大鼠非酒精性脂肪性肝炎发病中游离脂肪酸的作用
1上海市第一人民医院消化内科 上海市 200080
2复旦大学医学院病理学教研室 上海市 200032
国家自然科学基金资助项目，No.39800051
项目负责人 范建高，200080，上海市武进路85号，上海市第一人民医院消化内科.
Tel. 0086-21-63240090 Ext.3141, 3142
Email. fanjg@online.sh.cn
收稿日期 2000-09-19 接受日期 2000-09-21
, 百拇医药
主题词 肝炎/病理生理学；脂肪酸类/代谢；肝/病理学；细胞色素P-450 CYP2E1/生物合成
范建高, 钟岚, 王国良, 徐正婕, 巫协宁, 李明升. 大鼠非酒精性脂肪性肝炎发病中游离脂肪酸的作用. 世界华人消化杂志，2001；9(6)：721-722
非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis, NASH)是隐源性肝硬变的重要前期病变[1]. 然而，目前对日益高发的非酒精性脂肪肝如何发展为脂肪性肝炎仍不甚清楚[1]. 为此，我们通过高脂饮食建立脂肪性肝炎模型，旨在从游离脂肪酸(free fatty acid, FFA)的角度探讨NASH的发病机制.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 健康成熟雄性Spraque-Dawley (SD)大鼠(清洁级)19只，体质量140g～160g，购自西普尔-必凯动物有限公司. FFA试剂盒购自执诚公司的Randox试剂. 超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和丙二醛(malondialdehyde, MDA)试剂盒购自南京聚力生物医学工程医学工程研究所. 细胞色素P450 2E1(cytochrome P450 2E1, CYP2E1)多抗由瑞典Sundberg MI教授惠赠(上海市消化疾病研究所戴宁博士转赠). 免疫组化SP试剂盒购自福州迈新生物技术开发公司.
1.2 方法 SD大鼠正常喂养1wk后，随机分为2组. 正常组9只，标准饲料喂养；模型组10只，高脂饲料喂养，即标准饲料基础上加100g·kg-1猪油、20g·kg-1胆固醇. 实验动物自由饮水和进食，饲养于20℃±2℃明暗各12h的普通级动物实验室内, 建立动物模型. 12wk后隔夜空腹处死，常规制备血清、肝匀浆和肝组织石蜡切片标本，并称大鼠体质量和肝脏湿质量. 血清三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、FFA、丙氨酸转氨酶(ALT)、天门冬氨酸转氨酶(AST)，清蛋白和总蛋白以及肝匀浆FFA均按试剂盒操作步骤在全自动生化分析仪Olympus AU1000测定，石蜡切片HE染色观察肝脏病理学变化，免疫组化SP染色观察肝组织CYP2E1的阳性细胞数，并由肝脏病理学教授参照文献，在光镜下半定量评估肝细胞脂肪变性、炎症活动指数以及CYP2E1的表达[2]. 超薄切片透射电镜观察肝脏的超微结构.
, http://www.100md.com
统计学处理 计量资料以x±s表示，各组间实验数据的比较采用两样本均数的t检验，等级资料采用秩和检验，P<0.05为有显著性差异. 计量资料各指标间的相关性采用两因素的相关分析，结果以r值表示；计量资料与等级资料间的相关性采用组群趋势分析J检验. 除J检验外，所有数据处理均在原上海医科大学统计学教研室SAS软件上进行.
2 结果
造模动物体质量较标准饲料喂养大鼠增长迅速. 至实验结束时，两组动物均无死亡发生. 与正常组相比，模型组大鼠体质量、每100g体重的肝脏湿质量，以及血脂和ALT, AST水平均显著升高. 血清清蛋白、总蛋白含量与正常组相比未见显著差异.
2.1 血清和肝FFA的改变 与正常组相比，模型组血清FFA含量显著增加，表现为(728±178)mmol·L-1对(429±178)mmol·L-1,P<0.01；肝匀浆湿重FFA含量亦较正常组显著升高，表现为(5.4±0.9)mmol·g-1对(4.5±0.9)mmol·g-1. 两因素的相关分析显示，两组血清和肝匀浆FFA含量之间无显著相关性(P>0.05).
, 百拇医药
2.2 氧应激和脂质过氧化改变 与正常组相比，模型组肝匀浆湿重脂质过氧化终产物―MDA含量显著增加，表现为(915±226)nmol·g-1对(338±24)nmol·g-1 (P<0.01). 肝匀浆湿重抗氧化物质―SOD活性较正常组显著下降，表现为(4668±580)Nu·g-1对(6482±263)Nu·g-1 (P<0.01).
2.3 肝脏组织学变化 正常组HE染色呈大致正常肝组织学改变，而模型组均呈现弥漫性、大泡性肝细胞脂肪变性，其中轻度、中度、重度脂肪变各3， 6和1只；伴程度不一的点、片状肝细胞坏死和单个核细胞为主的小叶内和汇管区炎症细胞浸润. 模型组肝组织学炎症活动指数显著高于正常组，表现为(3.4±2.1)对(0.8±0.8),P<0.01. 免疫组化研究显示肝组织内CYP2E1阳性细胞数比正常组显著增多(P<0.01). 超薄切片电镜显示模型大鼠肝组织内枯否细胞和肝星状细胞较正常大鼠增多易见. 无论是光镜还是电镜下观察，模型组大鼠肝标本均未见明显肝纤维化.
, 百拇医药
2.4 FFA与各指标间的相关性 相关分析显示，血清FFA与肝脏MDA含量之间呈密切正相关，与SOD活性间呈负相关，r值分别为0.4807和-0.3820,P<0.01. 肝脏匀浆FFA与MDA含量间呈正相关(r=0.5337, P<0.05)；与SOD活性间无密切相关性. 血清和(或)肝脏FFA含量高者，其肝组织学脂肪变、炎症、坏死以及肝星状细胞改变亦较明显. 组群趋势分析J检验显示，随着血清FFA浓度的升高，肝细胞脂肪变性程度加重(P<0.05)；相关分析显示，血清FFA含量与肝组织炎症活动指数呈正相关(r=0.2538,P<0.01). 肝匀浆FFA含量与肝细胞脂肪变及炎症活动指数之间均无显著相关性. J检验显示，随着血清和肝匀浆FFA含量升高，肝组织CYP2E1表达均显著增强(P<0.01).
3 讨论
, http://www.100md.com
氧化磷酸化和脂肪酸β氧化受损在脂肪性肝疾患的发生中起着重要作用。酒精和一些诱发NASH的药物在肝脏代谢时，抑制肝细胞FFA的氧化分解，导致肝细胞内FFA蓄积过多；并且，富含油酸和亚油酸等多不饱和脂肪酸的玉米油、鱼油可通过激活肝内脂质过氧化反应，诱导并促进实验动物酒精性肝损伤的发生[3-5]. 临床上，非酒精性脂肪肝的严重程度未必与肥胖、高脂血症和高血糖本身相关，而可能与导致脂肪性肝炎的禁食饥饿、体重骤减、小肠旁路手术以及胰岛素抵抗等密切相关，在此状态下，脂肪组织释放FFA入血增多[3]. 有学者曾测定酒精性及肥胖性脂肪肝肝活检标本中脂质的含量，结果发现患者肝脏不仅TG聚积增多，而且FFA含量也有增加. 虽然增多的FFA仅占肝脏脂质的极小部分，但体外细胞培养研究显示极低浓度的FFA即可直接损伤肝脏细胞的生物膜，并可能通过加强其CYP2E1表达、以及脂质过氧化反应和细胞因子毒性等途径损伤肝细胞，并直接或通过枯否细胞激活肝星状细胞[6-9]. 由此可见，血液和(或)肝脏FFA含量增多可能与脂肪性肝炎肝纤维化的发病有关. 然而，FFA在实验动物NASH发病中的具体作用及其机制鲜见文献报道.
, 百拇医药
我们对现有脂肪性肝炎的造模方法进行改良，通过持续12wk的高脂肪和高胆固醇饮食成功地复制出大鼠NASH模型. 该模型特点为实验动物体重明显增加，伴血脂升高、转氨酶轻度异常，肝组织学呈现轻重不一的肝细胞大泡性脂肪变性、坏死和炎症细胞浸润. 这与人类常见的NASH病理学改变极其相似，并且模型复制率高，几乎无动物死亡，故可作为目前研究NASH的实验工具[10，11]. 通过该模型进行的相关研究发现，造模动物血清和肝匀浆FFA含量显著增加，肝脏CYP2E1的表达和肝匀浆MDA含量亦有增多，而SOD活性则显著下降. 并且，血液和(或)肝匀浆FFA含量与CYP2E1的表达，SOD和MDA的改变，以及肝细胞脂肪变性和肝组织学炎症活动指数等指标均呈密切相关. 理论上，肝匀浆FFA的改变与这些指标的相关性应强于血液FFA，并且血液FFA与肝脏FFA含量之间应存在一定相关性. 然而，本研究结果与此并不完全一致. 推测其原因可能为：相对于血液FFA的含量及其测定方法而言，肝匀浆FFA含量极低，而影响其检测结果的因素却很多，从而导致实验结果误差. 血液FFA含量在NASH发病中的作用是否较肝脏内FFA更重要，有待进一步研究证实.
, 百拇医药
4 参考文献
1 Diehl AM. Nonalcoholic steatohepatitis. Sem Liver Dis, 1999;19:221-229
2 王泰玲, 刘霞, 周元平, 何静雯 张晶, 李宁章, 段钟平, 王宝恩. 慢性肝炎炎症活动度及纤维化程度计分方案. 中华肝脏病杂志，1998；6：195-197
3 范建高, 曾民德, 王国良. 脂肪肝的发病机制. 世界华人消化杂志, 1999;7:75-76
4 徐正婕, 范建高, 王国良. 游离脂肪酸在脂肪性肝炎发病中的作用. 中华肝脏病杂志，2000；8：92-94
, http://www.100md.com
5 Fernandze AM, Torres MI, Gil A. Steatosis and collagen content in experimental liver cirrhosis are affected by dietary
monounsaturated and polyunsaturated fatty acids. Scand J Gastroenterol, 1997;32:350-356
6 范建高, 曾民德, 洪健, 李继强, 邱德凯. 不饱和脂肪酸对L-02和HLF细胞增殖及合成细胞外基质的影响. 华人消化杂志, 1998;6:502-504
7 陆伦根, 曾民德, 李继强, 范建高, 华静, 范竹萍, 戴宁, 邱德凯. 花生四烯酸和亚油酸对肝星状细胞增殖的影响. 世界华人消化杂志,1999;7:10-12
, 百拇医药
8 Chen Q, Galleano M, Cederbaum AL. Cytotoxicity and apoptosis produced by arachidonic acid in HepG2 cells overexpression
human cytochrome P4502E1. Alcohol Clin Exp Res, 1998;22:782-784
9 Mcclain CJ, Brave S, Deaciue I. Cytokines in alcoholic liver disease. Semin Liver Dis, 1999;19:205-219
10 范建高, 钟岚, 王国良, 徐正婕,靖大道, 张丕利, 巫协宁. 肥胖高脂血症性脂肪性肝炎的实验研究. 中国学术期刊文摘，2000；6：515-516
11 范建高. 中国脂肪肝的研究. 世界华人消化杂志，2001；9：6-10, http://www.100md.com(范建高1 钟 岚1 王国良1 徐正婕1 巫协宁1 李明升2 )
2复旦大学医学院病理学教研室 上海市 200032
国家自然科学基金资助项目，No.39800051
项目负责人 范建高，200080，上海市武进路85号，上海市第一人民医院消化内科.
Tel. 0086-21-63240090 Ext.3141, 3142
Email. fanjg@online.sh.cn
收稿日期 2000-09-19 接受日期 2000-09-21
, 百拇医药
主题词 肝炎/病理生理学；脂肪酸类/代谢；肝/病理学；细胞色素P-450 CYP2E1/生物合成
范建高, 钟岚, 王国良, 徐正婕, 巫协宁, 李明升. 大鼠非酒精性脂肪性肝炎发病中游离脂肪酸的作用. 世界华人消化杂志，2001；9(6)：721-722
非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis, NASH)是隐源性肝硬变的重要前期病变[1]. 然而，目前对日益高发的非酒精性脂肪肝如何发展为脂肪性肝炎仍不甚清楚[1]. 为此，我们通过高脂饮食建立脂肪性肝炎模型，旨在从游离脂肪酸(free fatty acid, FFA)的角度探讨NASH的发病机制.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 健康成熟雄性Spraque-Dawley (SD)大鼠(清洁级)19只，体质量140g～160g，购自西普尔-必凯动物有限公司. FFA试剂盒购自执诚公司的Randox试剂. 超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和丙二醛(malondialdehyde, MDA)试剂盒购自南京聚力生物医学工程医学工程研究所. 细胞色素P450 2E1(cytochrome P450 2E1, CYP2E1)多抗由瑞典Sundberg MI教授惠赠(上海市消化疾病研究所戴宁博士转赠). 免疫组化SP试剂盒购自福州迈新生物技术开发公司.
1.2 方法 SD大鼠正常喂养1wk后，随机分为2组. 正常组9只，标准饲料喂养；模型组10只，高脂饲料喂养，即标准饲料基础上加100g·kg-1猪油、20g·kg-1胆固醇. 实验动物自由饮水和进食，饲养于20℃±2℃明暗各12h的普通级动物实验室内, 建立动物模型. 12wk后隔夜空腹处死，常规制备血清、肝匀浆和肝组织石蜡切片标本，并称大鼠体质量和肝脏湿质量. 血清三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、FFA、丙氨酸转氨酶(ALT)、天门冬氨酸转氨酶(AST)，清蛋白和总蛋白以及肝匀浆FFA均按试剂盒操作步骤在全自动生化分析仪Olympus AU1000测定，石蜡切片HE染色观察肝脏病理学变化，免疫组化SP染色观察肝组织CYP2E1的阳性细胞数，并由肝脏病理学教授参照文献，在光镜下半定量评估肝细胞脂肪变性、炎症活动指数以及CYP2E1的表达[2]. 超薄切片透射电镜观察肝脏的超微结构.
, http://www.100md.com
统计学处理 计量资料以x±s表示，各组间实验数据的比较采用两样本均数的t检验，等级资料采用秩和检验，P<0.05为有显著性差异. 计量资料各指标间的相关性采用两因素的相关分析，结果以r值表示；计量资料与等级资料间的相关性采用组群趋势分析J检验. 除J检验外，所有数据处理均在原上海医科大学统计学教研室SAS软件上进行.
2 结果
造模动物体质量较标准饲料喂养大鼠增长迅速. 至实验结束时，两组动物均无死亡发生. 与正常组相比，模型组大鼠体质量、每100g体重的肝脏湿质量，以及血脂和ALT, AST水平均显著升高. 血清清蛋白、总蛋白含量与正常组相比未见显著差异.
2.1 血清和肝FFA的改变 与正常组相比，模型组血清FFA含量显著增加，表现为(728±178)mmol·L-1对(429±178)mmol·L-1,P<0.01；肝匀浆湿重FFA含量亦较正常组显著升高，表现为(5.4±0.9)mmol·g-1对(4.5±0.9)mmol·g-1. 两因素的相关分析显示，两组血清和肝匀浆FFA含量之间无显著相关性(P>0.05).
, 百拇医药
2.2 氧应激和脂质过氧化改变 与正常组相比，模型组肝匀浆湿重脂质过氧化终产物―MDA含量显著增加，表现为(915±226)nmol·g-1对(338±24)nmol·g-1 (P<0.01). 肝匀浆湿重抗氧化物质―SOD活性较正常组显著下降，表现为(4668±580)Nu·g-1对(6482±263)Nu·g-1 (P<0.01).
2.3 肝脏组织学变化 正常组HE染色呈大致正常肝组织学改变，而模型组均呈现弥漫性、大泡性肝细胞脂肪变性，其中轻度、中度、重度脂肪变各3， 6和1只；伴程度不一的点、片状肝细胞坏死和单个核细胞为主的小叶内和汇管区炎症细胞浸润. 模型组肝组织学炎症活动指数显著高于正常组，表现为(3.4±2.1)对(0.8±0.8),P<0.01. 免疫组化研究显示肝组织内CYP2E1阳性细胞数比正常组显著增多(P<0.01). 超薄切片电镜显示模型大鼠肝组织内枯否细胞和肝星状细胞较正常大鼠增多易见. 无论是光镜还是电镜下观察，模型组大鼠肝标本均未见明显肝纤维化.
, 百拇医药
2.4 FFA与各指标间的相关性 相关分析显示，血清FFA与肝脏MDA含量之间呈密切正相关，与SOD活性间呈负相关，r值分别为0.4807和-0.3820,P<0.01. 肝脏匀浆FFA与MDA含量间呈正相关(r=0.5337, P<0.05)；与SOD活性间无密切相关性. 血清和(或)肝脏FFA含量高者，其肝组织学脂肪变、炎症、坏死以及肝星状细胞改变亦较明显. 组群趋势分析J检验显示，随着血清FFA浓度的升高，肝细胞脂肪变性程度加重(P<0.05)；相关分析显示，血清FFA含量与肝组织炎症活动指数呈正相关(r=0.2538,P<0.01). 肝匀浆FFA含量与肝细胞脂肪变及炎症活动指数之间均无显著相关性. J检验显示，随着血清和肝匀浆FFA含量升高，肝组织CYP2E1表达均显著增强(P<0.01).
3 讨论
, http://www.100md.com
氧化磷酸化和脂肪酸β氧化受损在脂肪性肝疾患的发生中起着重要作用。酒精和一些诱发NASH的药物在肝脏代谢时，抑制肝细胞FFA的氧化分解，导致肝细胞内FFA蓄积过多；并且，富含油酸和亚油酸等多不饱和脂肪酸的玉米油、鱼油可通过激活肝内脂质过氧化反应，诱导并促进实验动物酒精性肝损伤的发生[3-5]. 临床上，非酒精性脂肪肝的严重程度未必与肥胖、高脂血症和高血糖本身相关，而可能与导致脂肪性肝炎的禁食饥饿、体重骤减、小肠旁路手术以及胰岛素抵抗等密切相关，在此状态下，脂肪组织释放FFA入血增多[3]. 有学者曾测定酒精性及肥胖性脂肪肝肝活检标本中脂质的含量，结果发现患者肝脏不仅TG聚积增多，而且FFA含量也有增加. 虽然增多的FFA仅占肝脏脂质的极小部分，但体外细胞培养研究显示极低浓度的FFA即可直接损伤肝脏细胞的生物膜，并可能通过加强其CYP2E1表达、以及脂质过氧化反应和细胞因子毒性等途径损伤肝细胞，并直接或通过枯否细胞激活肝星状细胞[6-9]. 由此可见，血液和(或)肝脏FFA含量增多可能与脂肪性肝炎肝纤维化的发病有关. 然而，FFA在实验动物NASH发病中的具体作用及其机制鲜见文献报道.
, 百拇医药
我们对现有脂肪性肝炎的造模方法进行改良，通过持续12wk的高脂肪和高胆固醇饮食成功地复制出大鼠NASH模型. 该模型特点为实验动物体重明显增加，伴血脂升高、转氨酶轻度异常，肝组织学呈现轻重不一的肝细胞大泡性脂肪变性、坏死和炎症细胞浸润. 这与人类常见的NASH病理学改变极其相似，并且模型复制率高，几乎无动物死亡，故可作为目前研究NASH的实验工具[10，11]. 通过该模型进行的相关研究发现，造模动物血清和肝匀浆FFA含量显著增加，肝脏CYP2E1的表达和肝匀浆MDA含量亦有增多，而SOD活性则显著下降. 并且，血液和(或)肝匀浆FFA含量与CYP2E1的表达，SOD和MDA的改变，以及肝细胞脂肪变性和肝组织学炎症活动指数等指标均呈密切相关. 理论上，肝匀浆FFA的改变与这些指标的相关性应强于血液FFA，并且血液FFA与肝脏FFA含量之间应存在一定相关性. 然而，本研究结果与此并不完全一致. 推测其原因可能为：相对于血液FFA的含量及其测定方法而言，肝匀浆FFA含量极低，而影响其检测结果的因素却很多，从而导致实验结果误差. 血液FFA含量在NASH发病中的作用是否较肝脏内FFA更重要，有待进一步研究证实.
, 百拇医药
4 参考文献
1 Diehl AM. Nonalcoholic steatohepatitis. Sem Liver Dis, 1999;19:221-229
2 王泰玲, 刘霞, 周元平, 何静雯 张晶, 李宁章, 段钟平, 王宝恩. 慢性肝炎炎症活动度及纤维化程度计分方案. 中华肝脏病杂志，1998；6：195-197
3 范建高, 曾民德, 王国良. 脂肪肝的发病机制. 世界华人消化杂志, 1999;7:75-76
4 徐正婕, 范建高, 王国良. 游离脂肪酸在脂肪性肝炎发病中的作用. 中华肝脏病杂志，2000；8：92-94
, http://www.100md.com
5 Fernandze AM, Torres MI, Gil A. Steatosis and collagen content in experimental liver cirrhosis are affected by dietary
monounsaturated and polyunsaturated fatty acids. Scand J Gastroenterol, 1997;32:350-356
6 范建高, 曾民德, 洪健, 李继强, 邱德凯. 不饱和脂肪酸对L-02和HLF细胞增殖及合成细胞外基质的影响. 华人消化杂志, 1998;6:502-504
7 陆伦根, 曾民德, 李继强, 范建高, 华静, 范竹萍, 戴宁, 邱德凯. 花生四烯酸和亚油酸对肝星状细胞增殖的影响. 世界华人消化杂志,1999;7:10-12
, 百拇医药
8 Chen Q, Galleano M, Cederbaum AL. Cytotoxicity and apoptosis produced by arachidonic acid in HepG2 cells overexpression
human cytochrome P4502E1. Alcohol Clin Exp Res, 1998;22:782-784
9 Mcclain CJ, Brave S, Deaciue I. Cytokines in alcoholic liver disease. Semin Liver Dis, 1999;19:205-219
10 范建高, 钟岚, 王国良, 徐正婕,靖大道, 张丕利, 巫协宁. 肥胖高脂血症性脂肪性肝炎的实验研究. 中国学术期刊文摘，2000；6：515-516
11 范建高. 中国脂肪肝的研究. 世界华人消化杂志，2001；9：6-10, http://www.100md.com(范建高1 钟 岚1 王国良1 徐正婕1 巫协宁1 李明升2 )