大鼠急性重症胰腺炎模型的建立
首都医科大学附属北京友谊医院内科 北京市 100020
项目负责人 尚占民，100020，北京市，首都医科大学附属北京朝阳医院消化内科.
收稿日期 2000-05-12 接收日期 2000-05-16
Subject headings pancreatitis; rats; models; glycodeoxycholic acid; cerulein; injections, intravenous
主题词 胰腺炎；大鼠；模型；甘脱氧胆酸； 蛙皮素；注射，静脉内
尚占民, 王宝恩, 张淑文, 次秀丽. 大鼠急性重症胰腺炎模型的建立. 世界华人消化杂志，2000；8(8)：921
, 百拇医药
急性重症胰腺炎是一临床急重症,其死亡率高,预后差[1,2,3],深入开展对急性重症胰腺炎早期病理生理变化的研究,对于早期干预治疗,降低死亡率有着重要的意义,为此我们在国内首次建立了便于研究其早期病理生理变化及防治效果的大鼠急性重症胰腺炎模型.
1 材料和方法
1.1 材料 SD大鼠，♂，320g～390g, 由北京医科大学实验动物中心提供. 将18只SD大鼠随机分为ASP组12只; 假手术(sham operation, SO)组6只. 蛙皮素(cerulein), Sigma产品;甘脱氧胆酸 (glycodeoxycholic acid), Sigma产品;微量注射泵SR-10型(日本制造).
1.2 方法 制作模型前1d行颈内静脉插管，首先以(30～40)mg·kg-1体重剂量的6g·L-1戊巴比妥钠ip，然后固定动物、常规备皮、消毒、切皮、分离右颈内静脉，插入硅胶管、固定，经皮下隧道穿出背部肩胛区，固定于皮肤上，关闭导管，次日备用. 术前动物禁食一夜. 次日经静脉导管以(20～30)mg/kg体重剂量缓慢注入0.6%的戊巴比妥钠溶液麻醉大鼠，经腹正中切口入腹，找到十二指肠及胆胰管，用微型血管夹距肝下1.5cm处夹闭总肝胆管，用4号针头经十二指肠乳头部浆膜层进针，插入胆胰管(应避免胰管穿孔，术中胰内出血)，用微量注射泵将0.5mL, 10mmol的甘脱氧胆酸溶液(由甘氨酰甘氨酸NaOH缓冲液配制、pH 8.0)缓慢注射入胆胰管中(10min)，注射完毕后，去除总肝胆管的血管夹. 然后逐层关闭腹腔. 整个手术操作过程均严格无菌操作. 最后将大鼠放回笼中，经颈静脉导管以5μg·kg-1·h-1的速度用微量注射泵持续颈静脉输注蛙皮素6h(将蛙皮素以10mg·L-1的浓度溶入生理盐水中)，再以8mL·kg-1·h-1的速度补给乳酸林格氏液6h，以维持其生理需要，然后，关闭输液管道，大鼠可以自由进水. SO组大鼠仅剖腹，牵拉十二指肠及胰腺，然后关腹，静脉输注生理盐水6h(2mL·h-1)，然后补给乳酸林格氏液6h(8mL·kg-1·h-1),大鼠方可自由进水. 于制模后24h，开腹，观察腹腔及胰腺大体形态，从门静脉取血，分别分离血清、血浆，-20℃冻存，以测定血淀粉酶含量，然后分别取胰腺组织用10mL·L-1的福尔马林固定，经常规石蜡包埋，切片，HE染色，由病理医师观察. 观察:制模后一般形态观察,大鼠腹腔及胰腺大体形态，胰腺组织病理形态观察;血清淀粉酶(AMY)测定，采用PNPG7 限制底物法(试剂盒为上海长征医学科学有限公司产品),单位为u·L-1;观察24h内ASP组死亡大鼠数目，计算24h病死率.
, 百拇医药
统计学方法 全部数据以均数±标准差(x±s)表示，两组间差异比较采用T检验，以P<0.05为差异有显著性.
2 结果
制模后ASP组大鼠少动、弓背、竖毛、精神萎靡、烦渴；而SO组大鼠一般状况正常. ASP组24h病死率为42%(共制模12只，不到24h死亡5只，存活7只)，SO组无死亡. 24h ASP大鼠腹腔有大量血性腹水，胃及肠管明显扩张，胰腺周围及肠系膜上可见散在的钙化灶，胰腺可见灶性出血、水肿及渗出. 病理切片观察表现为胰腺腺泡片状出血、坏死，正常胰腺小叶消失，结构破坏，可见散在的空泡变性的腺泡细胞，部分泡核溶解消失，间质血管扩张充盈，坏死胰腺组织周围可见大量中性白细胞浸润. 而SO组大鼠腹腔无腹水，无胃及肠管扩张，胰腺大体形态及胰腺腺泡结构大致正常. ASP组大鼠血清淀粉酶(61434±1117)u·L-1较SO组大鼠的血淀粉酶(10212±2817)u·L-1显著增高(P<0.001).
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3 讨论
急性重症胰腺炎发病凶险，预后差，临床死亡率高，目前用来研究急性胰腺炎的早期机体病理、生理变化及细胞损伤机制的动物模型，包括用蛙皮素刺激胰腺高分泌的急性胰腺炎模型[4]，及传统的用高浓度胆盐胆胰管内注射的出血坏死性胰腺炎模型. 前者病情较轻，常可自愈，而后者病情又过于严重，死亡率高(24h病死率达75%)，使治疗措施往往不能奏效[5],故二者均不适合于早期防治研究. 另一种用DL-乙硫氨酸饲料(choline-deficient diet supplemented with DL-ethinonine,CED)饲养小鼠复制的急性胰腺炎模型，从病理上模仿了人类疾病，但胰腺损伤较重，且必须用雌性小鼠;小鼠体重较小，操作及取材不便，大大限制了研究的应用[6].
, http://www.100md.com
我们在国内首次用低剂量脱氧胆酸胆胰管注射结合静脉恒速注射蛙皮素刺激胰腺分泌成功复制了急性重症胰腺炎模型. 从ASP模型组血清淀粉酶较SO组显著增高(P<0.001)，ASP大鼠腹腔存在大量血性腹水，肠系膜及胰腺有明显脂肪坏死及钙化灶形成，胰腺表现为出血、坏死、水肿、渗出，病理形态表现为腺小叶结构破坏，出血，腺泡空泡变性，凝固性坏死，部分泡核溶解，有大量中性粒细胞浸润；其与人重症胰腺炎极为相似，且其24h病死率为42%. 该模型克服了以往急性胰腺炎模型的病情过重或过轻及不易控制的缺点，且24h病死率适中，便于进行干预性治疗研究，同时可用于对其发病早期的病理生理机制进行研究.
该模型是一有创性动物模型，制作过程中必须严格无菌操作，以避免细菌污染，影响模型制作及试验结果. 我们用4号针头经十二指肠浆膜层穿刺进入胆胰管，用微量注射泵恒速微量注射脱氧胆酸，避免了切开十二指肠壁，经十二指肠乳头插管注射，使制模过程得以简化，便于操作，减少了术中感染的机会，且达到了相似的效果.
, 百拇医药
4 参考文献
1 Pezzilli R, Mancini F. Assessment of severity of acute pancreatitis: a comparison between old and most recent modalities used
to evaluate this perennial problem. World J Gastroenterol, 1999;5:283-285
2 屠伟峰, 黎介寿. 炎性介质和细胞因子在胰腺炎性全身炎症应答综合征的作用. 新消化病学杂志, 1997;5:595-598
3 Gianotti L, Munda R, Gennari R, Pyles T, Alexander W. Effect of different regimens of gut decontamination on bacterial
, 百拇医药
translocation and mortality in experimental acute pancreatitis. Eur J Surg, 1995;161:85-92
4 Medich DS, Lee TK, Melhem MF, Rowe MI, Schraut WH, Lee KKW. Pathogenesis of pancreatic sepsis. Am J Surg, 1993;165:46
5 Aho HJ, Nevaliainen TJ. Experimental pancreatitis in the rat: ultrastructure of sodium taurocholate induced pancreatic lesions.
Scand J Gastroenterol, 1980;15:411-416
6 Rattner DW. Experimental models of acute pancreatitis and their relevance to human disease.
Scand J Gastroenterol, 1996;31(Suppl 219):6-9, 百拇医药(尚占民 王宝恩 张淑文 次秀丽)
项目负责人 尚占民，100020，北京市，首都医科大学附属北京朝阳医院消化内科.
收稿日期 2000-05-12 接收日期 2000-05-16
Subject headings pancreatitis; rats; models; glycodeoxycholic acid; cerulein; injections, intravenous
主题词 胰腺炎；大鼠；模型；甘脱氧胆酸； 蛙皮素；注射，静脉内
尚占民, 王宝恩, 张淑文, 次秀丽. 大鼠急性重症胰腺炎模型的建立. 世界华人消化杂志，2000；8(8)：921
, 百拇医药
急性重症胰腺炎是一临床急重症,其死亡率高,预后差[1,2,3],深入开展对急性重症胰腺炎早期病理生理变化的研究,对于早期干预治疗,降低死亡率有着重要的意义,为此我们在国内首次建立了便于研究其早期病理生理变化及防治效果的大鼠急性重症胰腺炎模型.
1 材料和方法
1.1 材料 SD大鼠，♂，320g～390g, 由北京医科大学实验动物中心提供. 将18只SD大鼠随机分为ASP组12只; 假手术(sham operation, SO)组6只. 蛙皮素(cerulein), Sigma产品;甘脱氧胆酸 (glycodeoxycholic acid), Sigma产品;微量注射泵SR-10型(日本制造).
1.2 方法 制作模型前1d行颈内静脉插管，首先以(30～40)mg·kg-1体重剂量的6g·L-1戊巴比妥钠ip，然后固定动物、常规备皮、消毒、切皮、分离右颈内静脉，插入硅胶管、固定，经皮下隧道穿出背部肩胛区，固定于皮肤上，关闭导管，次日备用. 术前动物禁食一夜. 次日经静脉导管以(20～30)mg/kg体重剂量缓慢注入0.6%的戊巴比妥钠溶液麻醉大鼠，经腹正中切口入腹，找到十二指肠及胆胰管，用微型血管夹距肝下1.5cm处夹闭总肝胆管，用4号针头经十二指肠乳头部浆膜层进针，插入胆胰管(应避免胰管穿孔，术中胰内出血)，用微量注射泵将0.5mL, 10mmol的甘脱氧胆酸溶液(由甘氨酰甘氨酸NaOH缓冲液配制、pH 8.0)缓慢注射入胆胰管中(10min)，注射完毕后，去除总肝胆管的血管夹. 然后逐层关闭腹腔. 整个手术操作过程均严格无菌操作. 最后将大鼠放回笼中，经颈静脉导管以5μg·kg-1·h-1的速度用微量注射泵持续颈静脉输注蛙皮素6h(将蛙皮素以10mg·L-1的浓度溶入生理盐水中)，再以8mL·kg-1·h-1的速度补给乳酸林格氏液6h，以维持其生理需要，然后，关闭输液管道，大鼠可以自由进水. SO组大鼠仅剖腹，牵拉十二指肠及胰腺，然后关腹，静脉输注生理盐水6h(2mL·h-1)，然后补给乳酸林格氏液6h(8mL·kg-1·h-1),大鼠方可自由进水. 于制模后24h，开腹，观察腹腔及胰腺大体形态，从门静脉取血，分别分离血清、血浆，-20℃冻存，以测定血淀粉酶含量，然后分别取胰腺组织用10mL·L-1的福尔马林固定，经常规石蜡包埋，切片，HE染色，由病理医师观察. 观察:制模后一般形态观察,大鼠腹腔及胰腺大体形态，胰腺组织病理形态观察;血清淀粉酶(AMY)测定，采用PNPG7 限制底物法(试剂盒为上海长征医学科学有限公司产品),单位为u·L-1;观察24h内ASP组死亡大鼠数目，计算24h病死率.
, 百拇医药
统计学方法 全部数据以均数±标准差(x±s)表示，两组间差异比较采用T检验，以P<0.05为差异有显著性.
2 结果
制模后ASP组大鼠少动、弓背、竖毛、精神萎靡、烦渴；而SO组大鼠一般状况正常. ASP组24h病死率为42%(共制模12只，不到24h死亡5只，存活7只)，SO组无死亡. 24h ASP大鼠腹腔有大量血性腹水，胃及肠管明显扩张，胰腺周围及肠系膜上可见散在的钙化灶，胰腺可见灶性出血、水肿及渗出. 病理切片观察表现为胰腺腺泡片状出血、坏死，正常胰腺小叶消失，结构破坏，可见散在的空泡变性的腺泡细胞，部分泡核溶解消失，间质血管扩张充盈，坏死胰腺组织周围可见大量中性白细胞浸润. 而SO组大鼠腹腔无腹水，无胃及肠管扩张，胰腺大体形态及胰腺腺泡结构大致正常. ASP组大鼠血清淀粉酶(61434±1117)u·L-1较SO组大鼠的血淀粉酶(10212±2817)u·L-1显著增高(P<0.001).
, 百拇医药
3 讨论
急性重症胰腺炎发病凶险，预后差，临床死亡率高，目前用来研究急性胰腺炎的早期机体病理、生理变化及细胞损伤机制的动物模型，包括用蛙皮素刺激胰腺高分泌的急性胰腺炎模型[4]，及传统的用高浓度胆盐胆胰管内注射的出血坏死性胰腺炎模型. 前者病情较轻，常可自愈，而后者病情又过于严重，死亡率高(24h病死率达75%)，使治疗措施往往不能奏效[5],故二者均不适合于早期防治研究. 另一种用DL-乙硫氨酸饲料(choline-deficient diet supplemented with DL-ethinonine,CED)饲养小鼠复制的急性胰腺炎模型，从病理上模仿了人类疾病，但胰腺损伤较重，且必须用雌性小鼠;小鼠体重较小，操作及取材不便，大大限制了研究的应用[6].
, http://www.100md.com
我们在国内首次用低剂量脱氧胆酸胆胰管注射结合静脉恒速注射蛙皮素刺激胰腺分泌成功复制了急性重症胰腺炎模型. 从ASP模型组血清淀粉酶较SO组显著增高(P<0.001)，ASP大鼠腹腔存在大量血性腹水，肠系膜及胰腺有明显脂肪坏死及钙化灶形成，胰腺表现为出血、坏死、水肿、渗出，病理形态表现为腺小叶结构破坏，出血，腺泡空泡变性，凝固性坏死，部分泡核溶解，有大量中性粒细胞浸润；其与人重症胰腺炎极为相似，且其24h病死率为42%. 该模型克服了以往急性胰腺炎模型的病情过重或过轻及不易控制的缺点，且24h病死率适中，便于进行干预性治疗研究，同时可用于对其发病早期的病理生理机制进行研究.
该模型是一有创性动物模型，制作过程中必须严格无菌操作，以避免细菌污染，影响模型制作及试验结果. 我们用4号针头经十二指肠浆膜层穿刺进入胆胰管，用微量注射泵恒速微量注射脱氧胆酸，避免了切开十二指肠壁，经十二指肠乳头插管注射，使制模过程得以简化，便于操作，减少了术中感染的机会，且达到了相似的效果.
, 百拇医药
4 参考文献
1 Pezzilli R, Mancini F. Assessment of severity of acute pancreatitis: a comparison between old and most recent modalities used
to evaluate this perennial problem. World J Gastroenterol, 1999;5:283-285
2 屠伟峰, 黎介寿. 炎性介质和细胞因子在胰腺炎性全身炎症应答综合征的作用. 新消化病学杂志, 1997;5:595-598
3 Gianotti L, Munda R, Gennari R, Pyles T, Alexander W. Effect of different regimens of gut decontamination on bacterial
, 百拇医药
translocation and mortality in experimental acute pancreatitis. Eur J Surg, 1995;161:85-92
4 Medich DS, Lee TK, Melhem MF, Rowe MI, Schraut WH, Lee KKW. Pathogenesis of pancreatic sepsis. Am J Surg, 1993;165:46
5 Aho HJ, Nevaliainen TJ. Experimental pancreatitis in the rat: ultrastructure of sodium taurocholate induced pancreatic lesions.
Scand J Gastroenterol, 1980;15:411-416
6 Rattner DW. Experimental models of acute pancreatitis and their relevance to human disease.
Scand J Gastroenterol, 1996;31(Suppl 219):6-9, 百拇医药(尚占民 王宝恩 张淑文 次秀丽)