大鼠肝脏缺血再灌注损伤中NO，TXA2/PGI2的作用
1中国人民解放军海军总医院肝胆外科北京市100037
2中国人民解放军总医院外科教研室北京市100853
项目负责人 张志成中国人民解放军海军总医院肝胆外科北京市100037
收稿日期2000-11-15接受日期2000-11-16
主题词 肝/病理学；再灌注损伤；一氧化氮/血液；血栓烷A2/代谢；依前列醇/代谢
张志成, 冀振华, 黄志强, 孟宪钧. 大鼠肝脏缺血再灌注损伤中NO，TXA2/PGI2的作用. 世界华人消化杂志，2001；9(4)：452-453
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我们通过大鼠肝脏缺血再灌注损伤模型，对血管活性物质一氧化氮(nitric oxide, NO)以及血栓素A2/前列环素(TXA2/PGI2)的作用进行了探讨.
1 材料和方法
1.1 模型制备 健康Wistar大鼠，雄性，体质量300g±30g (军事医学科学院实验动物中心提供)，10g·L-1戊巴比妥钠40mg·kg-1, ip麻醉，腹中线切口，小动脉夹夹闭肝动脉、门静脉及胆总管45min，解除阻断，肝脏缺血再灌注损伤模型制成，分别于再灌注不同时间点采取标本. 手术对照组仅开腹采取标本，不做阻断. 将实验动物随机分为5组，每组6只动物. 手术对照组；肝脏缺血45min再灌注0h组；肝脏缺血45min再灌注1h组；肝脏缺血45min再灌注3h组；肝脏缺血45min再灌注5h组. 在再灌注同时自大鼠尾静脉注入左旋精氨酸(L-Arg)200mg·kg-1，再灌注3h组取标本检测NO及ALT含量.
, 百拇医药
1.2 测定指标 ①肝静脉血NO含量：肝素处理的注射器自肝上下腔静脉采血1mL，鲁米诺化学发光测定[1]. ②肝组织TXA2/PGI2含量：肝组织液氮速冻后研碎，放免法测定TXB2及6-keto-PGF1,α作为判断TXA2/PGI2的指标[2]. ③血液谷丙转泵ALT)：抽取心脏的血液1mL，酶偶联连续检测法测定.
统计学处理结果以平均数±标准差表示(x±s)，在计算机上进行F检验.
2 结果
肝静脉血NO含量再灌注0h(n=6)为(2.03±0.10)μmol·L-1，手术对照组为(5.45±0.43)μmol·L-1(P<0.01). 再灌注1，3，5h分别为(2.80±0.25)，(4.14±0.20)，(4.85±0.25)μmol·L-1，进一步上升(P<0.01). 肝组织TXA2/PGI2含量也有明显变化见表1. 治疗后NO升高而ALT下降见表2.
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表1 缺血再灌注肝组织TXB2，6-Keto-PGF1α及其比值的变化
, 百拇医药
bP<0.01, vs 对照组.
表2 精氨酸治疗缺血再灌注对NO及ALT的影响(n=6, x±s)
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aP<0.05， bP<0.01， vs 非治疗组.
3 讨论
近年来，人们认为肝脏可被当作一重要循环器官来对待. 肝脏缺血再灌注损伤，缺血对肝细胞的影响在一定时限内可能不是主要的，而肝脏微循环的改变以及肝血窦内皮细胞的损伤，可能是造成肝损害的重要因素和关键环节，可做为治疗的靶向[3-5,23,24]. 1987年Palmer et al[6，10,11]证实内皮衍生舒张因子(EDRF)与NO为同一物质以来，NO的作用受到广泛重视. 内源性的NO具有强大的舒张血管，抑制血小板聚集抗血栓形成以及抑制血平滑肌增殖等作用[7，12，22]. TXA2主要由内皮细胞生成，有较强的扩张血管及抑制血小板积聚的作用，生理状态下，TXA2及PGI2两者保持一定的比例，是维持血液循环稳定的因素之一[8，9，13，25-29]. 本结果显示，大鼠肝脏血流阻断45min后，肝循环NO含量明显降低(P<0.01)，阻断解除后仍不能尽快恢复(P<0.001)，提示作为血管舒张因子和抑制血小板集聚因子的NO含量的降低是肝脏微循环收缩及血管内微血栓形成再灌注后血流不能尽快恢复的重要因素之一. 一些学者在心肌、胃肠等脏器的缺血再灌注损伤研究中，亦发现NO生成减少，与我们的结果是一致的[7,16-18]. 我们在检测NO的同时，亦检测了肝组织TXA2及PGI2的含量，结果显示TXA2升高明显且持续较长时间(P<0.01)，PGI2虽也有所升高，但很快恢复正常，导致TXA2/PGI2比值持续升高(P<0.01)，从而加剧肝循环收缩，血小板聚集，微血栓形成，这与NO含量减少的作用是协同的.
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形态学研究证实[14,15]，肝脏微循环在再灌注早期处于收缩状态，内皮细胞肿胀，血管内微血栓形成，导致再灌注早期的无复流现象. 调节微循环的物质如内皮素，降钙素基因相关肽的研究证实[10,19,20]，通过改善肝脏血液循环而减轻肝脏的缺血再灌注损伤. 基于改善肝脏微循环的考虑，我们在再灌注的同时，提供NO生成底物左旋精氨酸，发现可以显著提高再灌注时NO的含量，同时检测了血中ALT含量，显示与非治疗组比较有明显降低，提示有一定保护作用(P<0.01). 实验证实[8,9,21]，TXA2合成酶抑制剂及TXA2受体拮抗剂均能减少肝细胞缺血再灌注后微血栓形成，从而保护肝细胞，增加肝细胞的ATP水平，起到肝细胞保护作用. 本结果显示，血管活性物质NO，TX2/PGI2参与了肝脏缺血再灌注损伤. 在肝脏缺血再灌注损伤早期，应用具有舒张血管及抗血小板聚集血栓形成的制剂，对减轻再灌注损伤可望起到有益的作用，值得进一步研究.
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4 参考文献
1 王成彬，田亚平，沈文梅. 自由基生命科学进展. 第三集. 北京：原子能出版社，1995：159-163
2 李振甲，王仁芳. 激素的放射免疫分析. 第1版. 北京：科学技术文献出版社，1985：138
3 Adkinson D, Hoellwarth ME, Benoit JN. Role of free radicals in ischemia-reperfusion injury to the liver. Acta Physiol Scand,1986;548(Suppl):101-107
4 Satoshi K, Tohru S, Kimiro T. Mannosylated superoxide dismutase inhibits hepatic reperfusion injury in rats. J Surg Res,1996;60:36-40
, 百拇医药
5 Caldwell-Kenkel JC, Currin RT, Tanaka Y. Reperfusion injury to endothelial cells after cold ischemia storage of rat livers.
Hepatology, 1989;10:292-299
6 Palmer RMJ, Ferrige AG, Moncada A. Nitric oxide release acounts for the biological activity of endothelium derived relaxing
factor. Nature, 1987;327:524-529
7 Frederick LK, Tadenxa M. Nitric oxide-biochemistry, pathophysiology and detection. Am J Clin Pathol, 1993;100:567-575
, http://www.100md.com
8 Bush LR, Campbell WB, Buja LM. Effects of the selective thromboxane synthetase inhimitor dazoxiben on varations in cyclic blood
flow in stenosed cannine coronary arteries. Circulation, 1984;69:1161-1168
9 Sikujara O, Moden M, Toyoshima K. Cytoprotective effect of prostaglandin I2 on ischemia/reperfusion hepatic cell
injury. Transplantation, 1983;36:238-243
, http://www.100md.com 10 唐朝枢. 内皮素对缺氧肝脏的损伤作用及CGRP的拮抗效应. 北京医科大学学报，1990；22：6-9
11 Igarro LJ, Buga CM, Wood KS. Endothelium-derived relaxing factor produced and released from artery and vein is nitric oxide.
Proc Natl Acad Sci USA, 1987;84:9265-9270
12 陈玺华, 李正中, 鲍民生, 郑绘霞. 一氧化氮在大鼠肝缺血再灌注损伤中的作用. 世界华人消化杂志, 1999;7:295-297
13 王兴鹏, 徐家裕, 袁耀宗, 翟祖康. 川芎嗪对急性出血坏死性胰腺炎大鼠血浆血栓素、前列环素及氧自由基的影响.
, 百拇医药
新消化病学杂志, 1993;1:13-14
14 汪爽, 高毅, 詹兴海. 柴胡煎剂治疗肝脏缺血性损伤的形态学观察. 世界华人消化杂志， 2000;8:159-161
15 洪照友, 高毅, 詹兴海. 中药虎杖对大鼠肝脏缺血性损伤保护的形态学观察. 世界华人消化杂志， 2000;8:162-164
16 Paul CK, Rebecca AS. The emerging multifaceted role of nitric oxide. Ann Surg, 1995;221:220-235
17 Billiar TR. Nitric oxide novel biology with clinical relevance. Ann Surg, 1995;221:339-349
, 百拇医药
18 Salvador M, Annine H. The L-Arg inine-nitric oxide pathway. New Eng J Med, 1993;329:2002-2012
19 李继尧，王玲，张席锦. 降钙素基因相关肽对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的保护作用. 北京医科大学学报，1993；25：396-398
20 王玲女, 李仲孝, 李楠. 降钙素基因相关肽与消化系疾病临床研究进展. 新消化病学杂志, 1996;4(特刊5):233
21 刁同进, 姚晓平, 季兵, 杨甲梅, 吴孟超, 张绍庚. L-精氨酸在大鼠原位肝移植冷缺血再灌注损伤中的作用. 华人消化杂志, 1998;6:291-295
22 刁同进, 吴孟超，姚晓平. 一氧化氮与缺血再灌注损伤. 肝胆胰外科杂志，1999;11:219-221
, 百拇医药
23 张志成，黄志强，孟宪钧，王成彬，杨荣华. 肝硬变大鼠肝脏缺血再灌注损伤. 中华外科杂志，1997；35：753-755
24 王万铁, 林丽娜, 徐正介, 王卫, 李东. 内皮细胞功能变化在肝缺血再灌注中的意义及川芎嗪干预. 世界华人消化杂志, 1999;7:548
25 Welles SL, Shepro D, Hechtman HB. Eicosanoid modulation of stress fibers in cultured bovine aortic endothelial cells.
Inflammation, 1985;9:439-443
26 Ogletree ML, Heran CL, Harris DN. SQ28668, a platelet TXA2/PGH2 an tngonist inhibits thrombotic cyclic reductions in coronary
, 百拇医药
blood flow in anesthetized pigs. Thromb Hameostasis, 1985;54:28-32
27 Nakano H, Moden M, Umeshita K. Cytoprotective effect of prostaglandin I2 analogues on superoxide-induced hepatocyte
injury. Surgery, 1994;116:883-889
28 Hanazak K, Kuroda T, Haba Y. Protective effect of the thromoboxane A2 receptor antagonist ONO3708 on
ischemia-reperfusion injury in the dog liver. Surgery, 1994;116:896-903
29 Helling TS, Wogahn BM, Olson SA. The effect of prostaglandin E1 on liver adenine nucleotides and cytoplasimic enzymes in a
porcine model of nor mothermic hepatic ischemia. Hepatology, 1995;22:1554-1559, 百拇医药(张志成1 冀振华1 黄志强2 孟宪钧2 )
2中国人民解放军总医院外科教研室北京市100853
项目负责人 张志成中国人民解放军海军总医院肝胆外科北京市100037
收稿日期2000-11-15接受日期2000-11-16
主题词 肝/病理学；再灌注损伤；一氧化氮/血液；血栓烷A2/代谢；依前列醇/代谢
张志成, 冀振华, 黄志强, 孟宪钧. 大鼠肝脏缺血再灌注损伤中NO，TXA2/PGI2的作用. 世界华人消化杂志，2001；9(4)：452-453
, http://www.100md.com
我们通过大鼠肝脏缺血再灌注损伤模型，对血管活性物质一氧化氮(nitric oxide, NO)以及血栓素A2/前列环素(TXA2/PGI2)的作用进行了探讨.
1 材料和方法
1.1 模型制备 健康Wistar大鼠，雄性，体质量300g±30g (军事医学科学院实验动物中心提供)，10g·L-1戊巴比妥钠40mg·kg-1, ip麻醉，腹中线切口，小动脉夹夹闭肝动脉、门静脉及胆总管45min，解除阻断，肝脏缺血再灌注损伤模型制成，分别于再灌注不同时间点采取标本. 手术对照组仅开腹采取标本，不做阻断. 将实验动物随机分为5组，每组6只动物. 手术对照组；肝脏缺血45min再灌注0h组；肝脏缺血45min再灌注1h组；肝脏缺血45min再灌注3h组；肝脏缺血45min再灌注5h组. 在再灌注同时自大鼠尾静脉注入左旋精氨酸(L-Arg)200mg·kg-1，再灌注3h组取标本检测NO及ALT含量.
, 百拇医药
1.2 测定指标 ①肝静脉血NO含量：肝素处理的注射器自肝上下腔静脉采血1mL，鲁米诺化学发光测定[1]. ②肝组织TXA2/PGI2含量：肝组织液氮速冻后研碎，放免法测定TXB2及6-keto-PGF1,α作为判断TXA2/PGI2的指标[2]. ③血液谷丙转泵ALT)：抽取心脏的血液1mL，酶偶联连续检测法测定.
统计学处理结果以平均数±标准差表示(x±s)，在计算机上进行F检验.
2 结果
肝静脉血NO含量再灌注0h(n=6)为(2.03±0.10)μmol·L-1，手术对照组为(5.45±0.43)μmol·L-1(P<0.01). 再灌注1，3，5h分别为(2.80±0.25)，(4.14±0.20)，(4.85±0.25)μmol·L-1，进一步上升(P<0.01). 肝组织TXA2/PGI2含量也有明显变化见表1. 治疗后NO升高而ALT下降见表2.
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表1 缺血再灌注肝组织TXB2，6-Keto-PGF1α及其比值的变化
| 分组 | TXB2(ng·g-1) | PGF1α(ng·g-1) | TXB2/PGF1 |
| 手术对照 | 62±1 | 64±2 | 1.0±0.1 |
| 再灌注0h | 73±10b | 67±3 | 1.1±0.4 |
| 再灌注1h | 203±10b | 145±15b | 1.5±0.4b |
| 再灌注3h | 189±7b | 93±4b | 2.08±0.4b |
| 再灌注5h | 185±12b | 69±10 | 2.6±0.4b |
, 百拇医药
bP<0.01, vs 对照组.
表2 精氨酸治疗缺血再灌注对NO及ALT的影响(n=6, x±s)
| 组别 | NO (μmol·L-1) | ALT (nkat·L-1) |
| 手术对照组 | 5.45±0.43 | 27.83±2.32 |
| 非治疗组 | 4.14±0.20 | 276.67±36.15 |
| 治疗组 | 5.78±0.20a | 181.67±33.12b |
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aP<0.05， bP<0.01， vs 非治疗组.
3 讨论
近年来，人们认为肝脏可被当作一重要循环器官来对待. 肝脏缺血再灌注损伤，缺血对肝细胞的影响在一定时限内可能不是主要的，而肝脏微循环的改变以及肝血窦内皮细胞的损伤，可能是造成肝损害的重要因素和关键环节，可做为治疗的靶向[3-5,23,24]. 1987年Palmer et al[6，10,11]证实内皮衍生舒张因子(EDRF)与NO为同一物质以来，NO的作用受到广泛重视. 内源性的NO具有强大的舒张血管，抑制血小板聚集抗血栓形成以及抑制血平滑肌增殖等作用[7，12，22]. TXA2主要由内皮细胞生成，有较强的扩张血管及抑制血小板积聚的作用，生理状态下，TXA2及PGI2两者保持一定的比例，是维持血液循环稳定的因素之一[8，9，13，25-29]. 本结果显示，大鼠肝脏血流阻断45min后，肝循环NO含量明显降低(P<0.01)，阻断解除后仍不能尽快恢复(P<0.001)，提示作为血管舒张因子和抑制血小板集聚因子的NO含量的降低是肝脏微循环收缩及血管内微血栓形成再灌注后血流不能尽快恢复的重要因素之一. 一些学者在心肌、胃肠等脏器的缺血再灌注损伤研究中，亦发现NO生成减少，与我们的结果是一致的[7,16-18]. 我们在检测NO的同时，亦检测了肝组织TXA2及PGI2的含量，结果显示TXA2升高明显且持续较长时间(P<0.01)，PGI2虽也有所升高，但很快恢复正常，导致TXA2/PGI2比值持续升高(P<0.01)，从而加剧肝循环收缩，血小板聚集，微血栓形成，这与NO含量减少的作用是协同的.
, http://www.100md.com
形态学研究证实[14,15]，肝脏微循环在再灌注早期处于收缩状态，内皮细胞肿胀，血管内微血栓形成，导致再灌注早期的无复流现象. 调节微循环的物质如内皮素，降钙素基因相关肽的研究证实[10,19,20]，通过改善肝脏血液循环而减轻肝脏的缺血再灌注损伤. 基于改善肝脏微循环的考虑，我们在再灌注的同时，提供NO生成底物左旋精氨酸，发现可以显著提高再灌注时NO的含量，同时检测了血中ALT含量，显示与非治疗组比较有明显降低，提示有一定保护作用(P<0.01). 实验证实[8,9,21]，TXA2合成酶抑制剂及TXA2受体拮抗剂均能减少肝细胞缺血再灌注后微血栓形成，从而保护肝细胞，增加肝细胞的ATP水平，起到肝细胞保护作用. 本结果显示，血管活性物质NO，TX2/PGI2参与了肝脏缺血再灌注损伤. 在肝脏缺血再灌注损伤早期，应用具有舒张血管及抗血小板聚集血栓形成的制剂，对减轻再灌注损伤可望起到有益的作用，值得进一步研究.
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4 参考文献
1 王成彬，田亚平，沈文梅. 自由基生命科学进展. 第三集. 北京：原子能出版社，1995：159-163
2 李振甲，王仁芳. 激素的放射免疫分析. 第1版. 北京：科学技术文献出版社，1985：138
3 Adkinson D, Hoellwarth ME, Benoit JN. Role of free radicals in ischemia-reperfusion injury to the liver. Acta Physiol Scand,1986;548(Suppl):101-107
4 Satoshi K, Tohru S, Kimiro T. Mannosylated superoxide dismutase inhibits hepatic reperfusion injury in rats. J Surg Res,1996;60:36-40
, 百拇医药
5 Caldwell-Kenkel JC, Currin RT, Tanaka Y. Reperfusion injury to endothelial cells after cold ischemia storage of rat livers.
Hepatology, 1989;10:292-299
6 Palmer RMJ, Ferrige AG, Moncada A. Nitric oxide release acounts for the biological activity of endothelium derived relaxing
factor. Nature, 1987;327:524-529
7 Frederick LK, Tadenxa M. Nitric oxide-biochemistry, pathophysiology and detection. Am J Clin Pathol, 1993;100:567-575
, http://www.100md.com
8 Bush LR, Campbell WB, Buja LM. Effects of the selective thromboxane synthetase inhimitor dazoxiben on varations in cyclic blood
flow in stenosed cannine coronary arteries. Circulation, 1984;69:1161-1168
9 Sikujara O, Moden M, Toyoshima K. Cytoprotective effect of prostaglandin I2 on ischemia/reperfusion hepatic cell
injury. Transplantation, 1983;36:238-243
, http://www.100md.com 10 唐朝枢. 内皮素对缺氧肝脏的损伤作用及CGRP的拮抗效应. 北京医科大学学报，1990；22：6-9
11 Igarro LJ, Buga CM, Wood KS. Endothelium-derived relaxing factor produced and released from artery and vein is nitric oxide.
Proc Natl Acad Sci USA, 1987;84:9265-9270
12 陈玺华, 李正中, 鲍民生, 郑绘霞. 一氧化氮在大鼠肝缺血再灌注损伤中的作用. 世界华人消化杂志, 1999;7:295-297
13 王兴鹏, 徐家裕, 袁耀宗, 翟祖康. 川芎嗪对急性出血坏死性胰腺炎大鼠血浆血栓素、前列环素及氧自由基的影响.
, 百拇医药
新消化病学杂志, 1993;1:13-14
14 汪爽, 高毅, 詹兴海. 柴胡煎剂治疗肝脏缺血性损伤的形态学观察. 世界华人消化杂志， 2000;8:159-161
15 洪照友, 高毅, 詹兴海. 中药虎杖对大鼠肝脏缺血性损伤保护的形态学观察. 世界华人消化杂志， 2000;8:162-164
16 Paul CK, Rebecca AS. The emerging multifaceted role of nitric oxide. Ann Surg, 1995;221:220-235
17 Billiar TR. Nitric oxide novel biology with clinical relevance. Ann Surg, 1995;221:339-349
, 百拇医药
18 Salvador M, Annine H. The L-Arg inine-nitric oxide pathway. New Eng J Med, 1993;329:2002-2012
19 李继尧，王玲，张席锦. 降钙素基因相关肽对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的保护作用. 北京医科大学学报，1993；25：396-398
20 王玲女, 李仲孝, 李楠. 降钙素基因相关肽与消化系疾病临床研究进展. 新消化病学杂志, 1996;4(特刊5):233
21 刁同进, 姚晓平, 季兵, 杨甲梅, 吴孟超, 张绍庚. L-精氨酸在大鼠原位肝移植冷缺血再灌注损伤中的作用. 华人消化杂志, 1998;6:291-295
22 刁同进, 吴孟超，姚晓平. 一氧化氮与缺血再灌注损伤. 肝胆胰外科杂志，1999;11:219-221
, 百拇医药
23 张志成，黄志强，孟宪钧，王成彬，杨荣华. 肝硬变大鼠肝脏缺血再灌注损伤. 中华外科杂志，1997；35：753-755
24 王万铁, 林丽娜, 徐正介, 王卫, 李东. 内皮细胞功能变化在肝缺血再灌注中的意义及川芎嗪干预. 世界华人消化杂志, 1999;7:548
25 Welles SL, Shepro D, Hechtman HB. Eicosanoid modulation of stress fibers in cultured bovine aortic endothelial cells.
Inflammation, 1985;9:439-443
26 Ogletree ML, Heran CL, Harris DN. SQ28668, a platelet TXA2/PGH2 an tngonist inhibits thrombotic cyclic reductions in coronary
, 百拇医药
blood flow in anesthetized pigs. Thromb Hameostasis, 1985;54:28-32
27 Nakano H, Moden M, Umeshita K. Cytoprotective effect of prostaglandin I2 analogues on superoxide-induced hepatocyte
injury. Surgery, 1994;116:883-889
28 Hanazak K, Kuroda T, Haba Y. Protective effect of the thromoboxane A2 receptor antagonist ONO3708 on
ischemia-reperfusion injury in the dog liver. Surgery, 1994;116:896-903
29 Helling TS, Wogahn BM, Olson SA. The effect of prostaglandin E1 on liver adenine nucleotides and cytoplasimic enzymes in a
porcine model of nor mothermic hepatic ischemia. Hepatology, 1995;22:1554-1559, 百拇医药(张志成1 冀振华1 黄志强2 孟宪钧2 )