人端粒酶催化亚单位诱饵融合蛋白表达载体构建成功
第三军医大学 1西南医院全军消化专科中心 重庆市消化病研究所
2西南医院内分泌科 重庆市 400038
国家自然科学基金高技术探索项目 No.39980010
项目负责人 陈兵 400038 重庆第三军医大学西南医院内分泌科.bin gcheng@telekbird.com.cn
Telephone:0086-23-68754138
收稿日期 2001-05-31 接受日期 2001-06-12
摘 要
, http://www.100md.com
目的 探索端粒相关未知蛋白分子，构建人端粒酶催化亚单位(human t elomerase reverse transcriptase, hTRT)诱饵融合蛋白表达载体.
方法 回收cDNA片段采用电洗脱法，DNA亚克隆重组技术载体构建.
结果 hTRT cDNA质粒经EcoRⅠ,NotⅠ双酶切，0.8%琼脂糖凝胶电泳分 为目的片段3.4kb，载体10.6kb两段，电洗脱法回收3.4kb目的片段.载体质粒pGBKT7经EcoR Ⅰ,NotⅠ双酶切，电洗脱法回收7.3kb载体片段.通过T4 DNA连接酶将hTRT cDNA目的片段定 向克隆入载体质粒pGBKT7，将其转化入大肠杆菌DH5α.抽提质粒后经EcoRⅠ,NotⅠ双酶切证 实，hTRT cDNA目的片段与载体质粒pGBKT7连接.
, http://www.100md.com
结论 成功构建了pGBKT7-hTRT诱饵融合蛋白表达载体，为从cDNA文库 中筛选与hTRT相互作用未知蛋白的编码基因奠定了良好的实验基础.
主题词 端粒，末端转移酶/遗传学；重组融合蛋白质类/遗传学； 遗传载体；DNA，互补/遗传学；质粒
周平，陈兵，刘为纹，房殿春.人端粒酶催化亚单位诱饵融合蛋白表达载体构建成 功.世界华人消化杂志，2001；9(10)：1205-1206
0 引言端粒是真核细胞染色体末端的一个特殊结构， 由一段具有特定重复序列的DNA和端粒结合蛋白组成，是维持染色体结构稳定的重要因素 [1-6].目前端粒的研究为肿瘤、衰老等难题提供了重要研究方向[7-18]， 但有关端粒酶蛋白组织结构及其调控机制仍不十分清楚.因此，寻找新的、关键性的端粒、 端粒酶调控分子是非常重要的.我们以端粒相关蛋白中较为重要的人端粒酶催化亚单位为诱 饵，拟从cDNA文库中筛选出与hTRT作用的端粒相关未知蛋白的编码基因，为此成功构建了hT RT诱饵融合蛋白表达载体pGBKT7- hTRT.
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1 材料和方法
1.1 材料 限制性内切酶EcoRⅠ,NotⅠ(Promega公司)，T4 DN A连接酶(Roche公司)，载体质粒pGBKT7(Clontech公司)， hTRT cDNA质粒pGRN145由美国Geron公司惠赠.宿主菌DH5α，蛋白胨及酵母提取物(Difco公司)，琼脂糖、(HindIII mark er(华美公司)，质粒提取试剂盒(Roche公司).紫外分光仪(Beckman Du-600)，电洗脱槽.
1.2 方法 质粒DNA的提取及纯化按质粒提取试剂盒操 作说明.紫外分光仪测定质粒DNA的含量.-20℃保存. hTRT质粒pGRN145、载体质粒pGBKT7 经EcoRⅠ,NotⅠ双酶切，目的片段的回收纯化采用电洗脱法. hTRT质粒pGRN145目的片段与 载体质粒pGBKT7定向连接，载体：插入片段摩尔比1：3，将二者加入到连接反应体系中， 5×T4 DNA连接酶缓冲液2μL，T4 DNA连接酶1μL (总反应体积10μL)，12℃反应16h，置4 ℃备用.大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备(氯化钙法).将pGBKT7-hTRT连接产物转化入制备 好的DH5α大肠杆菌感受态细胞，卡那霉素抗性，筛选阳性克隆并扩增培养，质粒提取酶切 签定.
, http://www.100md.com
2 结果hTRT cDNA质粒经EcoRⅠ,NotⅠ双酶切，8g.L-1琼脂糖凝胶电泳分为目的片段3.4kb 、载体10.6kb两段，采用电洗脱法回收3.4kb目的片段.将载体质粒pGBKT7经EcoRⅠ、NotⅠ 双酶切，采用电洗脱法回收7.3kb载体片段.通过T4 DNA连接酶将hTRT cDNA质粒目的片段定向克隆入载体质粒pGBKT7，将其转化入大肠杆菌DH5α.抽提质粒后经EcoRⅠ,NotⅠ双酶切证 实，hTRT cDNA目的片段与载体质粒pGBKT7连接，表明成功构建了pGBKT7-hTRT诱饵融合蛋 白表达载体.
3 讨论
目前研究表明，hTRT在恶性肿瘤及肿瘤细 胞株中呈高表达，但在正常组织及端粒酶阴性的细胞株中不表达，与端粒酶活性具有良好的 一致性[19-21].hTRT cDNA导入正常细胞使端粒酶活化，细胞的生长周期增加，而 且细胞的核型无任何改变.研究显示hTRT上调是肿瘤发生的重要事件.有关端粒及端粒相关蛋 白的研究已取得较大进展[22-31]，但端粒及hTRT表达调控的分子机制、端粒相关 蛋白组分的结构并不十分清楚.因此，利用亚克隆技术构建hTRT诱饵融合蛋白表达载体是实 验首先要解决的关键问题，通过酵母双杂交技术筛选与hTRT相互作用的未知蛋白分子，可望 为上述问题的解决带来希望.我们以两种限制性内切酶EcoRⅠ，NotⅠ分别消化hTRT质粒pGRN145、载体质粒pGBKT7，将目 的片段hTRT cDNA定向克隆入载体pGBKT7，经过大肠杆菌转化及质粒提取，再经EcoRⅠ，Not Ⅰ双酶切证实成功构建了hTRT诱饵融合蛋白表达载体pGBKT7-hTRT，为从cDNA文库中筛选 与hTRT作用的未知端粒相关蛋白的编码基因奠定了良好的实验基础.
, 百拇医药
4 参考文献1 陈兵,刘为纹,房殿春.端粒酶研究概况.世界华人消化杂志，2001；9：441-446
2 Hiyama E, Yokoyama T, Tatsumoto N, Hiyama K, Imamura Y, Murakami Y, Kodama T, Piatyszek MA, Shay JW, Matsuura Y.
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6 何兴祥,王家马龙.端粒酶的激活与肿瘤的发生.华人消化杂志,1998;6:1100-1101
, 百拇医药
7 Zhang FX, Zhang XY, Fan DM, Deng ZY, Yan Y, Wu HP, Fan JJ. Antisense telomerase RNA induced human gastric cancer
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human tumor necrosis factor in vitro. World J Gastroenterol,2000;6(Suppl 3):37
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9 He XX, Wang JL, Wu JL, Yuan SY, Ai L. Telomerase expression, Hp infection andgastric mucosal carcinogenesis.
Shijie Huaren Xiaohua Zazhi, 2000;8:505-508
10 傅建民,余小舫,邵永孚.端粒酶与原发性肝癌.世界华人消化杂志,2000;8:461-463
11 孟志强, 于尔辛, 宋明志.化疗药对人肝癌细胞SMMC-7721端粒酶活性的影响. 世界华人消化杂志,1999;7:252-254
12 许兰涛，马力.端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸对肝癌细胞影响的研究.世界华人消化杂志，2000;8:1065-1066
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13 郭臻,杨善民.抗癌新靶点：端粒及端粒酶抑制剂研究进展.世界华人消化杂志,1999;7:607-609
14 王维,罗和生,余保平. 端粒酶与大肠癌. 世界华人消化杂志，2000；8：800-802
15 杨金亮,房殿春,杨仕明,罗元辉,鲁荣,罗昆仑,刘为纹.正反义人端粒酶RNA组分(hTR)基因真核表达载体的构建.
世界华人消化杂志,2000;8:491-493
16 朱兆华,夏忠胜,何守搞.全反式维甲酸和5-Fu对胃癌细胞端粒酶活性和细胞生长的影响.世界华人消化杂志,2000;8:669-673
17 夏忠胜,朱兆华,何守搞.全反式维甲酸和5-Fu对裸鼠胃癌移植瘤生长和端粒酶活性的影响.世界华人消化杂志,2000;8:674-677
, 百拇医药
18 司君利, 刘吉勇, 亓玉琴.幽门螺杆菌感染与胃粘膜端粒酶活性关系的研究. 世界华人消化杂志,1999;7:429-430
19 杨仕明，房殿春，罗元辉，王振华，鲁荣，刘为纹.胃粘膜活检标本端粒酶活性的检测. 中华消化内镜杂志，1997;14:298-230
20 凌红，陈惠新，李韶光，曾宏，刘集鸿，童志勇.不同胃粘膜病变组织端粒酶活性表达.世界华人消化杂志，2000;8:585-586
21 Yang SM, Wang TJ, Li BY, Wu YH, Ye ZS. Detection of telomerase activity in malignant neoplasms and nonmalignant
epithelial tissues of human esophagus.World J Gastroenterol,2000;6(Suppl 3):45
, http://www.100md.com
22 杨仕明, 房殿春, 罗元辉, 鲁荣, 刘为纹.胃肠道粘膜下肿瘤端粒酶表达的意义.华人消化杂志,1998;6:765-767
23 李正生, 朱正纲, 尹浩然, 陈诗书, 林言箴.改进TRAP-PCR检测端粒酶活性对早期胃癌的诊断.华人消化杂志,1998;6:939-941
24 贾林, 李瑜元.结肠灌洗脱落细胞端粒酶活性诊断结肠癌的价值.华人消化杂志,1998;6:955-957
25 仇生龙, 黄锦湫, 王裕发, 彭志海.大肠癌前病变与癌及脱落细胞端粒酶分析.华人消化杂志,1998;6:992-993
26 李正生,朱正纲,尹浩然,陈诗书,林言箴.转基因肿瘤细胞端粒酶活性表达人和小鼠的差异性.世界华人消化杂志,1999;7:194-196
, 百拇医药
27 范公忍,汪毅,邬光惠,黄苏里.端粒酶在原发性肝癌中的表达.世界华人消化杂志,2000;8:573
28 Feng DY, Zheng H, Fu CY, Cheng RX. An improvement method for the detection of in situ telomerase activity:
in situ telomerase activity labeling.World J Gastroenterol, 1999;5:535-537
29 曲波, 李宝杰, 吕志武, 潘海乐.细针肝穿刺标本检测端粒酶诊断肝癌的意义.世界华人消化杂志，2001；9：538-541
30 刘吉勇, 亓玉琴.端粒酶诊断癌性腹水的临床价值.世界华人消化杂志,1999;7:1008-1009
31 张方信,邓芝云,张学庸,康生朝,汪泳,余西林,王宏,卞晓红.胃癌患者术后端粒长度变化与预后观察.世界华人消化杂志,2000;8:153-155, http://www.100md.com(周平1 陈兵2 刘为纹1 房殿春1)
2西南医院内分泌科 重庆市 400038
国家自然科学基金高技术探索项目 No.39980010
项目负责人 陈兵 400038 重庆第三军医大学西南医院内分泌科.bin gcheng@telekbird.com.cn
Telephone:0086-23-68754138
收稿日期 2001-05-31 接受日期 2001-06-12
摘 要
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目的 探索端粒相关未知蛋白分子，构建人端粒酶催化亚单位(human t elomerase reverse transcriptase, hTRT)诱饵融合蛋白表达载体.
方法 回收cDNA片段采用电洗脱法，DNA亚克隆重组技术载体构建.
结果 hTRT cDNA质粒经EcoRⅠ,NotⅠ双酶切，0.8%琼脂糖凝胶电泳分 为目的片段3.4kb，载体10.6kb两段，电洗脱法回收3.4kb目的片段.载体质粒pGBKT7经EcoR Ⅰ,NotⅠ双酶切，电洗脱法回收7.3kb载体片段.通过T4 DNA连接酶将hTRT cDNA目的片段定 向克隆入载体质粒pGBKT7，将其转化入大肠杆菌DH5α.抽提质粒后经EcoRⅠ,NotⅠ双酶切证 实，hTRT cDNA目的片段与载体质粒pGBKT7连接.
, http://www.100md.com
结论 成功构建了pGBKT7-hTRT诱饵融合蛋白表达载体，为从cDNA文库 中筛选与hTRT相互作用未知蛋白的编码基因奠定了良好的实验基础.
主题词 端粒，末端转移酶/遗传学；重组融合蛋白质类/遗传学； 遗传载体；DNA，互补/遗传学；质粒
周平，陈兵，刘为纹，房殿春.人端粒酶催化亚单位诱饵融合蛋白表达载体构建成 功.世界华人消化杂志，2001；9(10)：1205-1206
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1 材料和方法
1.1 材料 限制性内切酶EcoRⅠ,NotⅠ(Promega公司)，T4 DN A连接酶(Roche公司)，载体质粒pGBKT7(Clontech公司)， hTRT cDNA质粒pGRN145由美国Geron公司惠赠.宿主菌DH5α，蛋白胨及酵母提取物(Difco公司)，琼脂糖、(HindIII mark er(华美公司)，质粒提取试剂盒(Roche公司).紫外分光仪(Beckman Du-600)，电洗脱槽.
1.2 方法 质粒DNA的提取及纯化按质粒提取试剂盒操 作说明.紫外分光仪测定质粒DNA的含量.-20℃保存. hTRT质粒pGRN145、载体质粒pGBKT7 经EcoRⅠ,NotⅠ双酶切，目的片段的回收纯化采用电洗脱法. hTRT质粒pGRN145目的片段与 载体质粒pGBKT7定向连接，载体：插入片段摩尔比1：3，将二者加入到连接反应体系中， 5×T4 DNA连接酶缓冲液2μL，T4 DNA连接酶1μL (总反应体积10μL)，12℃反应16h，置4 ℃备用.大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备(氯化钙法).将pGBKT7-hTRT连接产物转化入制备 好的DH5α大肠杆菌感受态细胞，卡那霉素抗性，筛选阳性克隆并扩增培养，质粒提取酶切 签定.
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2 结果hTRT cDNA质粒经EcoRⅠ,NotⅠ双酶切，8g.L-1琼脂糖凝胶电泳分为目的片段3.4kb 、载体10.6kb两段，采用电洗脱法回收3.4kb目的片段.将载体质粒pGBKT7经EcoRⅠ、NotⅠ 双酶切，采用电洗脱法回收7.3kb载体片段.通过T4 DNA连接酶将hTRT cDNA质粒目的片段定向克隆入载体质粒pGBKT7，将其转化入大肠杆菌DH5α.抽提质粒后经EcoRⅠ,NotⅠ双酶切证 实，hTRT cDNA目的片段与载体质粒pGBKT7连接，表明成功构建了pGBKT7-hTRT诱饵融合蛋 白表达载体.
3 讨论
目前研究表明，hTRT在恶性肿瘤及肿瘤细 胞株中呈高表达，但在正常组织及端粒酶阴性的细胞株中不表达，与端粒酶活性具有良好的 一致性[19-21].hTRT cDNA导入正常细胞使端粒酶活化，细胞的生长周期增加，而 且细胞的核型无任何改变.研究显示hTRT上调是肿瘤发生的重要事件.有关端粒及端粒相关蛋 白的研究已取得较大进展[22-31]，但端粒及hTRT表达调控的分子机制、端粒相关 蛋白组分的结构并不十分清楚.因此，利用亚克隆技术构建hTRT诱饵融合蛋白表达载体是实 验首先要解决的关键问题，通过酵母双杂交技术筛选与hTRT相互作用的未知蛋白分子，可望 为上述问题的解决带来希望.我们以两种限制性内切酶EcoRⅠ，NotⅠ分别消化hTRT质粒pGRN145、载体质粒pGBKT7，将目 的片段hTRT cDNA定向克隆入载体pGBKT7，经过大肠杆菌转化及质粒提取，再经EcoRⅠ，Not Ⅰ双酶切证实成功构建了hTRT诱饵融合蛋白表达载体pGBKT7-hTRT，为从cDNA文库中筛选 与hTRT作用的未知端粒相关蛋白的编码基因奠定了良好的实验基础.
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16 朱兆华,夏忠胜,何守搞.全反式维甲酸和5-Fu对胃癌细胞端粒酶活性和细胞生长的影响.世界华人消化杂志,2000;8:669-673
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26 李正生,朱正纲,尹浩然,陈诗书,林言箴.转基因肿瘤细胞端粒酶活性表达人和小鼠的差异性.世界华人消化杂志,1999;7:194-196
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