人hTERT正反义逆转录病毒表达载体的构件建和鉴定
梁光萍，罗向东，陈渝，齐洁，杨宗城，中国人民解放军第三军医大学西南医院烧伤研究所 重庆市 400038
国家自然科学基金资助，No.30000072
项目负责人 梁光萍，400038,重庆市，中国人民解放军第三军医大学西南医院烧伤研究所
电话： 023-68754176
收稿日期 2001-10-12 接受日期 2001-12-08
摘要
目的:构建人端粒酶催化亚单位(hTERT)正、反义逆转录病毒表达载体.
, http://www.100md.com
方法:采用基因重组技术，用限制性内切酶EcoRI将hTERT基因从克隆载体pGRN-145上酶切下，并将其正向及反向克隆到去磷酸化逆转录病毒载体pLXSN中，NotI和XhoI酶切鉴定结果.
结果:经NotI和XhoI 双酶切后，正义重组质粒被切成1438和7838bp两个片段，反义重组质粒被切成1438、1992和5898bp三个片段，与理论计算长度相符.
结论:成功构建了hTERT正、反义逆转录病毒载体.
梁光萍，罗向东，陈渝，齐洁，杨宗城.人hTERT正反义逆转录病毒表达载体的构 件建和鉴定. 世界华人消化杂志 2002;10(1):94-95
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0 引言端粒酶是位于真核生物体内具有逆转录酶活性的核糖核酶[1-10].由于端粒酶具有 双重作用，其适量表达可以延缓端粒丢失速度，从而延缓细胞衰老[11]，但其过量 表达又是肿瘤细胞无限增殖的一个必要条件[12].近年来有关端粒酶在细胞衰老及 肿瘤治疗中的作用越来越受到人们的重视.目前研究发现端粒酶至少由端粒酶RNA(hTR)、端 粒酶相关蛋白(TP1)及端粒酶催化亚单位(hTERT/hTRT/hEST2)三个亚基组成，其中hTE RT对端粒酶活性表达起着决定性的作用[13,14].为此，我们采用基因重组技术，构 建了hTERT正、反义逆转录病毒载体，为进一步研究hTERT在正常细胞及肿瘤细胞中的作用奠 定基础.
1 材料和方法
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1.1 材料 pLXSN质粒由本所易少萱博士赠送，pGRN-145质粒由 美国Geron公司Okarma博士惠赠，全长14kb,载有3.5kb的hTERT cDNA.E.coli DH5α由 本室保存.限制性内切酶EcoRI, NotI, XhoI和牛小肠碱性磷酸酶(CIP)购自Tak aRa公司，T4连接酶和质粒提取试剂盒购自Promega公司，λDNA/HindⅢ marker, 凝胶 片段回收试剂盒购自Roche公司.
1.2 方法 质粒的提取和纯化采用Promega公司试剂盒 ，具体操作按说明书进行.hTERT cDNA的制备: hTERT cDNA全长3.45kb,位于pGRN-145质粒 两EcoRI酶切位点之间，用EcoRI酶切该质粒，8g·L-1琼脂糖电泳.用凝胶片段 回收试剂盒(Roche) 回收DNA小片段，去离子水溶解沉淀，-20℃冻存备用. pLXSN载体酶切 及5'端去磷酸化: 用EcoRI酶切pLXSN，使其线性化，试剂盒回收片段后，用牛小肠碱性 磷酸酶(CIP)对线性载体5'端去磷酸化.片段去磷酸化体系：H2O 33μL, 10xbuffer 5μL, CIP 2μL, 线性pLXSN 10μL.于37℃水浴1h，经8g·L-1琼脂糖电泳鉴定，试剂 盒回收片段，去离子水溶解，-20℃冻存备用.连接反应: 依次加入H2O 9μL，Buffer 2 μL，去磷酸化pLXSN片段4μL，T4连接酶1μL,总体积20μL,混匀后置4℃过夜. 质粒的转化和克隆挑选: 按常规方法取5μL连接产物转化DH5α感受态，挑取阳性转化菌落，质粒提取试剂盒提取质粒，NotI和XhoI鉴定pLXSN-hTERT重组质粒.
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2 结果
2.1 pGRN-145质粒的酶切及鉴定 hTERT cDNA全长3.4 5Kb，两端均含有EcoRI酶切位点.以EcoRI酶切质粒，经琼脂糖电泳后，所得酶切片 段与预期长度相符.
2.2 pLXSN逆转录病毒线性载体的制备 pLXSN载体经 EcoRI酶切后，成为5.9Kb的线性条带，酶切完全，大小正确.
2.3 hTERT正义及反义重组质粒的鉴定 在安苄青霉素L B平板上挑选3个菌落，提取质粒DNA，经NotI和XhoI双酶切，正义重组质粒 被切成1438和7838bp两个片段，与理论预期长度相符.说明成功构建了pLXSN-hTERT正、反 义重组质粒(图1).
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图1 重组正反义逆转录病毒载体质粒NotI，XhoI酶切鉴定图 谱1: Marker(λDNA/HindⅢ);
2: hTERT反义重组质粒；3： hTERT正义重组质粒.
3 讨论有研究表明，hTERT对端粒酶活性的调控起着决定性的作用[16-26].体细胞中由于 没有hTERT的活化，端粒酶不表达，细胞随着有丝分裂次数的增加，端粒长度逐渐缩短，而 肿瘤细胞中由于有hTERT的表达，端粒酶活化，细胞得以无限增殖.因此，只要活化原代正常 体细胞中的hTERT或抑制肿瘤细胞中的hTERT，就可以达到延长原代细胞寿命或抑制肿瘤生长 的目的[11,12,15].鉴于人体内某些细胞(如血管内皮细胞等)在体外增殖力弱， 传代能力差，单纯构建一般真核表达载体以及用传统脂质体转染方法很难将hTERT基因转入 这些细胞中.因此我们在计算机辅助分析的基础上，据人hTERT基因序列，成功构建了pLXSN -hTERT正、反逆转录病毒载体，为用逆转录病毒方法将hTERT正义基因导入原代培养的正常 体细胞中来研究hTERT在延缓细胞衰老中的作用创造了条件，同时其反义逆转录病毒载体亦为肿瘤的基因治疗奠定了基础.
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4 参考文献1 杨金亮，房殿春，杨仕明，罗元辉，鲁荣，罗昆仑，刘为纹.正反义人端粒酶RNA组分(hTR)基因真核表达载体的构建.
世界华人消化杂志 2000;8:1282-1286
2 陈兵，刘为纹，房殿春.端粒酶研究概况.世界华人消化杂志 2000;9：441-446
3 范公忍，汪毅，邬光惠，黄苏里. 端粒酶在原发性肝癌中的表达.世界华人消化杂志 2000; 8: 573
4 罗奋，孙建龙，任大明，蔡端，沈敏. 温热对人胃癌细胞株端粒酶活性及其相关基因表达的影响.世界华人消化杂志 2001; 9: 1261-1264
5 周平，陈兵，刘为纹，房殿春. 人端粒酶催化亚单位诱饵融合蛋白表达载体的构建成功.世界华人消化杂志 2001; 9：1205-1206
, http://www.100md.com
6 朱兆华，夏忠胜，何守搞. 全反式维甲酸和5Fu对胃癌细胞端粒酶活性和细胞生长的影响.世界华人消化杂志 2000; 8: 669-673
7 王维，罗和生，余保平. 端粒酶与大肠癌.世界华人消化杂志 2000; 8：800-802
8 林勇，谢渭芬，陈伟忠，张新，张兴荣，张忠兵，沈建伟.c-myc调节人端粒酶逆转录酶启动子活性的体外研究.
世界华人消化杂志 2000;8(特刊): 21
9 杨瑞森，单春，魏树臻，邹德宏，赵磊. 食管拉网细胞端粒酶活性检测及临床应用研究 .世界华人消化杂志 2000;8(特刊): 31
10 Yang SM, Fang DC, Yang JL, Luo YH, Lu R, Battle PD, Liu WW. Alteration of telomerase activity and terminal restriction
, 百拇医药
fragment in gastric cancer and its premalignant lesions. J Gastroenerol Hepatol 2001;16:876-882
11 Bodnar AG, Ouellette M, Frolkis M, Holt SE, Chiu CP, Harley CB, Shay JW, Lichtsteiner S, Wrikght WE,Morin GB. Extension of life-
span by introduction of telomerase into normal human cells. Science 1998;279: 349-352
12 杨仕明，房殿春，罗元辉，鲁荣，刘为纹. 胃癌及癌前组织中端粒酶活性的检测及临床意义.中华医学杂志 1998;78:207-209
, 百拇医药
13 Harada K, Yasoshima M, Ozak S, Sanzen T, Nakanuma Y. PCR and in situ hybridization studies of telomerase subunits in humna
non-neoplaastic livers. J Pathol 2001;193: 210-217
14 杨仕明，房殿春，杨金亮，鲁荣，刘为纹，罗云辉. 不同病变胃黏膜端粒酶活性及其亚单位的检测. 癌症 2001; 20:23-27
15 杨仕明，房殿春，杨金亮，鲁荣，刘为纹，罗云辉，陈兵.人端粒酶蛋白催化亚单位反义基因转染对胃癌细胞恶性表型的逆转作用.
第三军医大学学报 2001; 23: 934-937
, 百拇医药
16 杨仕明，房殿春，杨金亮，鲁荣，刘为纹.胃肠道黏膜下肿瘤端粒酶表达的意义.世界华人消化杂志 1998; 6: 765-767
17 许兰涛，马力.端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸对肝癌细胞影响的研究.世界华人消化杂志 2000; 8: 1065-1066
18 Zhang FX, Zhang XY, Fan DM, Deng ZY, Yang Y, Wu HP, Fan JJ. Antisense telomerase RNA induced human gastric cancer cell
apoptosis. World J Gastroenterol 2000;6: 430-432
19 Feng DY, Zheng H, Fu CY, ChengRX. An improvement method for the detection of in situ telomerase activity: in situ telomerase
, http://www.100md.com
activity labeling. World J Gastroenterol 1999;5:535-537
20 Yakoob J, Hu GL, Fan XG, Zhang Z. Telomere,telomerase and digestive cancer. World J Gastroenterol 1999; 5: 334-337
21 傅建民，余小舫，邵永孚. 端粒酶与原发性肝癌.世界华人消化杂志 2000;8: 46 1-463
22 凌红，陈惠心，李韶光，曾宏，刘集鸿，童志勇. 不同胃黏膜病变组织端粒酶活 性表达.世界华人消化杂志 2000;8:585-58
23 曲波，李宝杰，吕志武，潘海乐. 细针肝穿刺标本检测端粒酶诊断肝癌的意义. 世界华人消化杂志 2001; 9: 538-541
, http://www.100md.com
24 张方信，邓学庸，康生朝，汪泳，余西林，王宏，卞晓红. 胃癌患者术后端粒长 度变化与预后观察.世界华人消化杂志 2000;8: 153-155
25 Zhang WH, Ma JP, Peng JS, Gao JS, Cai SR, Wang JP, Zheng ZQ, Wang L. T elomerase activity in gastric cancer and its clinical
implications. World J Ga stroenterol 1999;5:316-319
26 李正生，朱正纲，尹浩然，陈诗书，林言.转基因肿瘤细胞的端粒酶活性表达 人和小鼠的差异性.世界华人消化杂志 1999; 7: 194-196, 百拇医药(梁光萍，罗向东，陈 渝，齐 洁，杨宗城)
国家自然科学基金资助，No.30000072
项目负责人 梁光萍，400038,重庆市，中国人民解放军第三军医大学西南医院烧伤研究所
电话： 023-68754176
收稿日期 2001-10-12 接受日期 2001-12-08
摘要
目的:构建人端粒酶催化亚单位(hTERT)正、反义逆转录病毒表达载体.
, http://www.100md.com
方法:采用基因重组技术，用限制性内切酶EcoRI将hTERT基因从克隆载体pGRN-145上酶切下，并将其正向及反向克隆到去磷酸化逆转录病毒载体pLXSN中，NotI和XhoI酶切鉴定结果.
结果:经NotI和XhoI 双酶切后，正义重组质粒被切成1438和7838bp两个片段，反义重组质粒被切成1438、1992和5898bp三个片段，与理论计算长度相符.
结论:成功构建了hTERT正、反义逆转录病毒载体.
梁光萍，罗向东，陈渝，齐洁，杨宗城.人hTERT正反义逆转录病毒表达载体的构 件建和鉴定. 世界华人消化杂志 2002;10(1):94-95
, http://www.100md.com
0 引言端粒酶是位于真核生物体内具有逆转录酶活性的核糖核酶[1-10].由于端粒酶具有 双重作用，其适量表达可以延缓端粒丢失速度，从而延缓细胞衰老[11]，但其过量 表达又是肿瘤细胞无限增殖的一个必要条件[12].近年来有关端粒酶在细胞衰老及 肿瘤治疗中的作用越来越受到人们的重视.目前研究发现端粒酶至少由端粒酶RNA(hTR)、端 粒酶相关蛋白(TP1)及端粒酶催化亚单位(hTERT/hTRT/hEST2)三个亚基组成，其中hTE RT对端粒酶活性表达起着决定性的作用[13,14].为此，我们采用基因重组技术，构 建了hTERT正、反义逆转录病毒载体，为进一步研究hTERT在正常细胞及肿瘤细胞中的作用奠 定基础.
1 材料和方法
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1.1 材料 pLXSN质粒由本所易少萱博士赠送，pGRN-145质粒由 美国Geron公司Okarma博士惠赠，全长14kb,载有3.5kb的hTERT cDNA.E.coli DH5α由 本室保存.限制性内切酶EcoRI, NotI, XhoI和牛小肠碱性磷酸酶(CIP)购自Tak aRa公司，T4连接酶和质粒提取试剂盒购自Promega公司，λDNA/HindⅢ marker, 凝胶 片段回收试剂盒购自Roche公司.
1.2 方法 质粒的提取和纯化采用Promega公司试剂盒 ，具体操作按说明书进行.hTERT cDNA的制备: hTERT cDNA全长3.45kb,位于pGRN-145质粒 两EcoRI酶切位点之间，用EcoRI酶切该质粒，8g·L-1琼脂糖电泳.用凝胶片段 回收试剂盒(Roche) 回收DNA小片段，去离子水溶解沉淀，-20℃冻存备用. pLXSN载体酶切 及5'端去磷酸化: 用EcoRI酶切pLXSN，使其线性化，试剂盒回收片段后，用牛小肠碱性 磷酸酶(CIP)对线性载体5'端去磷酸化.片段去磷酸化体系：H2O 33μL, 10xbuffer 5μL, CIP 2μL, 线性pLXSN 10μL.于37℃水浴1h，经8g·L-1琼脂糖电泳鉴定，试剂 盒回收片段，去离子水溶解，-20℃冻存备用.连接反应: 依次加入H2O 9μL，Buffer 2 μL，去磷酸化pLXSN片段4μL，T4连接酶1μL,总体积20μL,混匀后置4℃过夜. 质粒的转化和克隆挑选: 按常规方法取5μL连接产物转化DH5α感受态，挑取阳性转化菌落，质粒提取试剂盒提取质粒，NotI和XhoI鉴定pLXSN-hTERT重组质粒.
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2 结果
2.1 pGRN-145质粒的酶切及鉴定 hTERT cDNA全长3.4 5Kb，两端均含有EcoRI酶切位点.以EcoRI酶切质粒，经琼脂糖电泳后，所得酶切片 段与预期长度相符.
2.2 pLXSN逆转录病毒线性载体的制备 pLXSN载体经 EcoRI酶切后，成为5.9Kb的线性条带，酶切完全，大小正确.
2.3 hTERT正义及反义重组质粒的鉴定 在安苄青霉素L B平板上挑选3个菌落，提取质粒DNA，经NotI和XhoI双酶切，正义重组质粒 被切成1438和7838bp两个片段，与理论预期长度相符.说明成功构建了pLXSN-hTERT正、反 义重组质粒(图1).
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图1 重组正反义逆转录病毒载体质粒NotI，XhoI酶切鉴定图 谱1: Marker(λDNA/HindⅢ);
2: hTERT反义重组质粒；3： hTERT正义重组质粒.
3 讨论有研究表明，hTERT对端粒酶活性的调控起着决定性的作用[16-26].体细胞中由于 没有hTERT的活化，端粒酶不表达，细胞随着有丝分裂次数的增加，端粒长度逐渐缩短，而 肿瘤细胞中由于有hTERT的表达，端粒酶活化，细胞得以无限增殖.因此，只要活化原代正常 体细胞中的hTERT或抑制肿瘤细胞中的hTERT，就可以达到延长原代细胞寿命或抑制肿瘤生长 的目的[11,12,15].鉴于人体内某些细胞(如血管内皮细胞等)在体外增殖力弱， 传代能力差，单纯构建一般真核表达载体以及用传统脂质体转染方法很难将hTERT基因转入 这些细胞中.因此我们在计算机辅助分析的基础上，据人hTERT基因序列，成功构建了pLXSN -hTERT正、反逆转录病毒载体，为用逆转录病毒方法将hTERT正义基因导入原代培养的正常 体细胞中来研究hTERT在延缓细胞衰老中的作用创造了条件，同时其反义逆转录病毒载体亦为肿瘤的基因治疗奠定了基础.
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4 参考文献1 杨金亮，房殿春，杨仕明，罗元辉，鲁荣，罗昆仑，刘为纹.正反义人端粒酶RNA组分(hTR)基因真核表达载体的构建.
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2 陈兵，刘为纹，房殿春.端粒酶研究概况.世界华人消化杂志 2000;9：441-446
3 范公忍，汪毅，邬光惠，黄苏里. 端粒酶在原发性肝癌中的表达.世界华人消化杂志 2000; 8: 573
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6 朱兆华，夏忠胜，何守搞. 全反式维甲酸和5Fu对胃癌细胞端粒酶活性和细胞生长的影响.世界华人消化杂志 2000; 8: 669-673
7 王维，罗和生，余保平. 端粒酶与大肠癌.世界华人消化杂志 2000; 8：800-802
8 林勇，谢渭芬，陈伟忠，张新，张兴荣，张忠兵，沈建伟.c-myc调节人端粒酶逆转录酶启动子活性的体外研究.
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10 Yang SM, Fang DC, Yang JL, Luo YH, Lu R, Battle PD, Liu WW. Alteration of telomerase activity and terminal restriction
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12 杨仕明，房殿春，罗元辉，鲁荣，刘为纹. 胃癌及癌前组织中端粒酶活性的检测及临床意义.中华医学杂志 1998;78:207-209
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13 Harada K, Yasoshima M, Ozak S, Sanzen T, Nakanuma Y. PCR and in situ hybridization studies of telomerase subunits in humna
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14 杨仕明，房殿春，杨金亮，鲁荣，刘为纹，罗云辉. 不同病变胃黏膜端粒酶活性及其亚单位的检测. 癌症 2001; 20:23-27
15 杨仕明，房殿春，杨金亮，鲁荣，刘为纹，罗云辉，陈兵.人端粒酶蛋白催化亚单位反义基因转染对胃癌细胞恶性表型的逆转作用.
第三军医大学学报 2001; 23: 934-937
, 百拇医药
16 杨仕明，房殿春，杨金亮，鲁荣，刘为纹.胃肠道黏膜下肿瘤端粒酶表达的意义.世界华人消化杂志 1998; 6: 765-767
17 许兰涛，马力.端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸对肝癌细胞影响的研究.世界华人消化杂志 2000; 8: 1065-1066
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19 Feng DY, Zheng H, Fu CY, ChengRX. An improvement method for the detection of in situ telomerase activity: in situ telomerase
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activity labeling. World J Gastroenterol 1999;5:535-537
20 Yakoob J, Hu GL, Fan XG, Zhang Z. Telomere,telomerase and digestive cancer. World J Gastroenterol 1999; 5: 334-337
21 傅建民，余小舫，邵永孚. 端粒酶与原发性肝癌.世界华人消化杂志 2000;8: 46 1-463
22 凌红，陈惠心，李韶光，曾宏，刘集鸿，童志勇. 不同胃黏膜病变组织端粒酶活 性表达.世界华人消化杂志 2000;8:585-58
23 曲波，李宝杰，吕志武，潘海乐. 细针肝穿刺标本检测端粒酶诊断肝癌的意义. 世界华人消化杂志 2001; 9: 538-541
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24 张方信，邓学庸，康生朝，汪泳，余西林，王宏，卞晓红. 胃癌患者术后端粒长 度变化与预后观察.世界华人消化杂志 2000;8: 153-155
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26 李正生，朱正纲，尹浩然，陈诗书，林言.转基因肿瘤细胞的端粒酶活性表达 人和小鼠的差异性.世界华人消化杂志 1999; 7: 194-196, 百拇医药(梁光萍，罗向东，陈 渝，齐 洁，杨宗城)