益肝煎剂对肝星状细胞增殖的影响
1白求恩国际和平医院干部一科 河北省石家庄市 050082
2河北医科大学第二医院消化内科 河北省石家庄市 050082
本课题为河北省中医局中西医结合基金资助项目, No. 200001
项目负责人 姚希贤白求恩国际和平医院干部一科 河北省石家庄市 050082
收稿日期 2001-02-15 接受日期 2001-02-18
主题词 肝星状细胞; 益肝煎剂; 增殖
, 百拇医药
唐有为, 姚希贤, 修贺明. 益肝煎剂对肝星状细胞增殖的影响. 世界华人消化杂志，2001；9(3)：347-348
鉴于肝纤维化、肝硬变出现蜘蛛痣、舌质青及肝脾大、门脉高压等瘀血征象，以活血化瘀为主兼益气疏肝健脾法治疗肝纤维化已成国内中医药学者的共识. 以活血化瘀药为主组方的益肝煎剂投产10多年来, 临床应用取得了良好疗效[1]. 益肝煎剂的主要成分是丹参、黄芪、当归、赤芍、水蛭等, 本研究所以往的研究表明本药具有良好的抗肝纤维化作用. 肝星状细胞(HSC)活化和增殖是肝纤维化形成的中心环节. 本研究拟探讨益肝煎剂对HSC增殖的影响, 为中药防治肝纤维化提供有效药物和理论依据.
1 材料和方法
1.1 材料 肝脏星状细胞系(CFSC)由美国Greenwel教授建立, 其表型为活化的HSC[2,3]. 细胞常规培养于含青霉素1×105U·L-1、链霉素100mg·L-1中, 在37℃, 5% CO2充分湿度条件下培养.
, 百拇医药
1.2 中药益肝煎剂的制备 益肝煎剂为河北省消化病研究所制剂室制备. 将益肝煎剂离心去渣, 先用1.2μm滤器去粗渣, 再依次用0.45μm和0.22μm滤器过滤除菌. -20℃保存备用.
1.3 MTT法测定益肝煎剂对HSC增殖的影响 培养的细胞长满单层后用2.5g·L-1胰蛋白酶消化后置10%小牛血清的RPMI1640培养液中, 调整细胞数为1×108·L-1, 以每孔100μL接种于96孔培养板, 预培养24h后进行实验. 实验设不同剂量组, 各加入益肝煎剂, 药物终浓度分别为144, 72, 36, 18, 9和4.5(g·L-1). 各组分设3个复孔. 药物加入后72h吸出培养液, 加入0.05%的MTT 100μL作用4h, 吸出培养液后加DMSO(二甲基亚砜)100μL显色. 用酶标仪测定OD值, 测定波长为570nm, 参考波长为630nm, 酶标仪所示OD值为OD570减去OD630, 以消除非特异性光吸收效应. 计算增殖率: 细胞增殖率(PR)=T/C×100%, 其中T为处理孔OD值, C为对照孔OD值.
, 百拇医药
1.4 直接细胞计数法观察益肝煎剂对HSC增殖影响的时效关系 取对数生长期的CFSC细胞, 用2.5g·L-1胰蛋白酶消化分离, 用含10%小牛血清的RPMI1640培养液调整细胞浓度为1×108·L-1, 每孔1mL加入24孔培养板内，预培养24h后进行实验. 正常对照组和益肝煎剂组(24h, 48h, 72h)各设3个复孔. 实验组各加益肝煎剂50μL(终浓度18g·L-1). 实验结束时进行细胞计数.
统计学处理 采用方差分析和t检验, 用SPSS软件分析.
2 结果
2.1 益肝煎剂对HSC增殖影响的量效关系 随着药物剂量的增加, 细胞的增殖受到抑制, 呈明显的剂量依赖性. 144, 72(g·L-1)剂量组作用强于36, 18, 9(g·L-1)剂量组, 当药物剂量为4.5g·L-1其抑制作用不明显(表1).
, 百拇医药
表1 益肝煎剂对HSC增殖的影响(x±s)
, 百拇医药
aP<0.05，bP<0.01vs 正常对照组, t检验.
2.2 益肝煎剂对HSC增殖影响的时效关系 益肝煎剂在终浓度18g·L-1下, 对HSC的增殖有明显的抑制作用. 48h抑制作用显著, 72h抑制作用达到高峰(P<0.01)(表2).
表2 益肝煎剂对HSC增殖影响的时效关系(×108·L-1) (x±s)
, 百拇医药
bP<0.01vs正常对照组, t检验.
3 讨论
近年国内外学者对肝纤维化的发病机制和治疗进行了不懈的探索[4-16]. 随着对肝纤维化机制认识的不断深入, 使肝纤维化的治疗成为可能, 但迄今为止西医尚乏有效治疗方法. 中医理论认为, 肝纤维化形成过程中,可以不同程度地存在气滞、血瘀, 随疾病发展, 有者兼脾虚、湿热或寒湿等, 但血瘀是肝纤维化的基本病机, 故其治疗在益气、疏肝健脾、软肝散结的同时, 离不开活血化瘀[17]. 肝纤维化是肝脏细胞外基质生成和降解失衡的结果[18-20]. 肝细胞、Kupffer细胞、内皮细胞等均参与肝纤维化形成, 但以HSC作用最为重要, 后者的激活、增殖是各种原因引起肝纤维化形成的中心环节[21], 有关HSC的研究业已成为肝纤维化研究的热点[22-28]. 抑制HSC的活化与增殖是抗肝纤维化的重要策略之一[29]. 本研究显示益肝煎剂对HSC增殖具有明显抑制作用, 且此作用随剂量的增加而增强; 同时还观察到益肝煎剂(终浓度18g·L-1)在不同的作用时间对HSC生长的影响是不同的, 在48h及72h对HSC增殖的抑制作用最强. 这可能是该方剂防治肝纤维化的主要机制之一.
, 百拇医药
4 参考文献
1 姚希贤, 傅玉玲, 李秀兰, 贾玉萍, 安智才, 张孝智. “益肝冲剂”治疗慢性肝炎324例的多中心疗效观察. 河北医学院学报,1989;10:231-233
2 朱永红, 胡大荣. 肝脏星形细胞系的建立及其应用. 世界华人消化杂志, 1999;7:348-349
3 向德栋, 李奇芬, 王宇明, 王雅凡. 维生素E乳剂对肝脏星状细胞Ⅲ型前胶原和MMP1 mRNA表达的影响. 世界华人消化杂志,1999;7:1085
4 Wu CH. Fibrodynamics—elucidation of the mechanisms and sites of liver fibrogenesis. World J Gastroenterol,1999;5:388-390
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5 Liu CH, Hu YY, Wang XL, Liu P, Xu LM. Effects of salvianolic acid-A on NIH/3T3 fibroblast proliferation, collagen synthesis and
gene expression. World J Gastroenterol, 2000;6:361-364
6 Wang X, Chen YX, Xu CF, Zhao GN, Huang YX, Wang QL. Relationship between tumor necrosis factor-α and liver fibrosis.
World J Gastroenterol, 1998;4:18
7 Dai WJ, Jiang HC. Advances in gene therapy of liver cirrhosis: a review. World J Gastroenterol, 2001;7:1-8
, http://www.100md.com
8 Huang X, Li DG, Wang ZR, Wei HS, Cheng JL, Zhan YT, Zhou X, Xu QF, Li X, Lu HM. Expression changes of activin A in
the development of hepatic fibrosis. World J Gastroenterol, 2001;7:37-41
9 Weng HL, Cai WM, Liu RH. Animal experiment and clinical study of effect of gamma-interferon on hepatic fibrosis.
World J Gastroenterol, 2001;7:42-48
10 Wang JY, Zhang QS, Guo JS, Hu MY. Effects of glycyrrhetinic acid on collagen metabolism of hepatic stellate cells at different
, 百拇医药
stages of liver fibrosis in rats. World J Gastroenterol, 2001;7:115-119
11 王宇, 高毅, 俞金龙, 黄宇琦, 蒋晓青. IFN-α对大鼠肝纤维化间质胶原酶基因表达的调控. 世界华人消化杂志，2001；9：20-23
12 吕鹏, 罗和生, 余保平. 大鼠肝纤维化模型中肝细胞凋亡及其调控基因的表达. 世界华人消化杂志，2001；9：165-169
13 顾生旺, 骆抗先, 章廉, 吴爱华, 何海棠, 翁介月. 慢性肝病胆小管增生与肝纤维化的关系. 世界华人消化杂志, 1999;7:845-847
14 陆伦根, 曾民德, 李继强, 邱德凯, 华静, 范竹萍. 肝星状细胞激活与ICAM-1的表达. 华人消化杂志, 1998;6:567-569
, 百拇医药
15 黄新, 李定国, 王志荣, 魏红山, 程计林, 展玉涛, 徐芹芳, 陆汉明. 卵泡抑素对肝纤维化大鼠细胞增殖及激活素A的影响.
世界华人消化杂志，2000;8:993-997
16 阳学风, 曾明新, 张明亮, 刘金法. 马洛替酯抑制肝纤维化的实验与临床研究. 世界华人消化杂志, 1999;7:224-226
17 张荣华, 周子成, 洪多伦, 艾九松. 虫草菌丝抗肝纤维化的实验研究. 中西医结合肝病杂志, 1999;9:23-25
18 姚希贤. 肝纤维化的诊断和治疗. 世界华人消化杂志，2000;8:681-689
19 王福生, 吴祖泽. 肝纤维化和肝硬变基因治疗的研究现状. 世界华人消化杂志，2000;8:371-373
, http://www.100md.com
20 唐有为. 细胞外基质降解系统与肝纤维化. 医学综述, 2000;6:209-210
21 Friedman SL. Molecular mechanisms of hepatic fibrosis and principles of therapy. J Gastroenterol, 1997;32:424-430
22 朱永红, 胡大荣, 聂青和, 刘国栋, 谭朝霞. 人肝脏星形细胞培养激活及其c-fos,c-jun的表达. 世界华人消化杂志， 2000;8:299-302
23 唐有为, 姚希贤. 肝癌细胞对星状细胞活化的调控作用. 世界华人消化杂志，2001；9：202-204
24 Worman HJ, Lin F, Mamiya N, Mustacchia PJ. Molecular biology and the diagnosis and treatment of liver diseases.
, http://www.100md.com
World J Gastroenterol, 1998;4:185-191
25 Yu YY, Si CW, Tian XL, He Q, Xue HP. Effect of cytokines on liver necrosis. World J Gastroenterol, 1998;4:311-313
26 Lu LG, Zeng MD, Li JQ, Hua J, Fan JG, Fan ZP, Qiu DK. Effect of lipid on proliferation and activation of rat hepatic stellate cells
(Ⅰ). World J Gastroentero, 1998;4:497-499
27 王晓玲, 刘平, 刘成海, 刘成. 拆方扶正化瘀方对肝细胞及肝星状细胞功能的影响. 世界华人消化杂志, 1999;7:663-665
28 陆伦根, 曾民德, 李继强, 范建高, 华静, 范竹萍, 戴宁, 邱德凯. 花生四烯酸和亚油酸对肝星状细胞增殖的影响.
世界华人消化杂志, 1999;7:10-12
29 Brenner DA. Therapeutic strategy for liver fibrosis. J Gastroenterol Hepatol, 1999;14(Suppl):A279-A280, 百拇医药(唐有为1 姚希贤2 修贺明1 )
2河北医科大学第二医院消化内科 河北省石家庄市 050082
本课题为河北省中医局中西医结合基金资助项目, No. 200001
项目负责人 姚希贤白求恩国际和平医院干部一科 河北省石家庄市 050082
收稿日期 2001-02-15 接受日期 2001-02-18
主题词 肝星状细胞; 益肝煎剂; 增殖
, 百拇医药
唐有为, 姚希贤, 修贺明. 益肝煎剂对肝星状细胞增殖的影响. 世界华人消化杂志，2001；9(3)：347-348
鉴于肝纤维化、肝硬变出现蜘蛛痣、舌质青及肝脾大、门脉高压等瘀血征象，以活血化瘀为主兼益气疏肝健脾法治疗肝纤维化已成国内中医药学者的共识. 以活血化瘀药为主组方的益肝煎剂投产10多年来, 临床应用取得了良好疗效[1]. 益肝煎剂的主要成分是丹参、黄芪、当归、赤芍、水蛭等, 本研究所以往的研究表明本药具有良好的抗肝纤维化作用. 肝星状细胞(HSC)活化和增殖是肝纤维化形成的中心环节. 本研究拟探讨益肝煎剂对HSC增殖的影响, 为中药防治肝纤维化提供有效药物和理论依据.
1 材料和方法
1.1 材料 肝脏星状细胞系(CFSC)由美国Greenwel教授建立, 其表型为活化的HSC[2,3]. 细胞常规培养于含青霉素1×105U·L-1、链霉素100mg·L-1中, 在37℃, 5% CO2充分湿度条件下培养.
, 百拇医药
1.2 中药益肝煎剂的制备 益肝煎剂为河北省消化病研究所制剂室制备. 将益肝煎剂离心去渣, 先用1.2μm滤器去粗渣, 再依次用0.45μm和0.22μm滤器过滤除菌. -20℃保存备用.
1.3 MTT法测定益肝煎剂对HSC增殖的影响 培养的细胞长满单层后用2.5g·L-1胰蛋白酶消化后置10%小牛血清的RPMI1640培养液中, 调整细胞数为1×108·L-1, 以每孔100μL接种于96孔培养板, 预培养24h后进行实验. 实验设不同剂量组, 各加入益肝煎剂, 药物终浓度分别为144, 72, 36, 18, 9和4.5(g·L-1). 各组分设3个复孔. 药物加入后72h吸出培养液, 加入0.05%的MTT 100μL作用4h, 吸出培养液后加DMSO(二甲基亚砜)100μL显色. 用酶标仪测定OD值, 测定波长为570nm, 参考波长为630nm, 酶标仪所示OD值为OD570减去OD630, 以消除非特异性光吸收效应. 计算增殖率: 细胞增殖率(PR)=T/C×100%, 其中T为处理孔OD值, C为对照孔OD值.
, 百拇医药
1.4 直接细胞计数法观察益肝煎剂对HSC增殖影响的时效关系 取对数生长期的CFSC细胞, 用2.5g·L-1胰蛋白酶消化分离, 用含10%小牛血清的RPMI1640培养液调整细胞浓度为1×108·L-1, 每孔1mL加入24孔培养板内，预培养24h后进行实验. 正常对照组和益肝煎剂组(24h, 48h, 72h)各设3个复孔. 实验组各加益肝煎剂50μL(终浓度18g·L-1). 实验结束时进行细胞计数.
统计学处理 采用方差分析和t检验, 用SPSS软件分析.
2 结果
2.1 益肝煎剂对HSC增殖影响的量效关系 随着药物剂量的增加, 细胞的增殖受到抑制, 呈明显的剂量依赖性. 144, 72(g·L-1)剂量组作用强于36, 18, 9(g·L-1)剂量组, 当药物剂量为4.5g·L-1其抑制作用不明显(表1).
, 百拇医药
表1 益肝煎剂对HSC增殖的影响(x±s)
| 组别 | 药物浓度(g·L-1) | OD值 | 增殖率(%) |
| 益肝煎剂组 | 144 | 0.08±0.02b | 21.62 |
| 72 | 0.15±0.04b | 40.54 | |
| 36 | 0.20±0.03a | 54.05 | |
| 18 | 0.17±0.02a | 45.95 | |
| 9 | 0.19±0.05a | 51.35 | |
| 4.5 | 0.31±0.04 | 83.78 | |
| 正常对照组 | 0.37±0.03 |
, 百拇医药
aP<0.05，bP<0.01vs 正常对照组, t检验.
2.2 益肝煎剂对HSC增殖影响的时效关系 益肝煎剂在终浓度18g·L-1下, 对HSC的增殖有明显的抑制作用. 48h抑制作用显著, 72h抑制作用达到高峰(P<0.01)(表2).
表2 益肝煎剂对HSC增殖影响的时效关系(×108·L-1) (x±s)
| 组别 | 24h | 48h | 72h |
| 正常对照组 | 1.440±0.124 | 2.288±0.178 | 2.335±0.146 |
| 益肝煎剂组 | 1.203±0.112 | 1.258±0.098b | 1.359±0.079b |
, 百拇医药
bP<0.01vs正常对照组, t检验.
3 讨论
近年国内外学者对肝纤维化的发病机制和治疗进行了不懈的探索[4-16]. 随着对肝纤维化机制认识的不断深入, 使肝纤维化的治疗成为可能, 但迄今为止西医尚乏有效治疗方法. 中医理论认为, 肝纤维化形成过程中,可以不同程度地存在气滞、血瘀, 随疾病发展, 有者兼脾虚、湿热或寒湿等, 但血瘀是肝纤维化的基本病机, 故其治疗在益气、疏肝健脾、软肝散结的同时, 离不开活血化瘀[17]. 肝纤维化是肝脏细胞外基质生成和降解失衡的结果[18-20]. 肝细胞、Kupffer细胞、内皮细胞等均参与肝纤维化形成, 但以HSC作用最为重要, 后者的激活、增殖是各种原因引起肝纤维化形成的中心环节[21], 有关HSC的研究业已成为肝纤维化研究的热点[22-28]. 抑制HSC的活化与增殖是抗肝纤维化的重要策略之一[29]. 本研究显示益肝煎剂对HSC增殖具有明显抑制作用, 且此作用随剂量的增加而增强; 同时还观察到益肝煎剂(终浓度18g·L-1)在不同的作用时间对HSC生长的影响是不同的, 在48h及72h对HSC增殖的抑制作用最强. 这可能是该方剂防治肝纤维化的主要机制之一.
, 百拇医药
4 参考文献
1 姚希贤, 傅玉玲, 李秀兰, 贾玉萍, 安智才, 张孝智. “益肝冲剂”治疗慢性肝炎324例的多中心疗效观察. 河北医学院学报,1989;10:231-233
2 朱永红, 胡大荣. 肝脏星形细胞系的建立及其应用. 世界华人消化杂志, 1999;7:348-349
3 向德栋, 李奇芬, 王宇明, 王雅凡. 维生素E乳剂对肝脏星状细胞Ⅲ型前胶原和MMP1 mRNA表达的影响. 世界华人消化杂志,1999;7:1085
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, 百拇医药
5 Liu CH, Hu YY, Wang XL, Liu P, Xu LM. Effects of salvianolic acid-A on NIH/3T3 fibroblast proliferation, collagen synthesis and
gene expression. World J Gastroenterol, 2000;6:361-364
6 Wang X, Chen YX, Xu CF, Zhao GN, Huang YX, Wang QL. Relationship between tumor necrosis factor-α and liver fibrosis.
World J Gastroenterol, 1998;4:18
7 Dai WJ, Jiang HC. Advances in gene therapy of liver cirrhosis: a review. World J Gastroenterol, 2001;7:1-8
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8 Huang X, Li DG, Wang ZR, Wei HS, Cheng JL, Zhan YT, Zhou X, Xu QF, Li X, Lu HM. Expression changes of activin A in
the development of hepatic fibrosis. World J Gastroenterol, 2001;7:37-41
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10 Wang JY, Zhang QS, Guo JS, Hu MY. Effects of glycyrrhetinic acid on collagen metabolism of hepatic stellate cells at different
, 百拇医药
stages of liver fibrosis in rats. World J Gastroenterol, 2001;7:115-119
11 王宇, 高毅, 俞金龙, 黄宇琦, 蒋晓青. IFN-α对大鼠肝纤维化间质胶原酶基因表达的调控. 世界华人消化杂志，2001；9：20-23
12 吕鹏, 罗和生, 余保平. 大鼠肝纤维化模型中肝细胞凋亡及其调控基因的表达. 世界华人消化杂志，2001；9：165-169
13 顾生旺, 骆抗先, 章廉, 吴爱华, 何海棠, 翁介月. 慢性肝病胆小管增生与肝纤维化的关系. 世界华人消化杂志, 1999;7:845-847
14 陆伦根, 曾民德, 李继强, 邱德凯, 华静, 范竹萍. 肝星状细胞激活与ICAM-1的表达. 华人消化杂志, 1998;6:567-569
, 百拇医药
15 黄新, 李定国, 王志荣, 魏红山, 程计林, 展玉涛, 徐芹芳, 陆汉明. 卵泡抑素对肝纤维化大鼠细胞增殖及激活素A的影响.
世界华人消化杂志，2000;8:993-997
16 阳学风, 曾明新, 张明亮, 刘金法. 马洛替酯抑制肝纤维化的实验与临床研究. 世界华人消化杂志, 1999;7:224-226
17 张荣华, 周子成, 洪多伦, 艾九松. 虫草菌丝抗肝纤维化的实验研究. 中西医结合肝病杂志, 1999;9:23-25
18 姚希贤. 肝纤维化的诊断和治疗. 世界华人消化杂志，2000;8:681-689
19 王福生, 吴祖泽. 肝纤维化和肝硬变基因治疗的研究现状. 世界华人消化杂志，2000;8:371-373
, http://www.100md.com
20 唐有为. 细胞外基质降解系统与肝纤维化. 医学综述, 2000;6:209-210
21 Friedman SL. Molecular mechanisms of hepatic fibrosis and principles of therapy. J Gastroenterol, 1997;32:424-430
22 朱永红, 胡大荣, 聂青和, 刘国栋, 谭朝霞. 人肝脏星形细胞培养激活及其c-fos,c-jun的表达. 世界华人消化杂志， 2000;8:299-302
23 唐有为, 姚希贤. 肝癌细胞对星状细胞活化的调控作用. 世界华人消化杂志，2001；9：202-204
24 Worman HJ, Lin F, Mamiya N, Mustacchia PJ. Molecular biology and the diagnosis and treatment of liver diseases.
, http://www.100md.com
World J Gastroenterol, 1998;4:185-191
25 Yu YY, Si CW, Tian XL, He Q, Xue HP. Effect of cytokines on liver necrosis. World J Gastroenterol, 1998;4:311-313
26 Lu LG, Zeng MD, Li JQ, Hua J, Fan JG, Fan ZP, Qiu DK. Effect of lipid on proliferation and activation of rat hepatic stellate cells
(Ⅰ). World J Gastroentero, 1998;4:497-499
27 王晓玲, 刘平, 刘成海, 刘成. 拆方扶正化瘀方对肝细胞及肝星状细胞功能的影响. 世界华人消化杂志, 1999;7:663-665
28 陆伦根, 曾民德, 李继强, 范建高, 华静, 范竹萍, 戴宁, 邱德凯. 花生四烯酸和亚油酸对肝星状细胞增殖的影响.
世界华人消化杂志, 1999;7:10-12
29 Brenner DA. Therapeutic strategy for liver fibrosis. J Gastroenterol Hepatol, 1999;14(Suppl):A279-A280, 百拇医药(唐有为1 姚希贤2 修贺明1 )