食管癌组织中DPC4基因的失活
周海波，山东省立医院消化科 山东省济南市 250052
颜云，李国庆，丰义宽，辛桂霞，潍坊市人民医院 山东省潍坊市 261041
项目负责人 李国庆，261041，山东省潍坊市奎文区广文街4号，潍坊市人民医院. lgq@fm365.com.cn
山东省医药卫生科研项目，No.1999B13
电话：0536-8234981-101
收稿日期 2001-01-08 接受日期 2001-01-11
摘要
, 百拇医药
目的:检测DPC4基因在食管癌及其癌旁组织中的失活.
方法:采用聚合酶链反应(PCR)、单链构象多态性分析(SSCP)检测42例食管 癌及其癌旁组织的DPC4基因失活情况.
结果:在食管癌组织标本42例中4例出现DPC4基因缺失，3例出现DPC4 基因第11位外显子突变；而其癌旁组织则无DPC4基因突变或缺失，有显著性差异.
结论:DPC4基因作为一个抑癌基因，参与了食管癌的发生.
, 百拇医药
周海波，颜云，李国庆，丰义宽，辛桂霞. 食管癌组织中DPC4基因的失活. 世 界华人消化杂志 2002;10(1):102-103
0 引言抑癌基因是正常细胞增殖的重要稳定因素, 抑癌基因的失活是导致肿瘤发生的重要因素. DP C4基因是最近克隆出的定位于人染色体18q21上的一个抑癌基因，他的失活在胰腺 癌的发生、发展中可能起重要作用.正如胰腺癌一样，食管癌也频繁发生18q21的缺失 ，DPC4基因的失活可能参与其发生、发展.我们通过聚合酶链反应(PCR)、单链构象多态 性分析(SSCP)分别对30例食管癌组织标本及其癌旁组织标本进行研究，探讨食管癌中DPC 4基因失活情况.
1 材料和方法
, http://www.100md.com
1.1 材料 1998-10/2000-1潍坊市人民医院病理证实的食管 癌30例，内镜下取癌组织及其癌旁组织标本，所有组织标本在液氮中快速冷冻，并保存于— 80℃.
1.2 方法 DNA的提取按常规方法.OD260/OD280 >1.7, OD260/OD230>2.07，DNA于-20℃储存.DPC4基因共有11个外显子，其引物碱基序列取 自http://www.med.jhu.edu/pancreas/index.htm，由上海生物工程公司合成.PCR扩增反应 体系共25μL，含10×PCR缓冲液2.5μL,正负链引物各0.5μL, 10mmol.L-1 dNTP S 0.5μL,5mu.L-1 Taq酶0.1μL, 灭菌三蒸菌水10.9μL, 50g.L-1模板DNA 10μL,混匀离心后,加20μL无菌石蜡油，94℃预变性1min，94℃变性30s，55℃退火30s ，72℃延伸1min，共重复35个循环，最后在72℃延伸10min.取5μLPCR扩增产物在20g.L-1琼脂糖凝胶上电泳分析. 单链构象多态性分析：取5μLPCR扩增产物与3μL加样缓冲液混合，95℃热变性5min，立 即转入冰浴10min.将变性DNA上样于0.5×MDE突变分析胶，采用垂直电泳装置，在4℃条件下 5W恒流电泳过夜.将凝胶转入100mL.L-1醋酸中室温固定20min，去离子水洗胶3次， 每次2min.用银染色液浸染凝胶30min，去离子水洗胶20s.凝胶置显影液中显影. 统计学处理 χ2检验.
, 百拇医药
2 结果在30例食管癌组织中有4例DPC4基因的第8位外显子均未扩增目的DNA产物，而其癌旁组织标本则全部扩增出目的DNA产物，表明食管癌的DPC4基因缺失率为4/30(图1).在30例食 管癌组织中有3例在DPC4基因第11位外显子处可见异常泳动带, 而其癌旁组织标本则均未见异常泳动带, 表明食管癌的DPC4基因突变率为3/30(图2).
图1 食管癌组织的DPC4基因缺失图示
图2 食管癌组织的DPC4基因第11位外显子突变图示
, 百拇医药
3 讨论食管癌是临床上常见的恶性肿瘤,发病率呈全球上升趋势,但人们对其发病机制不甚了解 [1-6].近年的分子生物学研究表明,该病的发生涉及多种癌基因和抑癌基因的改变,包 括Ki-ras,P16, P53, DCC等[7-15]，DPC4(deleted in pancreatic canc er locus 4 DPC4)基因是最近发现的一个新的抑癌基因,定位于18q21.1, DCC基因 着丝粒旁侧.DPC4基因有11个外显子和10个内含子，其核苷酸序保存在GeneBank的V44 378中.DPC4基因转录子长2680bp，编码552个氨基酸残基组成的蛋白质.DPC4基因序列 类似Mad基因，而Mad基因表达产物参与转化生长因子-β信号传导途径，这预示DPC4基因 的表达产物也具有类似重要功能.DPC4基因失活可能参与了不同肿瘤的发生[16-21 ],许多研究者对DPC4基因的失活是否参与食管癌的发生抱有不同意见，我们利用PCR、 SSCP方法对30例食管癌及30例相应癌旁组织进行了研究分析，探讨食管癌中DPC4基因失活 情况.
, http://www.100md.com
研究发现在30例食管癌组织中有4例DPC4基因第8位外显子均未扩增出目的DNA产物，而其 癌旁组织标本则全部扩增出目的DNA产物，表明食管癌的DPC4基因缺失率为4/30.30例食 管癌组织中有3例DPC4基因第11位外显子处可见异常泳动带, 而其癌旁组织标本则均未见 异常泳动带, 表明食管癌的DPC4基因突变率为3/30.我们利用PCR，SSCP方法分析发现DP C4基因的改变主要发生于第8和11位外显子,表明食管癌中不仅有DPC4基因缺失,还存在D PC4基因第11位外显子突变.文献报道的改变率不一,可能是:①原发性肿瘤标本中存在间质 细胞和炎性细胞导致假阳性.②中国的食管癌患者DPC4基因的改变率与欧美国家不同.③需 要积累更多的病例,以进一步分析探讨中国的食管癌患者DPC4基因的改变情况. 总之，我们认为DPC4基因作为一个抑癌基因参与了食管癌发生，但该基因的失活在上述肿 瘤发生中所起的作用及作用大小还需要做进一步细致的研究.
, 百拇医药
4 参考文献1 Chen KN, Xu GW. Diagnosis and treatment of esophageal cancer. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2000;8:196-202
2 Lin J, Deng CS, Sun J, Zhou Y, Xiong P, Wang YP. Study on the genetic susceptibility of HLA-DQB1 alleles in esophageal cancer
of Hubei Chinese Hans. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2000;8:965-968
3 Huang ZZ, Wu XY, Liang YR, Li QS, Shen J. Immunohistochemical study of esophageal basaloid squamous cell carcinoma.
, 百拇医药
Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2000;8:1097-1100
4 Shen ZY, Shen WY, Chen MH, Hong CQ, Shen J. Alterations of nitric oxide in apoptosis of esophageal carcinoma cells induced
by arsenite.Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2000;8:1101-1104
5 Wu QM, Li SB, Wang Q, Wang DH, Li XB, Liu CZ. The expression of COX-2 in esophageal carcinoma and its relation to
clinicopathologic characteristic. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2001;9:11-14
, http://www.100md.com
6 Tan LJ, Jiang W, Zhang N, Zhang XR, Qiu DH. Fas/FasL expression of esophagea l squamous cell carcinoma, dysplasia tissues
and normal mucosa. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2001;9:15-19
7 Zou JX, Wang LD, Shi T, Yang GY, Xue ZH, Gao SS, Li YX, Yang Chung S. P53 gene mutations in multifocal esophageal
precancerous and cancerous lesions in p atients with esophageal cancer in high risk northern China.
, 百拇医药
Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 1999;7:280-284
8 Yu WL, Huang ZH. P16 gene and digestive tract neoplasms. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 1999;7:1061-1062
9 Liu J,Su Q,Zhang W.Relationship between HPV-E6 P53 protein and esophageal sq uamous cell carcinoma.
Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2000;8:494-496
10 杜铭, 曾昭淳, 李静, 李良彬. 食管鳞癌组织P16基因缺失及突变 的研究. 世界华人消化杂志 2000；8：574-575
, http://www.100md.com
11 Qin HY,Shu Q,Wang D,Ma QF.Study on genetic polymorphisms of DCC gene V NTR in esophageal cancer.
Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2000;8:782-785
12 Liu J, Chen SL, Zhang W, Su Q. P21-WAF1 gene expression with P53 muta tion in esophageal carcinoma.
Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2000;8:1350-1353
13 Wang LD, Chen H, Guo LM. Alterations of tumor suppressor gene system P53-Rb and human esophageal carcinogenesis.
, 百拇医药
Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2001;9:367-371
14 Wei ZB, Wang LB, Tian BS, Wang JL, Sun XF, Wei JP, Liu N, Wang JH. Lug ol＇s staining with p53 oncoproteins in detecting
early esophageal cancer. Shi jie Huaren Xiaohua Zazhi 2001;9:495-498
15 Zhou YA, Gu ZP, Wang XN, Ma QF, Huang LJ. Re-expression of P16 ge ne suppresses growth of human esophageal carcinoma
cells. Shijie Huaren Xiaohu a Zazhi 2001;9:877-881
, 百拇医药
16 Takakura S, Okamoto A, Saito M, Yasuhara T,Shinozaki H, Isonishi S, Y oshimura T, Ohtake Y,Ochiai K, Tanaka T. Allelic imbalance
in chromosome band 18 q21 and SMAD4 mutation in ovarian cancers. Genes Chromosome Cancer 1999;24:264-271
17 Bartsch D, Barth P, Bastian D, Ramaswamy A, Gerdes B, Chaloupka B, De iss Y, Simon B, Schudy A. Higher frequnency of DPC4/
Smad4 alteration in pancrea tic cancer cell lines than in primary pancreatic carcinoma. Cancer Lett 1999 ;139:43-49
, http://www.100md.com
18 Koyama M, ItoM, Nagai H, Emi M, Moriyama Y. Inactivation of both alle les of DPC4 gene in advanced colorectal cancers:
identification of seven normal somatic mutations in tumors from Japanese patients. Mutat Res 1999;406：71-77
19 Barbera VM, Martin M, Marnoso L, Munne A, Real FX, Fabre M. The 18q21 region in colorectal and pancreatic cancer:
independent loss of DCC and DPC4 exp ression. Biochim Biophys Acta 2000;1502:283-296
, 百拇医药
20 Hadija MP, Kapitanovic S, Radosevic S, Cacev T, Mirt M, Kovacevic D, C acve T, Hadziji M, Spaventi R, Pavelic K. Loss of
heterozygosity of DPC4 tumor suppressor gene human sporadic coloc cancer. J Mol Med 2001;79:128-132
21 Luttges J, Galehdari H, Brocker V, Schwarte-Waldhoff I, Bruns D, Klo ppel G, Schmiegel W, Hahn SA. Allelic loss is often the first
hit in the bialli c inactivation of the P53 and DPC4 genes during pancreatic carcinogenesis. Am J Pathpl 2001; 158:1561-1563, http://www.100md.com(周海波，颜 云，李国庆，丰义宽，辛桂霞)
颜云，李国庆，丰义宽，辛桂霞，潍坊市人民医院 山东省潍坊市 261041
项目负责人 李国庆，261041，山东省潍坊市奎文区广文街4号，潍坊市人民医院. lgq@fm365.com.cn
山东省医药卫生科研项目，No.1999B13
电话：0536-8234981-101
收稿日期 2001-01-08 接受日期 2001-01-11
摘要
, 百拇医药
目的:检测DPC4基因在食管癌及其癌旁组织中的失活.
方法:采用聚合酶链反应(PCR)、单链构象多态性分析(SSCP)检测42例食管 癌及其癌旁组织的DPC4基因失活情况.
结果:在食管癌组织标本42例中4例出现DPC4基因缺失，3例出现DPC4 基因第11位外显子突变；而其癌旁组织则无DPC4基因突变或缺失，有显著性差异.
结论:DPC4基因作为一个抑癌基因，参与了食管癌的发生.
, 百拇医药
周海波，颜云，李国庆，丰义宽，辛桂霞. 食管癌组织中DPC4基因的失活. 世 界华人消化杂志 2002;10(1):102-103
0 引言抑癌基因是正常细胞增殖的重要稳定因素, 抑癌基因的失活是导致肿瘤发生的重要因素. DP C4基因是最近克隆出的定位于人染色体18q21上的一个抑癌基因，他的失活在胰腺 癌的发生、发展中可能起重要作用.正如胰腺癌一样，食管癌也频繁发生18q21的缺失 ，DPC4基因的失活可能参与其发生、发展.我们通过聚合酶链反应(PCR)、单链构象多态 性分析(SSCP)分别对30例食管癌组织标本及其癌旁组织标本进行研究，探讨食管癌中DPC 4基因失活情况.
1 材料和方法
, http://www.100md.com
1.1 材料 1998-10/2000-1潍坊市人民医院病理证实的食管 癌30例，内镜下取癌组织及其癌旁组织标本，所有组织标本在液氮中快速冷冻，并保存于— 80℃.
1.2 方法 DNA的提取按常规方法.OD260/OD280 >1.7, OD260/OD230>2.07，DNA于-20℃储存.DPC4基因共有11个外显子，其引物碱基序列取 自http://www.med.jhu.edu/pancreas/index.htm，由上海生物工程公司合成.PCR扩增反应 体系共25μL，含10×PCR缓冲液2.5μL,正负链引物各0.5μL, 10mmol.L-1 dNTP S 0.5μL,5mu.L-1 Taq酶0.1μL, 灭菌三蒸菌水10.9μL, 50g.L-1模板DNA 10μL,混匀离心后,加20μL无菌石蜡油，94℃预变性1min，94℃变性30s，55℃退火30s ，72℃延伸1min，共重复35个循环，最后在72℃延伸10min.取5μLPCR扩增产物在20g.L-1琼脂糖凝胶上电泳分析. 单链构象多态性分析：取5μLPCR扩增产物与3μL加样缓冲液混合，95℃热变性5min，立 即转入冰浴10min.将变性DNA上样于0.5×MDE突变分析胶，采用垂直电泳装置，在4℃条件下 5W恒流电泳过夜.将凝胶转入100mL.L-1醋酸中室温固定20min，去离子水洗胶3次， 每次2min.用银染色液浸染凝胶30min，去离子水洗胶20s.凝胶置显影液中显影. 统计学处理 χ2检验.
, 百拇医药
2 结果在30例食管癌组织中有4例DPC4基因的第8位外显子均未扩增目的DNA产物，而其癌旁组织标本则全部扩增出目的DNA产物，表明食管癌的DPC4基因缺失率为4/30(图1).在30例食 管癌组织中有3例在DPC4基因第11位外显子处可见异常泳动带, 而其癌旁组织标本则均未见异常泳动带, 表明食管癌的DPC4基因突变率为3/30(图2).
图1 食管癌组织的DPC4基因缺失图示
图2 食管癌组织的DPC4基因第11位外显子突变图示
, 百拇医药
3 讨论食管癌是临床上常见的恶性肿瘤,发病率呈全球上升趋势,但人们对其发病机制不甚了解 [1-6].近年的分子生物学研究表明,该病的发生涉及多种癌基因和抑癌基因的改变,包 括Ki-ras,P16, P53, DCC等[7-15]，DPC4(deleted in pancreatic canc er locus 4 DPC4)基因是最近发现的一个新的抑癌基因,定位于18q21.1, DCC基因 着丝粒旁侧.DPC4基因有11个外显子和10个内含子，其核苷酸序保存在GeneBank的V44 378中.DPC4基因转录子长2680bp，编码552个氨基酸残基组成的蛋白质.DPC4基因序列 类似Mad基因，而Mad基因表达产物参与转化生长因子-β信号传导途径，这预示DPC4基因 的表达产物也具有类似重要功能.DPC4基因失活可能参与了不同肿瘤的发生[16-21 ],许多研究者对DPC4基因的失活是否参与食管癌的发生抱有不同意见，我们利用PCR、 SSCP方法对30例食管癌及30例相应癌旁组织进行了研究分析，探讨食管癌中DPC4基因失活 情况.
, http://www.100md.com
研究发现在30例食管癌组织中有4例DPC4基因第8位外显子均未扩增出目的DNA产物，而其 癌旁组织标本则全部扩增出目的DNA产物，表明食管癌的DPC4基因缺失率为4/30.30例食 管癌组织中有3例DPC4基因第11位外显子处可见异常泳动带, 而其癌旁组织标本则均未见 异常泳动带, 表明食管癌的DPC4基因突变率为3/30.我们利用PCR，SSCP方法分析发现DP C4基因的改变主要发生于第8和11位外显子,表明食管癌中不仅有DPC4基因缺失,还存在D PC4基因第11位外显子突变.文献报道的改变率不一,可能是:①原发性肿瘤标本中存在间质 细胞和炎性细胞导致假阳性.②中国的食管癌患者DPC4基因的改变率与欧美国家不同.③需 要积累更多的病例,以进一步分析探讨中国的食管癌患者DPC4基因的改变情况. 总之，我们认为DPC4基因作为一个抑癌基因参与了食管癌发生，但该基因的失活在上述肿 瘤发生中所起的作用及作用大小还需要做进一步细致的研究.
, 百拇医药
4 参考文献1 Chen KN, Xu GW. Diagnosis and treatment of esophageal cancer. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2000;8:196-202
2 Lin J, Deng CS, Sun J, Zhou Y, Xiong P, Wang YP. Study on the genetic susceptibility of HLA-DQB1 alleles in esophageal cancer
of Hubei Chinese Hans. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2000;8:965-968
3 Huang ZZ, Wu XY, Liang YR, Li QS, Shen J. Immunohistochemical study of esophageal basaloid squamous cell carcinoma.
, 百拇医药
Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2000;8:1097-1100
4 Shen ZY, Shen WY, Chen MH, Hong CQ, Shen J. Alterations of nitric oxide in apoptosis of esophageal carcinoma cells induced
by arsenite.Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2000;8:1101-1104
5 Wu QM, Li SB, Wang Q, Wang DH, Li XB, Liu CZ. The expression of COX-2 in esophageal carcinoma and its relation to
clinicopathologic characteristic. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2001;9:11-14
, http://www.100md.com
6 Tan LJ, Jiang W, Zhang N, Zhang XR, Qiu DH. Fas/FasL expression of esophagea l squamous cell carcinoma, dysplasia tissues
and normal mucosa. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2001;9:15-19
7 Zou JX, Wang LD, Shi T, Yang GY, Xue ZH, Gao SS, Li YX, Yang Chung S. P53 gene mutations in multifocal esophageal
precancerous and cancerous lesions in p atients with esophageal cancer in high risk northern China.
, 百拇医药
Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 1999;7:280-284
8 Yu WL, Huang ZH. P16 gene and digestive tract neoplasms. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 1999;7:1061-1062
9 Liu J,Su Q,Zhang W.Relationship between HPV-E6 P53 protein and esophageal sq uamous cell carcinoma.
Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2000;8:494-496
10 杜铭, 曾昭淳, 李静, 李良彬. 食管鳞癌组织P16基因缺失及突变 的研究. 世界华人消化杂志 2000；8：574-575
, http://www.100md.com
11 Qin HY,Shu Q,Wang D,Ma QF.Study on genetic polymorphisms of DCC gene V NTR in esophageal cancer.
Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2000;8:782-785
12 Liu J, Chen SL, Zhang W, Su Q. P21-WAF1 gene expression with P53 muta tion in esophageal carcinoma.
Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2000;8:1350-1353
13 Wang LD, Chen H, Guo LM. Alterations of tumor suppressor gene system P53-Rb and human esophageal carcinogenesis.
, 百拇医药
Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2001;9:367-371
14 Wei ZB, Wang LB, Tian BS, Wang JL, Sun XF, Wei JP, Liu N, Wang JH. Lug ol＇s staining with p53 oncoproteins in detecting
early esophageal cancer. Shi jie Huaren Xiaohua Zazhi 2001;9:495-498
15 Zhou YA, Gu ZP, Wang XN, Ma QF, Huang LJ. Re-expression of P16 ge ne suppresses growth of human esophageal carcinoma
cells. Shijie Huaren Xiaohu a Zazhi 2001;9:877-881
, 百拇医药
16 Takakura S, Okamoto A, Saito M, Yasuhara T,Shinozaki H, Isonishi S, Y oshimura T, Ohtake Y,Ochiai K, Tanaka T. Allelic imbalance
in chromosome band 18 q21 and SMAD4 mutation in ovarian cancers. Genes Chromosome Cancer 1999;24:264-271
17 Bartsch D, Barth P, Bastian D, Ramaswamy A, Gerdes B, Chaloupka B, De iss Y, Simon B, Schudy A. Higher frequnency of DPC4/
Smad4 alteration in pancrea tic cancer cell lines than in primary pancreatic carcinoma. Cancer Lett 1999 ;139:43-49
, http://www.100md.com
18 Koyama M, ItoM, Nagai H, Emi M, Moriyama Y. Inactivation of both alle les of DPC4 gene in advanced colorectal cancers:
identification of seven normal somatic mutations in tumors from Japanese patients. Mutat Res 1999;406：71-77
19 Barbera VM, Martin M, Marnoso L, Munne A, Real FX, Fabre M. The 18q21 region in colorectal and pancreatic cancer:
independent loss of DCC and DPC4 exp ression. Biochim Biophys Acta 2000;1502:283-296
, 百拇医药
20 Hadija MP, Kapitanovic S, Radosevic S, Cacev T, Mirt M, Kovacevic D, C acve T, Hadziji M, Spaventi R, Pavelic K. Loss of
heterozygosity of DPC4 tumor suppressor gene human sporadic coloc cancer. J Mol Med 2001;79:128-132
21 Luttges J, Galehdari H, Brocker V, Schwarte-Waldhoff I, Bruns D, Klo ppel G, Schmiegel W, Hahn SA. Allelic loss is often the first
hit in the bialli c inactivation of the P53 and DPC4 genes during pancreatic carcinogenesis. Am J Pathpl 2001; 158:1561-1563, http://www.100md.com(周海波，颜 云，李国庆，丰义宽，辛桂霞)