原降解酶有何影响尚不清楚. 作者对原代HSC行缺氧培养，用ELISA方法测培养上清中基质金属蛋白酶1,2(MMP-1,MMP-2)、Ⅳ型胶原(collagenase Ⅳ, Col Ⅳ)及Ⅲ型前胶原氨基端肽(PⅢP)相对含量. 结果报道如下.
1 材料和方法
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1.1 材料 Ⅳ型胶原酶、Pronase E，Nycodenz，DMEM培养基、DMEM/F12(v/v=1/1)无血清培养基为Sigma产品；MMP-1单克隆抗体为CALBIOCHEM产品；PⅢP单克隆抗体由Dr.Punter馈赠；ColⅣ多克隆抗体由本室自制；MMP-2多克隆抗体由Dr.Stetler-Stevenson馈赠；羊抗兔IgG-HRP、羊抗鼠IgG-HRP、四甲基联苯胺(TMB)购自华美生物技术有限公司. 余均为沪产分析纯试剂，所用水均为超纯水.
1.2 方法
1.2.1 HSC的分离培养[3] 选用成年♂ SD大鼠，体质量400g±20g(上海医科大学实验动物中心提供). 麻醉下行门静脉插管、灌流，0.5g/L Ⅳ型胶原酶、1g/L Pronase E 两步消化肝组织，细胞悬液经200目尼龙网过滤，再用Nycodenz(终浓度12%)密度梯度离心. 取中间层细胞洗涤、计数，以105/mL接种于置有小室玻片的培养皿中，50mL/L CO2，950mL/L空气、饱和湿度、37℃培养. 次日换液，以后2d～3d换液一次. 原代培养d7，换无血清培养基，将培养皿随机分为缺氧组(36皿)和对照组(20皿). HSC缺氧培养方法[4]:将培养皿(直径为35mm)置于容积为1L的密闭容器内，器壁有进出气小孔各一个，向容器内输入氮气30min，通气毕，立即封闭两孔，在缺氧状态下继续培养. 12h后吸取培养上清，离心1500r/min,10min，吸取上清-20℃保存备用;小室玻片以PBS洗3次，40mL/L多聚甲醛固定20min，70mL/L乙醇浸泡，4℃保存.
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1.2.2 酶联免疫吸附法(ELISA) 用双抗体夹心法，测培养上清中MMP-2，MMP-1，ColⅣ，PⅢP蛋白相对含量. 上述抗体工作浓度分别为1∶2000，1∶1000，1∶1000，1∶2000，羊抗兔IgG-HRP 和羊抗鼠IgG-HRP均为1∶1000，培养上清稀释3倍，四甲基联苯胺显色，2mol/L H2SO4 终止显色反应. 阴性对照以新鲜无血清培养液代替培养上清. 酶标仪(Vmax KINETICS MICROPLATE READER)450nm测定光密度值，以此表示蛋白相对含量.
1.2.3 小室玻片HE染色 按常规进行. 光镜下计数小室玻片固定方位的9个高倍视野内细胞总数，算出每视野平均细胞数.
统计学处理 t或t＇检验.
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2 结果
2.1 HSC的形态 新分离的HSC，细胞呈圆形，富含折光脂滴. 接种d3，细胞伸出突起，核周仍有大量脂滴. 随着培养时间的延长，细胞渐呈星状，突起多而长，并呈簇状生长. 约7d～10d长满瓶或皿底. 小室玻片HE染色后，每高倍视野细胞数在缺氧组与对照组间无显著性差异.
2.2 培养上清中MMP-2,MMP-1,ColⅣ及PⅢP蛋白相对含量 ELISA方法测知缺氧组4种蛋白相对含量均值皆高于对照组，除ColⅣ外，其余3种在统计学上均有显著性差异(MMP-2:P<0.01;MMP-1，PⅢP: P<0.05),表1.
表1 缺氧对HSC产生MMPs及Col的影响(n,x±s)
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at＇=8.6181 P<0.001；bt=2.2148 P<0.05；c t=2.1398 P<0.05 vs 对照组.
3 讨论
正常情况下，肝窦周隙以Ⅳ型胶原为主的ECM使HSC处于静息状态，一旦改变其生存环境，HSC即由静息状态变为活化状态，一方面产生和分泌ECM，同时通过影响使ECM降解的MMPs的量及活化程度，最终导致肝内ECM大量沉积，发展为肝纤维化[1]. 已知MMP-2的主要降解底物是ECM中的Ⅳ型胶原，后者是维持HSC于生理性静息状态的必要物质，而活化的HSC不仅能产生大量ECMs，也是肝内MMP-2的主要来源. 因而，MMP-2与HSC活化，两者互为因果，在肝纤维化早期尤为突出，并使纤维化进程不断推进. MMP-1降解Ⅰ，Ⅲ型胶原，动态观察表明在肝纤维化起始阶段有一过性升高，以后则一直维持在低水平，使病肝组织Ⅰ，Ⅲ型胶原得以大量沉积. Ⅲ型前胶原由细胞合成后分泌出细胞，同时切去端肽，水解切下的氨基端肽即PⅢP，因而PⅢP的量可反映胶原合成情况.
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我们发现，缺氧使HSC产生MMP-2，MMP-1，PⅢP及ColⅣ增多，即对HSC在ECM的合成和降解两方面均有影响，但增量程度不同，其中尤以MMP-2最明显，约增加3倍，而ColⅣ增加远不如MMP-2显著. 这可能反映了缺氧12h时HSC合成和分泌MMP-2及ColⅣ的实际情况，也可能由于一部分ColⅣ被MMP-2降解所致. 缺氧引起上述改变的机制尚不清楚. 众多研究表明，肝纤维化或硬化时，常存在缺血再灌注或低灌注现象，此种情况下，肝组织氧自由基产生增加，脂质过氧化明显，肝组织损伤加重[5]. 而氧自由基又使TGF-β1基因表达增强[6]，有报道缺氧情况下，培养的人内皮细胞持续表达TGF-β[7],而人肝窦内皮细胞可能亦有类似效应. 已知TGF-β1促进MMP-2和基质蛋白合成,抑制其他MMPs的产生[8]. MMP-1的增加目前尚不清楚. 本研究表明，体外单独缺氧即能导致HSC MMP-2和胶原表达升高，若在体内,缺氧与其他因素同时存在其后果会更严重. 可见研究缺氧与肝纤维化的关系不仅在理论上而且在实践中均具有十分重要的意义.
, 百拇医药
4 参考文献
1 Alcolado R, Arthur MJP, Iredale JP. Pathogenesis of liver fibrosis.Clin Sci, 1997;92:103-112
2 Olaso E, Friedman SL. Molecular regulation of hepatic fibrogenesis. J Hepatology, 1998;29:836-847
3 Schafer S, Zerbe O, Gressner AM. The synthesis of proteoglycans in fat-storing cells of rat liver. Hepatology, 1987;7:680-687
, 百拇医药 4 Vender RL, Clemmons DR, Kwock L, Friedman M. Reduced oxygen tension induces pulmonary endothelium to release a
pulmonary smooth muscle cell mitogen(s). Am Rev Respir Dis, 1987;135:622-627
5 Biasi F, Chiarpotto E, Lanfranco G, Capra A, Zummo U, Chiappino I, Scavazza A, Albano E, Poli G. Oxidative stress in the
development of human ischemic hepatitis during circulatory shock. Free Radic Biol Med, 1994;17:225-233
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6 Poli G, Parola M. Oxidative damage and fibrogenesis. Free Radic Biol Med, 1997;22:287-305
7 Kourembanas S, Hannan RL, Faller DV. Oxygen tension regulates the expression of the platelet-derived growth factor-B chain gene
in human endotheial cells. J Clin Invest, 1990;86:670-674
8 Corcoran ML, Hewitt RE, Kleiner DE, Steler-Stevenson WG. MMP-2:Expression, activation and inhibition.
Enzyme Protein, 1996;49:7-19, http://www.100md.com(陈平圣 翟为溶 张月娥 张锦生)
高校博士点基金资助,No.9837
项目负责人 陈平圣 翟为溶，200032，上海市医学院路138号.
收稿日期 1999-11-29 接收日期 1999-12-19
Subject headings hypoxia; hepatic stellate cell; matrix metalloproteinase; collagen
主题词 缺氧；肝星状细胞；基质金属蛋白酶；胶原
, http://www.100md.com
陈平圣,翟为溶,张月娥,张锦生. 缺氧对肝星状细胞产生胶原及胶原降解酶的影响. 世界华人消化杂志，2000；8(5)：586-587
多种致病因子长期作用均可致肝纤维化，其形成是细胞外基质(extracellular matrix, ECM)产生和降解不平衡的结果[1]. 星状细胞(hepatic stellate cell, HSC)活化是肝纤维化发生的中心环节[2]. 缺氧是最常见的致病或伴随因素之一，其对HSC产生胶原及胶原降解酶有何影响尚不清楚. 作者对原代HSC行缺氧培养，用ELISA方法测培养上清中基质金属蛋白酶1,2(MMP-1,MMP-2)、Ⅳ型胶原(collagenase Ⅳ, Col Ⅳ)及Ⅲ型前胶原氨基端肽(PⅢP)相对含量. 结果报道如下.
1 材料和方法
, http://www.100md.com
1.1 材料 Ⅳ型胶原酶、Pronase E，Nycodenz，DMEM培养基、DMEM/F12(v/v=1/1)无血清培养基为Sigma产品；MMP-1单克隆抗体为CALBIOCHEM产品；PⅢP单克隆抗体由Dr.Punter馈赠；ColⅣ多克隆抗体由本室自制；MMP-2多克隆抗体由Dr.Stetler-Stevenson馈赠；羊抗兔IgG-HRP、羊抗鼠IgG-HRP、四甲基联苯胺(TMB)购自华美生物技术有限公司. 余均为沪产分析纯试剂，所用水均为超纯水.
1.2 方法
1.2.1 HSC的分离培养[3] 选用成年♂ SD大鼠，体质量400g±20g(上海医科大学实验动物中心提供). 麻醉下行门静脉插管、灌流，0.5g/L Ⅳ型胶原酶、1g/L Pronase E 两步消化肝组织，细胞悬液经200目尼龙网过滤，再用Nycodenz(终浓度12%)密度梯度离心. 取中间层细胞洗涤、计数，以105/mL接种于置有小室玻片的培养皿中，50mL/L CO2，950mL/L空气、饱和湿度、37℃培养. 次日换液，以后2d～3d换液一次. 原代培养d7，换无血清培养基，将培养皿随机分为缺氧组(36皿)和对照组(20皿). HSC缺氧培养方法[4]:将培养皿(直径为35mm)置于容积为1L的密闭容器内，器壁有进出气小孔各一个，向容器内输入氮气30min，通气毕，立即封闭两孔，在缺氧状态下继续培养. 12h后吸取培养上清，离心1500r/min,10min，吸取上清-20℃保存备用;小室玻片以PBS洗3次，40mL/L多聚甲醛固定20min，70mL/L乙醇浸泡，4℃保存.
, 百拇医药
1.2.2 酶联免疫吸附法(ELISA) 用双抗体夹心法，测培养上清中MMP-2，MMP-1，ColⅣ，PⅢP蛋白相对含量. 上述抗体工作浓度分别为1∶2000，1∶1000，1∶1000，1∶2000，羊抗兔IgG-HRP 和羊抗鼠IgG-HRP均为1∶1000，培养上清稀释3倍，四甲基联苯胺显色，2mol/L H2SO4 终止显色反应. 阴性对照以新鲜无血清培养液代替培养上清. 酶标仪(Vmax KINETICS MICROPLATE READER)450nm测定光密度值，以此表示蛋白相对含量.
1.2.3 小室玻片HE染色 按常规进行. 光镜下计数小室玻片固定方位的9个高倍视野内细胞总数，算出每视野平均细胞数.
统计学处理 t或t＇检验.
, http://www.100md.com
2 结果
2.1 HSC的形态 新分离的HSC，细胞呈圆形，富含折光脂滴. 接种d3，细胞伸出突起，核周仍有大量脂滴. 随着培养时间的延长，细胞渐呈星状，突起多而长，并呈簇状生长. 约7d～10d长满瓶或皿底. 小室玻片HE染色后，每高倍视野细胞数在缺氧组与对照组间无显著性差异.
2.2 培养上清中MMP-2,MMP-1,ColⅣ及PⅢP蛋白相对含量 ELISA方法测知缺氧组4种蛋白相对含量均值皆高于对照组，除ColⅣ外，其余3种在统计学上均有显著性差异(MMP-2:P<0.01;MMP-1，PⅢP: P<0.05),表1.
表1 缺氧对HSC产生MMPs及Col的影响(n,x±s)
| 组别 | n | MMP-2a | ColⅣ | MMP-1b | PⅢPc |
| 缺氧组 | 36 | 0.0464±0.0196 | 32 0.0640±0.0302 | 36 0.0358±0.0084 | 30 0.0820±0.0470 |
| 对照组 | 20 | 0.0125±0.0098 | 9 0.0503±0.0256 | 20 0.0308±0.0075 | 18 0.0540±0.0380 |
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at＇=8.6181 P<0.001；bt=2.2148 P<0.05；c t=2.1398 P<0.05 vs 对照组.
3 讨论
正常情况下，肝窦周隙以Ⅳ型胶原为主的ECM使HSC处于静息状态，一旦改变其生存环境，HSC即由静息状态变为活化状态，一方面产生和分泌ECM，同时通过影响使ECM降解的MMPs的量及活化程度，最终导致肝内ECM大量沉积，发展为肝纤维化[1]. 已知MMP-2的主要降解底物是ECM中的Ⅳ型胶原，后者是维持HSC于生理性静息状态的必要物质，而活化的HSC不仅能产生大量ECMs，也是肝内MMP-2的主要来源. 因而，MMP-2与HSC活化，两者互为因果，在肝纤维化早期尤为突出，并使纤维化进程不断推进. MMP-1降解Ⅰ，Ⅲ型胶原，动态观察表明在肝纤维化起始阶段有一过性升高，以后则一直维持在低水平，使病肝组织Ⅰ，Ⅲ型胶原得以大量沉积. Ⅲ型前胶原由细胞合成后分泌出细胞，同时切去端肽，水解切下的氨基端肽即PⅢP，因而PⅢP的量可反映胶原合成情况.
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我们发现，缺氧使HSC产生MMP-2，MMP-1，PⅢP及ColⅣ增多，即对HSC在ECM的合成和降解两方面均有影响，但增量程度不同，其中尤以MMP-2最明显，约增加3倍，而ColⅣ增加远不如MMP-2显著. 这可能反映了缺氧12h时HSC合成和分泌MMP-2及ColⅣ的实际情况，也可能由于一部分ColⅣ被MMP-2降解所致. 缺氧引起上述改变的机制尚不清楚. 众多研究表明，肝纤维化或硬化时，常存在缺血再灌注或低灌注现象，此种情况下，肝组织氧自由基产生增加，脂质过氧化明显，肝组织损伤加重[5]. 而氧自由基又使TGF-β1基因表达增强[6]，有报道缺氧情况下，培养的人内皮细胞持续表达TGF-β[7],而人肝窦内皮细胞可能亦有类似效应. 已知TGF-β1促进MMP-2和基质蛋白合成,抑制其他MMPs的产生[8]. MMP-1的增加目前尚不清楚. 本研究表明，体外单独缺氧即能导致HSC MMP-2和胶原表达升高，若在体内,缺氧与其他因素同时存在其后果会更严重. 可见研究缺氧与肝纤维化的关系不仅在理论上而且在实践中均具有十分重要的意义.
, 百拇医药
4 参考文献
1 Alcolado R, Arthur MJP, Iredale JP. Pathogenesis of liver fibrosis.Clin Sci, 1997;92:103-112
2 Olaso E, Friedman SL. Molecular regulation of hepatic fibrogenesis. J Hepatology, 1998;29:836-847
3 Schafer S, Zerbe O, Gressner AM. The synthesis of proteoglycans in fat-storing cells of rat liver. Hepatology, 1987;7:680-687
, 百拇医药 4 Vender RL, Clemmons DR, Kwock L, Friedman M. Reduced oxygen tension induces pulmonary endothelium to release a
pulmonary smooth muscle cell mitogen(s). Am Rev Respir Dis, 1987;135:622-627
5 Biasi F, Chiarpotto E, Lanfranco G, Capra A, Zummo U, Chiappino I, Scavazza A, Albano E, Poli G. Oxidative stress in the
development of human ischemic hepatitis during circulatory shock. Free Radic Biol Med, 1994;17:225-233
, http://www.100md.com
6 Poli G, Parola M. Oxidative damage and fibrogenesis. Free Radic Biol Med, 1997;22:287-305
7 Kourembanas S, Hannan RL, Faller DV. Oxygen tension regulates the expression of the platelet-derived growth factor-B chain gene
in human endotheial cells. J Clin Invest, 1990;86:670-674
8 Corcoran ML, Hewitt RE, Kleiner DE, Steler-Stevenson WG. MMP-2:Expression, activation and inhibition.
Enzyme Protein, 1996;49:7-19, http://www.100md.com(陈平圣 翟为溶 张月娥 张锦生)