大肠癌患者粪脱落细胞P53的表达
中国人民解放军北京军区总医院 1消化内科 2病理科 北京市 100700
项目负责人 范如英，现系第三军医大学消化内科专业在读博士研究生.
收稿日期 2000-01-26 接受日期 2000-03-02
Subject headings colorectal neoplasms/pathology; protein P53 ; gene expression; immunohistochemistry; oncogene proteins;
feces; exfoliated cells
, 百拇医药
主题词 结肠直肠肿瘤/病理学；蛋白P53； 基因表达；免疫组织化学；癌基因蛋白质类；粪便
范如英,李世荣,吴霞,武子涛,晨智敏,邓永江,曹建彪,张红光. 大肠癌患者粪 脱落细胞P53的表达. 世界华人消化杂志，2000；8(7)：814-815
大肠癌是人类常见的恶性肿瘤之一，细胞癌变的关键因素在于基因的变异. P53基因与 大肠癌发病密切相关，关于大肠癌组织中P53蛋白的检测屡有报道，但粪便结直肠癌脱落细胞中P53的表达状况知之甚少，我们通过检测脱落细胞中P53蛋白表达，为大肠癌的诊断及判断予后提供有益的检测途径.
1 材料和方法
, 百拇医药
1.1 材料 共收集我院1999-09/2000-03就诊的10例大肠癌患者的粪便，男4例，女6例；年龄36岁 ～90岁. 组织类型经活检证实均为腺癌, 且其粪便中均检出异型细胞. Dukes分期：其中4例患者为Dukes B期，3例为Dukes C期，1例为Dukes D期，2例因未在我院手术具体分期不 详. 检测P53在癌组织及其脱落细胞中的表达.
1.2 方法 采集新鲜粪便3g～5g或稀水便50 mL～100mL,加入MEM细胞培养液50mL～100mL混匀；依次经过30，100，200和300目筛网过滤；1500r/min离心，取沉淀涂片. 涂片经950mL/L乙醇固定10min，4℃保存备用. 所有结肠癌组织均来自于我院结肠镜活检标本,经 100mL/L福尔马林固定，石蜡包埋连续切片，片厚5μm. 脱落细胞涂片均经950mL/L乙醇固定. 免疫组化染色采用SP法,P53单抗及SP试剂盒均购自迈新公司. 在加Ⅰ抗前标本于pH:6.00 0.01mol/L枸橼酸缓冲液中行微波修复抗原,其他步 骤严格按说明书操作. 实验设阳性对照，PBS代替Ⅰ抗作为阴性对照.P53蛋白表达阳性有棕黄色颗粒状或团块分布于大肠癌细胞核内,阳性染色肿瘤细胞大于10% 定为P53染色阳性,即过表达；小于10%定为阴性.
, 百拇医药
2 结果大肠癌组织切片中P53阳性表达率为40%(4/10),阳性表达的组织细胞表现为癌组织细胞 可见棕黄色颗粒或斑块分布于胞核. 脱落癌细胞经苏木精复染后显示核异型，表现为核体积较脱落的正常柱状上皮体积大、形状不规则，同一群癌细胞核大小不等、形状不一. P53表达阳性的细胞核可见棕黄色染色，同一群癌细胞有的细胞表达阳性，有的呈阴性表达. 脱落细胞中P53表达率为50%(5/10)，其中4例患者癌组织及其脱落细胞P53表达均为阳性，1例仅在脱落细胞中检出阳性表达，其余5例患者的癌组织及其脱落细胞均呈阴性表达. P53在癌组织及其脱落细胞中检测一致率为90%(9/10).
3 讨论P53基因与大肠癌的发病关系密切，Yamaguchi et al [1]报道42%～70%的 大肠癌P53蛋白表达阳性. P53基因位于人类17号染色体短臂，有11个外显子组成. 序列分 析表明P53基因突变的热点位于第5～8外显子中的四个高度保守序列，分别在第132～143，174～179，236～248和272～281密码子之间，而这些序列区可能是P53蛋白生物学活 性的关键部位[2]. 正常野生型P53基因的蛋白产物不稳定，T1/2仅20min，不能聚集到足够的量使得用免疫组化方法可以检测到. 而突变型P53蛋白T1/2明显延长至1.4h～7h,所以用免疫组化方法能够检测到的P53蛋白均为突变型 [3].P53基因是细胞生长重要的调节因子，它与细胞周期的调控、DNA的修复和合成、细胞的分化及凋亡有关. 当DNA受损时，细胞P53表达增强，使细胞周期停止在G1期直至损伤修复，如果修复失败，P53通过启动凋亡机制诱导损伤的细胞发生凋亡而被清除，从而防止具 有癌变倾向的受损细胞存活下去，P53突变时不能阻断受损的细胞分裂增殖，带有损伤DNA的 细胞克隆增生，再加上其他抑癌基因的失活和癌基因的激活协同积累，细胞逐渐演变为恶性,最终发展成为肿瘤[4]. 结直肠上皮更新快，每3d～6d更新1次，每天 约有10-10正常上皮脱落[5]. 瘤细胞间粘着力比正常低[6]，因而更易脱落进入肠腔，随粪便排出体外，脱落细胞如同一个窗口反映了大肠粘膜的增生状况. 目前检测粪便中大肠癌相关抗原屡见报道[7,8]，但均未见提取出脱落细胞，在细胞形态基础上检测癌抗原的表达. 我们用淘洗法从粪便中提取脱落细胞，然后进行P53蛋白的检测. 结果10例结直肠癌患者中5例P53表达阳性，与相应癌组织表达符合率为90%. 值得注意的是1例患者癌组织P53表达阴性，而脱落细胞呈阳性表达，分析原因考虑脱落细胞来源于肿瘤整个肠腔面，而活检取材局限，可能是取材时漏检了P53表达阳性的癌组织而引起假阴性的结果. P53基因的高表达的患者预后往往差[9]. 许多作者[10-12]的研究结果均说明P53蛋白的阳性表达与大肠癌组织浸润肠壁的深度，淋巴结转移呈正相关，尽管突变型P53的表达与大肠癌淋巴结转移相关性的机制目前尚不清楚，但其相关 性可为临床预测淋巴结转移趋势提供有用的信息[10]. 我们的研究表明，脱落细胞的P53蛋白表达基本上反映了大肠癌组织的P53癌基因的突变状况，粪便中的脱落细胞P53蛋白检测取材方便、无创，依从性好，因而进行大肠脱落细胞的P53的检测有利于估价患者的预后，也为大肠癌的诊断及筛查提供有益途径.
, http://www.100md.com
4 参考文献1 Yamaguchi A, Nakagawara G, Kurosaka Y, Nishimura G, Yonemura Y, Miy azaki I. P53 immunoreaction in endoscopic
biopsy specimens of colorectal canc er and its prognostic significance. Br J Cancer, 1993;68:399-402
2 许昌泰, 潘伯荣. 大肠癌基因改变的研究. 华人消化杂志，1998；6：58-60
3 刘复生, 刘彤华. 肿瘤病理学. 第1版. 北京: 北京医科大学中国协和医科大学联合出版社, 1997:54-55
4 许良中. 实用肿瘤病理方法学. 第1版. 上海: 上海医科大学出版社, 1997:480-482
, 百拇医药
5 Ratto C, Flamini G, Sofo L, Nucera P, Ippoliti M, Curigliano G, Ferretti G, Sgambato A, Merico M, Doglietto GB, Cittadini A, Crucitti F.
Detection of onco gene mutation from neoplastic colonic cells exfoliated in feces.Dis Colon Re ctum，1996;39:1238-1244
6 杨光华. 肿瘤. 见：武忠弼主编. 病理学. 第3版. 北京:人民卫生出版社，1993:147-1 48
7 Shimano T, Okuda H, Monden T, Inaji H, Mori T. Usefulness of carcinoembr yonic antigen measurement in feces of patients
, http://www.100md.com
with colorectal cancer. Dis Col on Rectum, 1987;30:607-610
8 袁玫, 费丽华, 张小平, 刘琰, 张向阳, 李力, 李华. 用单克隆抗体检测患者粪便中癌 相关抗原诊断大肠癌的价值.
中华外科杂志, 1990;28:497-500
9 刘宝善, 许玉成, 王辉, 董新舒. 大肠肛门肿瘤学. 第1版. 成都: 四川科技出版社, 1998:111-113
10 许庆文，李岩松，朱荷根.大肠癌P53蛋白PCNA和CEA的表达与淋巴结转 移的关系. 华人消化杂志，1998；6：244-246
11 庄小强，赖日权，孙桂华，王晓怀，袁世珍. 大肠癌P53蛋白与PCNA表达的预后 意义. 世界华人消化杂志, 1999；7：616
12 申兴斌，张旭晨，梅立新，赵晓明，胡建功. 大肠癌组织nm23/NDPK及P53表达的意义. 世界华人消化杂志，1999；7：809-810, http://www.100md.com(范如英1 李世荣1 吴 霞2 武子涛1 晨智敏1 邓永江2 曹建彪1 张红光1)
项目负责人 范如英，现系第三军医大学消化内科专业在读博士研究生.
收稿日期 2000-01-26 接受日期 2000-03-02
Subject headings colorectal neoplasms/pathology; protein P53 ; gene expression; immunohistochemistry; oncogene proteins;
feces; exfoliated cells
, 百拇医药
主题词 结肠直肠肿瘤/病理学；蛋白P53； 基因表达；免疫组织化学；癌基因蛋白质类；粪便
范如英,李世荣,吴霞,武子涛,晨智敏,邓永江,曹建彪,张红光. 大肠癌患者粪 脱落细胞P53的表达. 世界华人消化杂志，2000；8(7)：814-815
大肠癌是人类常见的恶性肿瘤之一，细胞癌变的关键因素在于基因的变异. P53基因与 大肠癌发病密切相关，关于大肠癌组织中P53蛋白的检测屡有报道，但粪便结直肠癌脱落细胞中P53的表达状况知之甚少，我们通过检测脱落细胞中P53蛋白表达，为大肠癌的诊断及判断予后提供有益的检测途径.
1 材料和方法
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1.1 材料 共收集我院1999-09/2000-03就诊的10例大肠癌患者的粪便，男4例，女6例；年龄36岁 ～90岁. 组织类型经活检证实均为腺癌, 且其粪便中均检出异型细胞. Dukes分期：其中4例患者为Dukes B期，3例为Dukes C期，1例为Dukes D期，2例因未在我院手术具体分期不 详. 检测P53在癌组织及其脱落细胞中的表达.
1.2 方法 采集新鲜粪便3g～5g或稀水便50 mL～100mL,加入MEM细胞培养液50mL～100mL混匀；依次经过30，100，200和300目筛网过滤；1500r/min离心，取沉淀涂片. 涂片经950mL/L乙醇固定10min，4℃保存备用. 所有结肠癌组织均来自于我院结肠镜活检标本,经 100mL/L福尔马林固定，石蜡包埋连续切片，片厚5μm. 脱落细胞涂片均经950mL/L乙醇固定. 免疫组化染色采用SP法,P53单抗及SP试剂盒均购自迈新公司. 在加Ⅰ抗前标本于pH:6.00 0.01mol/L枸橼酸缓冲液中行微波修复抗原,其他步 骤严格按说明书操作. 实验设阳性对照，PBS代替Ⅰ抗作为阴性对照.P53蛋白表达阳性有棕黄色颗粒状或团块分布于大肠癌细胞核内,阳性染色肿瘤细胞大于10% 定为P53染色阳性,即过表达；小于10%定为阴性.
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2 结果大肠癌组织切片中P53阳性表达率为40%(4/10),阳性表达的组织细胞表现为癌组织细胞 可见棕黄色颗粒或斑块分布于胞核. 脱落癌细胞经苏木精复染后显示核异型，表现为核体积较脱落的正常柱状上皮体积大、形状不规则，同一群癌细胞核大小不等、形状不一. P53表达阳性的细胞核可见棕黄色染色，同一群癌细胞有的细胞表达阳性，有的呈阴性表达. 脱落细胞中P53表达率为50%(5/10)，其中4例患者癌组织及其脱落细胞P53表达均为阳性，1例仅在脱落细胞中检出阳性表达，其余5例患者的癌组织及其脱落细胞均呈阴性表达. P53在癌组织及其脱落细胞中检测一致率为90%(9/10).
3 讨论P53基因与大肠癌的发病关系密切，Yamaguchi et al [1]报道42%～70%的 大肠癌P53蛋白表达阳性. P53基因位于人类17号染色体短臂，有11个外显子组成. 序列分 析表明P53基因突变的热点位于第5～8外显子中的四个高度保守序列，分别在第132～143，174～179，236～248和272～281密码子之间，而这些序列区可能是P53蛋白生物学活 性的关键部位[2]. 正常野生型P53基因的蛋白产物不稳定，T1/2仅20min，不能聚集到足够的量使得用免疫组化方法可以检测到. 而突变型P53蛋白T1/2明显延长至1.4h～7h,所以用免疫组化方法能够检测到的P53蛋白均为突变型 [3].P53基因是细胞生长重要的调节因子，它与细胞周期的调控、DNA的修复和合成、细胞的分化及凋亡有关. 当DNA受损时，细胞P53表达增强，使细胞周期停止在G1期直至损伤修复，如果修复失败，P53通过启动凋亡机制诱导损伤的细胞发生凋亡而被清除，从而防止具 有癌变倾向的受损细胞存活下去，P53突变时不能阻断受损的细胞分裂增殖，带有损伤DNA的 细胞克隆增生，再加上其他抑癌基因的失活和癌基因的激活协同积累，细胞逐渐演变为恶性,最终发展成为肿瘤[4]. 结直肠上皮更新快，每3d～6d更新1次，每天 约有10-10正常上皮脱落[5]. 瘤细胞间粘着力比正常低[6]，因而更易脱落进入肠腔，随粪便排出体外，脱落细胞如同一个窗口反映了大肠粘膜的增生状况. 目前检测粪便中大肠癌相关抗原屡见报道[7,8]，但均未见提取出脱落细胞，在细胞形态基础上检测癌抗原的表达. 我们用淘洗法从粪便中提取脱落细胞，然后进行P53蛋白的检测. 结果10例结直肠癌患者中5例P53表达阳性，与相应癌组织表达符合率为90%. 值得注意的是1例患者癌组织P53表达阴性，而脱落细胞呈阳性表达，分析原因考虑脱落细胞来源于肿瘤整个肠腔面，而活检取材局限，可能是取材时漏检了P53表达阳性的癌组织而引起假阴性的结果. P53基因的高表达的患者预后往往差[9]. 许多作者[10-12]的研究结果均说明P53蛋白的阳性表达与大肠癌组织浸润肠壁的深度，淋巴结转移呈正相关，尽管突变型P53的表达与大肠癌淋巴结转移相关性的机制目前尚不清楚，但其相关 性可为临床预测淋巴结转移趋势提供有用的信息[10]. 我们的研究表明，脱落细胞的P53蛋白表达基本上反映了大肠癌组织的P53癌基因的突变状况，粪便中的脱落细胞P53蛋白检测取材方便、无创，依从性好，因而进行大肠脱落细胞的P53的检测有利于估价患者的预后，也为大肠癌的诊断及筛查提供有益途径.
, http://www.100md.com
4 参考文献1 Yamaguchi A, Nakagawara G, Kurosaka Y, Nishimura G, Yonemura Y, Miy azaki I. P53 immunoreaction in endoscopic
biopsy specimens of colorectal canc er and its prognostic significance. Br J Cancer, 1993;68:399-402
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, 百拇医药
5 Ratto C, Flamini G, Sofo L, Nucera P, Ippoliti M, Curigliano G, Ferretti G, Sgambato A, Merico M, Doglietto GB, Cittadini A, Crucitti F.
Detection of onco gene mutation from neoplastic colonic cells exfoliated in feces.Dis Colon Re ctum，1996;39:1238-1244
6 杨光华. 肿瘤. 见：武忠弼主编. 病理学. 第3版. 北京:人民卫生出版社，1993:147-1 48
7 Shimano T, Okuda H, Monden T, Inaji H, Mori T. Usefulness of carcinoembr yonic antigen measurement in feces of patients
, http://www.100md.com
with colorectal cancer. Dis Col on Rectum, 1987;30:607-610
8 袁玫, 费丽华, 张小平, 刘琰, 张向阳, 李力, 李华. 用单克隆抗体检测患者粪便中癌 相关抗原诊断大肠癌的价值.
中华外科杂志, 1990;28:497-500
9 刘宝善, 许玉成, 王辉, 董新舒. 大肠肛门肿瘤学. 第1版. 成都: 四川科技出版社, 1998:111-113
10 许庆文，李岩松，朱荷根.大肠癌P53蛋白PCNA和CEA的表达与淋巴结转 移的关系. 华人消化杂志，1998；6：244-246
11 庄小强，赖日权，孙桂华，王晓怀，袁世珍. 大肠癌P53蛋白与PCNA表达的预后 意义. 世界华人消化杂志, 1999；7：616
12 申兴斌，张旭晨，梅立新，赵晓明，胡建功. 大肠癌组织nm23/NDPK及P53表达的意义. 世界华人消化杂志，1999；7：809-810, http://www.100md.com(范如英1 李世荣1 吴 霞2 武子涛1 晨智敏1 邓永江2 曹建彪1 张红光1)