端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸对肝癌细胞影响的研究
兰州医学院第二附属医院消化科 甘肃省兰州市 730030
项目负责人 许兰涛兰州医学院第二附属医院消化科 甘肃省兰州市 730030
收稿日期 2000-03-04 接收日期 2000-04-10
Subject headings telomerase; liver neoplasms; oligonucleotides, antisense; apoptosis; oncogenes; flow cytometry
主题词 端粒酶；肝肿瘤；寡核苷酸类，反义；细胞凋亡；癌基因；流式细胞术
许兰涛，马力. 端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸对肝癌细胞影响的研究. 世界华人消化杂志，2000；8(9)：1065-1066
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细胞凋亡(Apoptosis)是由基因控制的细胞主动死亡方式. 应用药物选择性诱导肿瘤细胞凋亡能改善肿瘤的预后[1]. 染色体端粒(Telomere)是位于细胞染色体末端的一种特殊结构，在人体细胞中，端粒由串联的短片段重复序列(TTAGGG)n及一些结合蛋白组成，在染色体的定位、复制、保护和控制细胞生长寿命等方面起重要作用，并与细胞凋亡密切相关[2]. 端粒酶(Telomerase)是一种核糖核蛋白，它通过不断合成端粒重复序列添加至染色体末端，维持染色体稳定. Bcl-2(B-cell lymphoma/leukemia-2)基因是一种癌基因，可抑制多种因素引起的细胞凋亡，Bcl-2蛋白高表达是端粒酶激活的途径之一[3]. 我们旨在探讨端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸(ASODN-t)诱导肝癌细胞凋亡[4]，抑制端粒酶活性，从而抑制肝癌细胞的生长，为肝癌基因治疗提供依据.
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1 材料和方法
1.1 材料 肝癌细胞株SMMC-7721引自中国科学院上海细胞生物研究所细胞库，实验用对数生长期细胞 . 端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸(ASODN-t)及无关寡聚核苷酸(N-ODN)由上海生工生物工程公司合成，全硫代修饰. ASODN-t序列为5＇CTCAGTTAGGGTTAGACA3＇，N-ODN为5＇CATTTCTTGCTCTCCACG3＇，经微机检索与人类基因无同源性. 四氮甲唑蓝(MTT)，十二烷基硫酸钠(SDS)购自上海生工生物工程公司，端粒酶活性检测试剂盒购自华美生物工程公司.
1.2 方法 对细胞抑制作用的观察，取2×107/L肝癌细胞接种于96孔的细胞培养板中，每孔100μL，设3个复孔. 分别加入ASODN-t，调节浓度使ASODN-t终浓度分别为1，2，3，4，5μmol·L-1，N-ODN的终浓度为3μmol·L-1，培养24，48，72，96h，于结束前4h加入5g/L MTT 20μL，继续培养4h，再加入SDS溶液100μL，终止反应. 37℃培养箱过夜，用酶联免疫检测仪检测各孔在波长570nm的吸光度A值. 在培养状态下，用倒置显微镜观察细胞生长状况及形态学改变，并将5μmol·L-1的ASODN-t处理3d的细胞在荧光显微镜下观察凋亡细胞的形态.
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1.2.1 DNA抽提及电泳 将1×109/L肝癌细胞经5μmol·L-1 ASODN-t处理3d，然后把细胞离心，PBS清洗1次，酒精固定过夜，加裂解液及蛋白酶K，37℃摇床摇动2h，用等体积苯酚、氯仿、异戊醇各抽提一次，上清中加入1/10体积3mol·L-1醋酸钠和两倍体积冷乙醇，于-20℃过夜，于-10℃ 12000r/min离心10min收集沉淀，加入TE缓冲液，取抽提好的DNA 5μL，在20g·L-1琼脂糖凝胶，80V电压条件下，电泳3h，紫外光透射仪下观察电泳条带并拍照.
1.2.2 流式细胞仪分析 将1×109/L肝癌细胞与5μmol·L-1 ASODN-t共同孵育3d，PBS清洗2次，加无水乙醇固定24h，随后清洗细胞，与含有10g·L-1 RNA酶的Tris-HCl缓冲液(pH=7.4)共同孵育10min，碘化丙啶DNA染色，然后上机检测.
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1.2.3 端粒酶活性测定 取1×109/L肝癌细胞，与5μmol·L-1的ASODN-t共同孵育3d，PBS溶液洗1次，4℃ 10000r/min离心1min，沉淀加入150μL洗液洗涤，离心1min，弃洗液，加50μL裂解液，悬浮、混匀，置冰浴30min，4℃ 14000r/min离心20min，取上清2μL做TRAP反应模板. 取反应管，各加入45μL反应混合物，加入2μL已处理的标本，混匀，加入30μL液体石蜡，置25℃水浴保温30min，在PCR仪上循环，94℃ 120s，94℃ 30s，48℃ 30s; 72℃ 90s；72℃ 300s循环35次. 循环结束后，在微孔板各孔中加入杂交反应液，再加入扩增产物25μL混匀，设立阴阳及空白对照，置37℃恒温反应60min. 然后加入显色剂，37℃避光显色10min，加入终止液，终止反应. 在波长450nm读取A(OD)值.
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2 结果
不同浓度ASODN-t与2×107/L肝癌细胞共同孵育后，细胞生长受到抑制，这一抑制作用随浓度的升高及作用时间的延长而加强. N-ODN对肝癌细胞则无作用. 在倒置显微镜下可见N-ODN作用的细胞及不加药组细胞呈上皮型贴壁生长，细胞轮廓清楚，细胞间结构紧密，细胞生长旺盛；而ASODN-t组细胞有部分变圆浮起，细胞间接触变松，增殖减慢，细胞中颗粒增多，随药物浓度增高，可见细胞周围碎片增多，并将5μmol·L-1 ASODN-t处理3d的细胞在荧光显微镜下进行观察，细胞核染色质深染，聚积于核膜下呈新月形，膜突起呈小泡样，小泡脱落形成含核小体片段的凋亡小体. 而N-ODN作用的细胞及不加药细胞无明显形态学变化见.
2.1 DNA电泳 5μmol·L-1 ASODN-t作用3d后，肝癌细胞DNA电泳呈明显凋亡带，对照组则无凋亡带.
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2.2 流式细胞仪分析 流式细胞仪检测5μmol·L-1 ASODN-t作用3d的肝癌细胞在G1期前出现亚二倍体凋亡峰，对照组未见凋亡峰.
2.3 端粒酶活性 5μmol·L-1 ASODN-t作用3d后，肝癌细胞端粒酶活性明显受到抑制(A∶0.06)，不加药的肝癌细胞及N-ODN作用的细胞端粒酶活性很高(A∶0.13，0.14).
3 讨论
细胞凋亡有其独特的形态和生化特征[5]. 形态学表现为细胞体积小，胞质收缩或出现空泡，细胞核固缩，出现凋亡小体. 分子水平上发生细胞核DNA的降解，这是由于细胞内Ca2+和Mg2+依赖性核酸内切酶被激活的缘故[6]. 内切酶切割所产生的最小DNA片段长度为180bp～200bp[7]，其余的DNA片段长度为180bp～200bp的倍数(寡聚体)[8]，经琼脂糖凝胶电泳分离后表现为特征性的DNA梯形[9]. 细胞凋亡时，细胞的DNA裂解[10]，在流式细胞仪上呈现亚二倍体凋亡峰[11].
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端粒酶RNA组份中含有与端粒DNA序列互补的模板序列[12]，针对该模板序列设计的反义核苷酸，可阻断其模板作用从而抑制端粒酶合成端粒序列[13]. Feng et al[14]1995年首先研究发现人反义端粒酶DNA可抑制肿瘤细胞的端粒酶活性并导致细胞死亡. Mata et al[15]用含有端粒重复序列为5＇￣(TTAGGG)n￣3＇(n=2，3，4)的六聚亚磷酸硫代寡核苷酸(PS-OND)进行体内外试验，PS-ODN与Burkitt's淋巴瘤细胞株(OMA-BL1)共孵育时，能抑制后者的端粒酶活性，诱导细胞凋亡，而对照组无此效应. 作者通过ASODN-t与N-ODN分别作用于肝癌细胞研究，发现ASODN-t能明显抑制肿瘤细胞生长，诱导凋亡，抗肿瘤活性呈剂量依赖性，抑制端粒酶活性，对照组则无此作用. 端粒、端粒酶在恶性肿瘤中发生异常[16]，端粒酶在肿瘤细胞永生化中起重要作用[17]，因此以端粒酶为靶基因的治疗研究[18]，为设计抗肿瘤药物提供新目标[19]，为肿瘤的基因治疗开辟了新途径[20-22].Bcl-2是细胞凋亡调节的重要基因[23，24]，它通过调节细胞凋亡在肝癌发生中起重要作用[25，26]. 肝癌发生发展过程中端粒酶被激活的机制目前尚不清楚[27]，Mandal et al[28]用含人Bcl-2的质粒转染HeLa细胞和人结肠DiFi细胞系，发现转染阳性HeLa细胞和DiFi细胞的端粒酶活性分别升高5～10倍和8～12倍. 说明Bcl-2蛋白的过度表达是端粒酶激活的重要途径之一. 凋亡与端粒酶激活二者的关系尚需进一步研究. 本实验表明ASODN-t能诱导肝癌细胞凋亡，抑制端粒酶活性，抑制端粒合成端粒，从而抑制肝癌细胞的生长，说明端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸能有效地抑制肿瘤细胞的生长，为抗端粒酶的肿瘤基因治疗提供了实验基础. 绝大多数正常体细胞缺乏端粒酶活性，应用此药物，可避免治疗的副作用，增强治疗的特异性，应进一步探索抗端粒酶药物的作用机制，使高效抑制剂早日用于临床[15,29].
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4 参考文献
1 Muller M, Strand S, Hug H,, Heinemann EM, Walczak H, Hofmann WJ, Stremmel W, Krammer PH, Galle PR. Drug-induced apoptosis
in hepatoma cells is mediated by the CD95 (APO-1/Fas) receptor/ligand system and involves activation of wild-type p53.
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2 吴翔，杨光彩. 人端粒酶与肿瘤的关系及测定方法. 国外医学分子生物学分册，1998；20：55-59
, 百拇医药
3 冯德云，郑晖，程瑞雪，傅春燕. 肝细胞癌及癌旁肝组织中bcl-2和P53蛋白表达与端粒酶活性的相关性研究. 临床与实验病理学杂志，1999；15：287-289
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cell carcinoma. Cancer, 1999;85:919-924
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cells lacking telomerase RNA. Cell, 1997;91:25-34
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9 Jong HS, Park YI, Kim S, Sohn JH, Kang SH, Song SH, Bang YJ, Kim NK. Up-Regulation of human telomerase catalytic
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subunit during gastric carcinogenesis. Cancer, 1999;86:559-565
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mRNA expression in soft tissue tumors: correlation with grade, histology and proliferative activity.
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14 Feng J, Funk WD, Wang SS, Weinrich SL, Avilion AA, Chiu CP, Adams RR, Chang E, Allsopp RC, Yu J, Le S, West MD, Harley
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26 赵万洲，张洪杰，韩锐. 端粒酶活性调节与端粒酶抑制剂的研究. 中华肿瘤杂志，1999；21：156-158
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27 王升启，高蓉，维尼热·阿布利兹，朱宝珍，邢瑞云. 人肝癌细胞中端粒酶RNA的克隆及序列分析. 军事医学科学院院刊，1998；22：174-176
28 Mandal M, Kumar R. Bcl-2 modulates telomerase activity. J Biol Chem, 1997;272:14183-14187
29 Holt SE, Wright WE, Shay JW. Regulation of telomerase activity in immortal cell lines. Mol Cell Biol, 1996;16:2932-2939, 百拇医药(许兰涛 马 力)
项目负责人 许兰涛兰州医学院第二附属医院消化科 甘肃省兰州市 730030
收稿日期 2000-03-04 接收日期 2000-04-10
Subject headings telomerase; liver neoplasms; oligonucleotides, antisense; apoptosis; oncogenes; flow cytometry
主题词 端粒酶；肝肿瘤；寡核苷酸类，反义；细胞凋亡；癌基因；流式细胞术
许兰涛，马力. 端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸对肝癌细胞影响的研究. 世界华人消化杂志，2000；8(9)：1065-1066
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细胞凋亡(Apoptosis)是由基因控制的细胞主动死亡方式. 应用药物选择性诱导肿瘤细胞凋亡能改善肿瘤的预后[1]. 染色体端粒(Telomere)是位于细胞染色体末端的一种特殊结构，在人体细胞中，端粒由串联的短片段重复序列(TTAGGG)n及一些结合蛋白组成，在染色体的定位、复制、保护和控制细胞生长寿命等方面起重要作用，并与细胞凋亡密切相关[2]. 端粒酶(Telomerase)是一种核糖核蛋白，它通过不断合成端粒重复序列添加至染色体末端，维持染色体稳定. Bcl-2(B-cell lymphoma/leukemia-2)基因是一种癌基因，可抑制多种因素引起的细胞凋亡，Bcl-2蛋白高表达是端粒酶激活的途径之一[3]. 我们旨在探讨端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸(ASODN-t)诱导肝癌细胞凋亡[4]，抑制端粒酶活性，从而抑制肝癌细胞的生长，为肝癌基因治疗提供依据.
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1 材料和方法
1.1 材料 肝癌细胞株SMMC-7721引自中国科学院上海细胞生物研究所细胞库，实验用对数生长期细胞 . 端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸(ASODN-t)及无关寡聚核苷酸(N-ODN)由上海生工生物工程公司合成，全硫代修饰. ASODN-t序列为5＇CTCAGTTAGGGTTAGACA3＇，N-ODN为5＇CATTTCTTGCTCTCCACG3＇，经微机检索与人类基因无同源性. 四氮甲唑蓝(MTT)，十二烷基硫酸钠(SDS)购自上海生工生物工程公司，端粒酶活性检测试剂盒购自华美生物工程公司.
1.2 方法 对细胞抑制作用的观察，取2×107/L肝癌细胞接种于96孔的细胞培养板中，每孔100μL，设3个复孔. 分别加入ASODN-t，调节浓度使ASODN-t终浓度分别为1，2，3，4，5μmol·L-1，N-ODN的终浓度为3μmol·L-1，培养24，48，72，96h，于结束前4h加入5g/L MTT 20μL，继续培养4h，再加入SDS溶液100μL，终止反应. 37℃培养箱过夜，用酶联免疫检测仪检测各孔在波长570nm的吸光度A值. 在培养状态下，用倒置显微镜观察细胞生长状况及形态学改变，并将5μmol·L-1的ASODN-t处理3d的细胞在荧光显微镜下观察凋亡细胞的形态.
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1.2.1 DNA抽提及电泳 将1×109/L肝癌细胞经5μmol·L-1 ASODN-t处理3d，然后把细胞离心，PBS清洗1次，酒精固定过夜，加裂解液及蛋白酶K，37℃摇床摇动2h，用等体积苯酚、氯仿、异戊醇各抽提一次，上清中加入1/10体积3mol·L-1醋酸钠和两倍体积冷乙醇，于-20℃过夜，于-10℃ 12000r/min离心10min收集沉淀，加入TE缓冲液，取抽提好的DNA 5μL，在20g·L-1琼脂糖凝胶，80V电压条件下，电泳3h，紫外光透射仪下观察电泳条带并拍照.
1.2.2 流式细胞仪分析 将1×109/L肝癌细胞与5μmol·L-1 ASODN-t共同孵育3d，PBS清洗2次，加无水乙醇固定24h，随后清洗细胞，与含有10g·L-1 RNA酶的Tris-HCl缓冲液(pH=7.4)共同孵育10min，碘化丙啶DNA染色，然后上机检测.
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1.2.3 端粒酶活性测定 取1×109/L肝癌细胞，与5μmol·L-1的ASODN-t共同孵育3d，PBS溶液洗1次，4℃ 10000r/min离心1min，沉淀加入150μL洗液洗涤，离心1min，弃洗液，加50μL裂解液，悬浮、混匀，置冰浴30min，4℃ 14000r/min离心20min，取上清2μL做TRAP反应模板. 取反应管，各加入45μL反应混合物，加入2μL已处理的标本，混匀，加入30μL液体石蜡，置25℃水浴保温30min，在PCR仪上循环，94℃ 120s，94℃ 30s，48℃ 30s; 72℃ 90s；72℃ 300s循环35次. 循环结束后，在微孔板各孔中加入杂交反应液，再加入扩增产物25μL混匀，设立阴阳及空白对照，置37℃恒温反应60min. 然后加入显色剂，37℃避光显色10min，加入终止液，终止反应. 在波长450nm读取A(OD)值.
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2 结果
不同浓度ASODN-t与2×107/L肝癌细胞共同孵育后，细胞生长受到抑制，这一抑制作用随浓度的升高及作用时间的延长而加强. N-ODN对肝癌细胞则无作用. 在倒置显微镜下可见N-ODN作用的细胞及不加药组细胞呈上皮型贴壁生长，细胞轮廓清楚，细胞间结构紧密，细胞生长旺盛；而ASODN-t组细胞有部分变圆浮起，细胞间接触变松，增殖减慢，细胞中颗粒增多，随药物浓度增高，可见细胞周围碎片增多，并将5μmol·L-1 ASODN-t处理3d的细胞在荧光显微镜下进行观察，细胞核染色质深染，聚积于核膜下呈新月形，膜突起呈小泡样，小泡脱落形成含核小体片段的凋亡小体. 而N-ODN作用的细胞及不加药细胞无明显形态学变化见.
2.1 DNA电泳 5μmol·L-1 ASODN-t作用3d后，肝癌细胞DNA电泳呈明显凋亡带，对照组则无凋亡带.
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2.2 流式细胞仪分析 流式细胞仪检测5μmol·L-1 ASODN-t作用3d的肝癌细胞在G1期前出现亚二倍体凋亡峰，对照组未见凋亡峰.
2.3 端粒酶活性 5μmol·L-1 ASODN-t作用3d后，肝癌细胞端粒酶活性明显受到抑制(A∶0.06)，不加药的肝癌细胞及N-ODN作用的细胞端粒酶活性很高(A∶0.13，0.14).
3 讨论
细胞凋亡有其独特的形态和生化特征[5]. 形态学表现为细胞体积小，胞质收缩或出现空泡，细胞核固缩，出现凋亡小体. 分子水平上发生细胞核DNA的降解，这是由于细胞内Ca2+和Mg2+依赖性核酸内切酶被激活的缘故[6]. 内切酶切割所产生的最小DNA片段长度为180bp～200bp[7]，其余的DNA片段长度为180bp～200bp的倍数(寡聚体)[8]，经琼脂糖凝胶电泳分离后表现为特征性的DNA梯形[9]. 细胞凋亡时，细胞的DNA裂解[10]，在流式细胞仪上呈现亚二倍体凋亡峰[11].
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端粒酶RNA组份中含有与端粒DNA序列互补的模板序列[12]，针对该模板序列设计的反义核苷酸，可阻断其模板作用从而抑制端粒酶合成端粒序列[13]. Feng et al[14]1995年首先研究发现人反义端粒酶DNA可抑制肿瘤细胞的端粒酶活性并导致细胞死亡. Mata et al[15]用含有端粒重复序列为5＇￣(TTAGGG)n￣3＇(n=2，3，4)的六聚亚磷酸硫代寡核苷酸(PS-OND)进行体内外试验，PS-ODN与Burkitt's淋巴瘤细胞株(OMA-BL1)共孵育时，能抑制后者的端粒酶活性，诱导细胞凋亡，而对照组无此效应. 作者通过ASODN-t与N-ODN分别作用于肝癌细胞研究，发现ASODN-t能明显抑制肿瘤细胞生长，诱导凋亡，抗肿瘤活性呈剂量依赖性，抑制端粒酶活性，对照组则无此作用. 端粒、端粒酶在恶性肿瘤中发生异常[16]，端粒酶在肿瘤细胞永生化中起重要作用[17]，因此以端粒酶为靶基因的治疗研究[18]，为设计抗肿瘤药物提供新目标[19]，为肿瘤的基因治疗开辟了新途径[20-22].Bcl-2是细胞凋亡调节的重要基因[23，24]，它通过调节细胞凋亡在肝癌发生中起重要作用[25，26]. 肝癌发生发展过程中端粒酶被激活的机制目前尚不清楚[27]，Mandal et al[28]用含人Bcl-2的质粒转染HeLa细胞和人结肠DiFi细胞系，发现转染阳性HeLa细胞和DiFi细胞的端粒酶活性分别升高5～10倍和8～12倍. 说明Bcl-2蛋白的过度表达是端粒酶激活的重要途径之一. 凋亡与端粒酶激活二者的关系尚需进一步研究. 本实验表明ASODN-t能诱导肝癌细胞凋亡，抑制端粒酶活性，抑制端粒合成端粒，从而抑制肝癌细胞的生长，说明端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸能有效地抑制肿瘤细胞的生长，为抗端粒酶的肿瘤基因治疗提供了实验基础. 绝大多数正常体细胞缺乏端粒酶活性，应用此药物，可避免治疗的副作用，增强治疗的特异性，应进一步探索抗端粒酶药物的作用机制，使高效抑制剂早日用于临床[15,29].
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4 参考文献
1 Muller M, Strand S, Hug H,, Heinemann EM, Walczak H, Hofmann WJ, Stremmel W, Krammer PH, Galle PR. Drug-induced apoptosis
in hepatoma cells is mediated by the CD95 (APO-1/Fas) receptor/ligand system and involves activation of wild-type p53.
J Clin Invest, 1997;99:403-413
2 吴翔，杨光彩. 人端粒酶与肿瘤的关系及测定方法. 国外医学分子生物学分册，1998；20：55-59
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3 冯德云，郑晖，程瑞雪，傅春燕. 肝细胞癌及癌旁肝组织中bcl-2和P53蛋白表达与端粒酶活性的相关性研究. 临床与实验病理学杂志，1999；15：287-289
4 候丽宏，孙秉中. 端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸对HL-60细胞生长的作用. 第四军医大学学报，1999；20：653-655
5 高善铃，钱素娟，刘巍. 胃癌细胞凋亡及相关基因的研究. 中国肿瘤临床，1999；26：6325
6 Rahat MA, Lahat N, Gazawi H, Resnick MB, Sova Y, Ben-Ari G, Cohen M, Stein A. Telomerase activity in patients with transitional
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, 百拇医药
7 Blasco MA, Lee HW, Hande MP, Samper E, Lansdorp PM, Depinho RA. Telomerase shortening and tumor formation by mouse
cells lacking telomerase RNA. Cell, 1997;91:25-34
8 Ramakrishnan S, Eppenberger U, Muller H, Shinkai Y, Narayanan R. Expression profile of the telomerase gene.
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