细胞外基质基因在肝脏的表达与调控
贾继东，尹姗姗，王宝恩，首都医科大学附属北京友谊医院肝病研究中心 北京市 100050
项目负责人 贾继东，100050，北京市，首都医科大学附属北京友谊医院肝病研究中心
收稿日期 2001-08-09 接受日期 2001-12-14
贾继东，尹姗姗，王宝恩.细胞外基质基因在肝脏的表达与调控.世界华人消化杂志 2002;10(1):56-57
0 引言细胞外基质(ECM)是结构和功能高度复杂的生命大分子，他们不仅对于维持细胞的形态和结构起重要作用，而且对于细胞的生长、分化、代谢、信号传导等功能有重要影响[1].ECM的基因表达处于复杂而精细的调控之中, 在生理及病理状态下各种细胞因子、化学物质(如CCL4， 乙醛及脂质过氧化产物)甚至物理因素(如应力)都可以影响ECM的基因表达[1-3].I型胶原是ECM的主要成分之一，由两条proα1(Ⅰ)肽链(COL1A1)和一条proα2(Ⅰ)肽链(COL1A2)组成，分别由位于不同染色体上的两个基因编码.以人类为例，其COL1A1基因位于第17号染色体 (q21.3-22)，有51个外显子; COL1A2基因位于第7号染色体(q2.3-33)，有52个外显子.外加长度均在20kb以上的5′和3′端序列，人的COL1A1基因总长度可达65kb.本文将以Ⅰ型胶原为例简要介绍ECM基因在肝脏表达调控的几个方面：即染色质结构、DNA甲基化以及各种调节因子的影响.
, 百拇医药
1 染色质结构的影响哺乳动物的基因组形成拓扑结构上紧密程度不等的染色质.一般来说，染色质越致密则基因不活跃；反之，染色质较松弛则有利于基因的表达.因此，某种基因的染色质在不同组织和细胞中的总的拓扑结构可能决定该基因是否表达，而某一基因染色质局部拓扑结构的发生改变使得一些反式调节因子(蛋白或多肽)从空间上能够与相应的顺式调节元件(基因序列)结合从而发挥调节作用.
2 DNA甲基化作用基因上CG相连的序列中C可以发生甲基化，而甲基化的程度可以影响基因的表达.其作用机制可能为甲基化影响了DNA与转录因子(激活或阻遏)的结合从而直接影响了基因的表达，或者由于甲基化的DNA与非特异性甲基-CG结合蛋白相互作用改变了基因染色质的结构从而间接影响基因的表达.有研究表明COL1A1基因第一个外显子的甲基化程度与其表达水平成反比.最近Sengupta et al用体外转染实验发现COL1A2基因的第一个外显子起始部分的甲基化也可以明显抑制该基因的表达，其机制可能是甲基化使得该序列与一种阻遏蛋白结合[4].
, 百拇医药
3 细胞因子的影响能够调控胶原基因表达的因素很多，包括各种生长因子、细胞因子及各种理化因子.以下仅以促进和抑制I型胶原基因表达的两个细胞因子为例，介绍其调控机制.
3.1 转化生长因子β1(TGFβ1) 是目前研究的最多的促进纤维化的细胞因子[2]，体外和体内[5, 6]研究均表明TGFβ1能促进Ⅰ型胶原基因的表达.他通常以同二聚体的形式存在，通过与具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性的Ⅱ型和Ⅰ型受体结合，激活细胞内的Smad信号传导途径，形成Smad 2、Smad 3、Smad 4复合物并进入细胞核内与DNA结合蛋白相互作用从而发挥转录激活因子的作用[7].最近Schnable et al 用基因敲除小鼠研究发现， Smad3对于介导TGFβ1所诱导的肝脏星状细胞激活，特别是COL1A1和COL1A2的高表达是必需的[8].人的I型胶原基因增强子区有AP1(activator protein1)结合序列(+590至+625bp)，而TGFβ1处理的星状细胞之核提取物有很强的AP1结合活性，提示TGFβ1对COL1A1基因表达的上调作用是通过诱导细胞产生AP1而实现的.最近Garcia-Trevijano et al发现TGFβ1可以诱导C/EBPβ(CCAAT/enhancer binding protein β)转录激活因子复合物，使之与大鼠COL1A1基因启动子中的TGFβ1应答元件(-370至-344bp)结合而促进该基因表达[9].
, 百拇医药
Inagaki et al报道激活的大鼠肝脏星状细胞(CFSC-5H)也产生一种能与COL1A2基因TGFβ1应答元件(-378到-183bp之间)相结合的蛋白，从而促进其mRNA的表达.给转基因小鼠腹腔注射CCL4可使其携带的含有TGFβ1应答元件的COL1A2启动子(-17kb)的活性升高10倍，而CCL4损伤能够在体内激活肝脏非实质细胞COL1A2基因启动子中的TGFβ1应答元件(-330bp)，从而上调COL1A2的基因表达[10].该作者还观察到肝细胞中与COL1A2基因启动子中TGFb应答元件(313至225bp)结合的是Sp3, 而HSC中与此元件结合的是Sp1，这可以部分解释肝细胞和星状细胞在表达I型胶原水平方面的差异[11].1999年，Kanzler et al[6]建立了一种转基因小鼠肝纤维化模型，这种小鼠能特异性地在肝脏中表达C反应蛋白/活化型TGFβ1融合基因(受可诱导性C反应蛋白基因启动子调控元件控制).在基础状态下其血浆TGFβ1水平为正常小鼠的2～5倍，当给与100μg脂多糖腹腔注射后15h，转基因小鼠的血浆TGFβ1水平达>600μg·L-1，为正常小鼠的100倍，随后小鼠肝脏COL1A1及COL1A2 mRNA表达增加.反复多次诱导之后即可在肝组织上见到星状细胞激活及胶原沉积等肝纤维化表现.这种模型不仅再次证明了TGFβ1在体内对于星状细胞激活及胶原基因表达的直接调控作用，而且可用于探讨肝纤维化的发生机制及观察抗纤维化治疗的效果.
, 百拇医药
3.2 肿瘤坏死因子α(TNFα) 是由巨噬细胞或淋巴细胞产生的炎症性递质，体外细胞培养实验表明在激活的肝脏星状细胞中他能降低COL1A1 mRNA的转录活性因而抑制I型胶原的表达[12]，给裸鼠接种能分泌TNFα的中国地仓鼠卵细胞也能抑制其肝脏COL1A1 mRNA表达[13].有研究发现TNF抑制COL1A1表达的作用是通过对百日咳毒素敏感的G蛋白介导的，其细胞内的信号传导则通过神经酰胺/鞘磷脂酶途径.转基因小鼠及细胞转染实验发现在肝脏星状细胞中，COL1A1基因中的TNFα应答元件位于第一个外显子上游220bp处[13].TNFα可以诱导核转录因子NF-κB的表达, 而体外转染实验发现NF-κB能在成纤维细胞和肝星状细胞中降低COL1A1 mRNA的转录，其机制可能是NF-κB与COL1A1基因启动子中的Sp1结合位点相结合，因而阻断了Sp1对于I型胶原的表达的促进作用[14].最近，Iraburu et al[15]发现COL1A1基因的启动子区有一个TaRE (TNF-α-responsive element)(-378至-345)，TNFα可以诱导p20C/EBPβ、p35C/EBPβ和C/EBPδ进入细胞核内并和这一调控元件结合.这一应答元件与以前报道的TGFβ1应答元件处于同一位置，提示COL1A1启动子区-378到-340bp处是各种不同刺激最终共同调控的元件[15].
, 百拇医药
对胶原基因表达调控的深入了解有助于阐明肝纤维化发生机制及探寻新的抗纤维化疗法[16].但必须指出，目前对胶原基因表达调控及信号传导的知识多是基于在体外针对某个环节的实验研究得到的，因而不一定能真实、完整地反映在机体内的实际效应.例如， TGFβ1能够促进胶原的表达、并抑制胶原的降解，显然是促进纤维化的重要因子；但同时他有很强的抑制免疫应答和炎症反应的功能，因而也可能有抗纤维化作用[1].又如，TNFα可以抑制I型胶原的基因表达、促进胶原酶的基因表达，似有对抗纤维化的作用；但他同时也有很强的促进炎症反应的作用，很可能通过其他环节促进纤维化[17,18].另外细胞内信号传导途径不仅是纵向的，而且也有横向的联系.因此，在解释实验结果和设计抗纤维化治疗时必须从整体的观点来考虑.
4 参考文献1 Bissell DM. Hepatic fibrosis as wound repair: a progress report. J Gastroenterol 1998;33:295-302
, 百拇医药
2 Friedman SL. Cytokines and fibrogenesis. Semin Liver Dis 1999;19:129-140
3 Chiquet M. Regulation of extracellular matrix gene expression by mechanical stress. Matrix Biol 1999;18:417-426
4 Sengupta PK, Smith BD. Methylation in the initiation region of the first exon suppresses collagen pro-α2(Ⅰ) gene transcription.
Biochim Biophys Acta 1998;1443:75-89
5 Roulot D, Sevcsik AM, Coste T, Strosberg AD, Marullo S. Role of transforming growth factor βtype II receptor in hepatic fibrosis:
, 百拇医药
studies of human chronic hepatitis C and experimental fibrosis in rats. Hepatology 1999;29:1730-1738
6 Kanzler S, Lohse AW, Keil A, Henninger J, Dienes HP, Schirmacher P, Rose-John S, zum Buschenfelde KH, Blessing M. TGF-β1 in
liver fibrosis: an inducible transgenic mouse model to study liver fibrogenesis. Am J Physiol 1999;276:G1059-1068
7 Wrana JL. TGF-β receptors and signalling mechanisms. Miner Electrol Metab 1998;24:120-130
, 百拇医药
8 Schnabl B, Kweon YO, Frederick JP, Wang XF, Rippe RA, Brenner DA. The role of Smad3 in mediating mouse hepatic stellate cell
activation. Hepatology 2001 ;34:89-100
9 Garcia-Trevijano ER, Iraburu MJ, Fontana L, Dominguez-Rosales JA, Auster A, Covarrubias-Pinedo A, Rojkind M. Transforming growth
factor β1 induces the e xpression of α1(I) procollagen mRNA by a hydrogen peroxide-C/EBPβ-dependen t mechanism in rat hepatic
, 百拇医药
stellate cells. Hepatology 1999;29:960-970
10 Inagaki Y, Truter S, Bou-Gharios G, Garrett LA, de Crombruggh e B, Nemoto T, Greenwel P. Activation of Proα2(I) collagen
promoter during hep atic fibrogenesis in transgenic mice. Biochem Biophys Res Commun 1998;250:6 06-611
11 Inagaki Y, Nemoto T, Nakao A, Dijke P, Kobayashi K, Takehara K, Greenw el P. Interaction between GC box binding factors and
, http://www.100md.com
Smad proteins modulates cel l lineage-specific α2(I) collagen gene transcription. J Biol Chem 2001;276:16573-16579
12 赵东强，张晓岚，姜慧卿. TNF-α与肝星状细胞. 世界华人消化杂志 2001；9 ：947-948
13 Houglum K, Buck M, Kim DJ, Chojkier M. TNF-α inhibits liver collage n-α 1(I) gene expression through a tissue-specific regulatory
region. Am J Physiol 1998;274:G840-847
14 Rippe RA, Schrum LW, Stefanovic B, Solis-Herruzo JA, Brenner DA. NF- κB inhibits expression of the α1(I) collagen gene.
, 百拇医药
DNA Cell Biol 1999;18: 751-761
15 Iraburu MJ, Dominguez-Rosales JA, Fontana L, Auster A, Garcia-Trevij ano ER, Covarrubias-Pinedo A, Rivas-Estilla AM, Greenwel P,Rojkind M. Tumor n ecrosis factor α down-regulates expression of the α1(I) collagen gene in rat hepatic stellate cells through a
p20C/EBPβ-and C/EBPδ-dependent mechani sm. Hepatology 2000;31:1086-1093
16 黄光存，张锦生. 肝星状细胞激活的细胞内信号转导. 世界华人消化杂志 2001 ；9：1056-1060
, 百拇医药
17 Friedman SL. Molecular regulation of hepatic fibrosis, an integrated c ellular response to tissue injury.
J Biol Chem 2000;275:2247-2250
18 Li D, Friedman SL. Liver fibrogenesis and the role of hepatic stellate cells: new insights and prospects for therapy.
J Gastroenterol Hepatol 1999;14:618-633, 百拇医药
项目负责人 贾继东，100050，北京市，首都医科大学附属北京友谊医院肝病研究中心
收稿日期 2001-08-09 接受日期 2001-12-14
贾继东，尹姗姗，王宝恩.细胞外基质基因在肝脏的表达与调控.世界华人消化杂志 2002;10(1):56-57
0 引言细胞外基质(ECM)是结构和功能高度复杂的生命大分子，他们不仅对于维持细胞的形态和结构起重要作用，而且对于细胞的生长、分化、代谢、信号传导等功能有重要影响[1].ECM的基因表达处于复杂而精细的调控之中, 在生理及病理状态下各种细胞因子、化学物质(如CCL4， 乙醛及脂质过氧化产物)甚至物理因素(如应力)都可以影响ECM的基因表达[1-3].I型胶原是ECM的主要成分之一，由两条proα1(Ⅰ)肽链(COL1A1)和一条proα2(Ⅰ)肽链(COL1A2)组成，分别由位于不同染色体上的两个基因编码.以人类为例，其COL1A1基因位于第17号染色体 (q21.3-22)，有51个外显子; COL1A2基因位于第7号染色体(q2.3-33)，有52个外显子.外加长度均在20kb以上的5′和3′端序列，人的COL1A1基因总长度可达65kb.本文将以Ⅰ型胶原为例简要介绍ECM基因在肝脏表达调控的几个方面：即染色质结构、DNA甲基化以及各种调节因子的影响.
, 百拇医药
1 染色质结构的影响哺乳动物的基因组形成拓扑结构上紧密程度不等的染色质.一般来说，染色质越致密则基因不活跃；反之，染色质较松弛则有利于基因的表达.因此，某种基因的染色质在不同组织和细胞中的总的拓扑结构可能决定该基因是否表达，而某一基因染色质局部拓扑结构的发生改变使得一些反式调节因子(蛋白或多肽)从空间上能够与相应的顺式调节元件(基因序列)结合从而发挥调节作用.
2 DNA甲基化作用基因上CG相连的序列中C可以发生甲基化，而甲基化的程度可以影响基因的表达.其作用机制可能为甲基化影响了DNA与转录因子(激活或阻遏)的结合从而直接影响了基因的表达，或者由于甲基化的DNA与非特异性甲基-CG结合蛋白相互作用改变了基因染色质的结构从而间接影响基因的表达.有研究表明COL1A1基因第一个外显子的甲基化程度与其表达水平成反比.最近Sengupta et al用体外转染实验发现COL1A2基因的第一个外显子起始部分的甲基化也可以明显抑制该基因的表达，其机制可能是甲基化使得该序列与一种阻遏蛋白结合[4].
, 百拇医药
3 细胞因子的影响能够调控胶原基因表达的因素很多，包括各种生长因子、细胞因子及各种理化因子.以下仅以促进和抑制I型胶原基因表达的两个细胞因子为例，介绍其调控机制.
3.1 转化生长因子β1(TGFβ1) 是目前研究的最多的促进纤维化的细胞因子[2]，体外和体内[5, 6]研究均表明TGFβ1能促进Ⅰ型胶原基因的表达.他通常以同二聚体的形式存在，通过与具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性的Ⅱ型和Ⅰ型受体结合，激活细胞内的Smad信号传导途径，形成Smad 2、Smad 3、Smad 4复合物并进入细胞核内与DNA结合蛋白相互作用从而发挥转录激活因子的作用[7].最近Schnable et al 用基因敲除小鼠研究发现， Smad3对于介导TGFβ1所诱导的肝脏星状细胞激活，特别是COL1A1和COL1A2的高表达是必需的[8].人的I型胶原基因增强子区有AP1(activator protein1)结合序列(+590至+625bp)，而TGFβ1处理的星状细胞之核提取物有很强的AP1结合活性，提示TGFβ1对COL1A1基因表达的上调作用是通过诱导细胞产生AP1而实现的.最近Garcia-Trevijano et al发现TGFβ1可以诱导C/EBPβ(CCAAT/enhancer binding protein β)转录激活因子复合物，使之与大鼠COL1A1基因启动子中的TGFβ1应答元件(-370至-344bp)结合而促进该基因表达[9].
, 百拇医药
Inagaki et al报道激活的大鼠肝脏星状细胞(CFSC-5H)也产生一种能与COL1A2基因TGFβ1应答元件(-378到-183bp之间)相结合的蛋白，从而促进其mRNA的表达.给转基因小鼠腹腔注射CCL4可使其携带的含有TGFβ1应答元件的COL1A2启动子(-17kb)的活性升高10倍，而CCL4损伤能够在体内激活肝脏非实质细胞COL1A2基因启动子中的TGFβ1应答元件(-330bp)，从而上调COL1A2的基因表达[10].该作者还观察到肝细胞中与COL1A2基因启动子中TGFb应答元件(313至225bp)结合的是Sp3, 而HSC中与此元件结合的是Sp1，这可以部分解释肝细胞和星状细胞在表达I型胶原水平方面的差异[11].1999年，Kanzler et al[6]建立了一种转基因小鼠肝纤维化模型，这种小鼠能特异性地在肝脏中表达C反应蛋白/活化型TGFβ1融合基因(受可诱导性C反应蛋白基因启动子调控元件控制).在基础状态下其血浆TGFβ1水平为正常小鼠的2～5倍，当给与100μg脂多糖腹腔注射后15h，转基因小鼠的血浆TGFβ1水平达>600μg·L-1，为正常小鼠的100倍，随后小鼠肝脏COL1A1及COL1A2 mRNA表达增加.反复多次诱导之后即可在肝组织上见到星状细胞激活及胶原沉积等肝纤维化表现.这种模型不仅再次证明了TGFβ1在体内对于星状细胞激活及胶原基因表达的直接调控作用，而且可用于探讨肝纤维化的发生机制及观察抗纤维化治疗的效果.
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3.2 肿瘤坏死因子α(TNFα) 是由巨噬细胞或淋巴细胞产生的炎症性递质，体外细胞培养实验表明在激活的肝脏星状细胞中他能降低COL1A1 mRNA的转录活性因而抑制I型胶原的表达[12]，给裸鼠接种能分泌TNFα的中国地仓鼠卵细胞也能抑制其肝脏COL1A1 mRNA表达[13].有研究发现TNF抑制COL1A1表达的作用是通过对百日咳毒素敏感的G蛋白介导的，其细胞内的信号传导则通过神经酰胺/鞘磷脂酶途径.转基因小鼠及细胞转染实验发现在肝脏星状细胞中，COL1A1基因中的TNFα应答元件位于第一个外显子上游220bp处[13].TNFα可以诱导核转录因子NF-κB的表达, 而体外转染实验发现NF-κB能在成纤维细胞和肝星状细胞中降低COL1A1 mRNA的转录，其机制可能是NF-κB与COL1A1基因启动子中的Sp1结合位点相结合，因而阻断了Sp1对于I型胶原的表达的促进作用[14].最近，Iraburu et al[15]发现COL1A1基因的启动子区有一个TaRE (TNF-α-responsive element)(-378至-345)，TNFα可以诱导p20C/EBPβ、p35C/EBPβ和C/EBPδ进入细胞核内并和这一调控元件结合.这一应答元件与以前报道的TGFβ1应答元件处于同一位置，提示COL1A1启动子区-378到-340bp处是各种不同刺激最终共同调控的元件[15].
, 百拇医药
对胶原基因表达调控的深入了解有助于阐明肝纤维化发生机制及探寻新的抗纤维化疗法[16].但必须指出，目前对胶原基因表达调控及信号传导的知识多是基于在体外针对某个环节的实验研究得到的，因而不一定能真实、完整地反映在机体内的实际效应.例如， TGFβ1能够促进胶原的表达、并抑制胶原的降解，显然是促进纤维化的重要因子；但同时他有很强的抑制免疫应答和炎症反应的功能，因而也可能有抗纤维化作用[1].又如，TNFα可以抑制I型胶原的基因表达、促进胶原酶的基因表达，似有对抗纤维化的作用；但他同时也有很强的促进炎症反应的作用，很可能通过其他环节促进纤维化[17,18].另外细胞内信号传导途径不仅是纵向的，而且也有横向的联系.因此，在解释实验结果和设计抗纤维化治疗时必须从整体的观点来考虑.
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, 百拇医药
2 Friedman SL. Cytokines and fibrogenesis. Semin Liver Dis 1999;19:129-140
3 Chiquet M. Regulation of extracellular matrix gene expression by mechanical stress. Matrix Biol 1999;18:417-426
4 Sengupta PK, Smith BD. Methylation in the initiation region of the first exon suppresses collagen pro-α2(Ⅰ) gene transcription.
Biochim Biophys Acta 1998;1443:75-89
5 Roulot D, Sevcsik AM, Coste T, Strosberg AD, Marullo S. Role of transforming growth factor βtype II receptor in hepatic fibrosis:
, 百拇医药
studies of human chronic hepatitis C and experimental fibrosis in rats. Hepatology 1999;29:1730-1738
6 Kanzler S, Lohse AW, Keil A, Henninger J, Dienes HP, Schirmacher P, Rose-John S, zum Buschenfelde KH, Blessing M. TGF-β1 in
liver fibrosis: an inducible transgenic mouse model to study liver fibrogenesis. Am J Physiol 1999;276:G1059-1068
7 Wrana JL. TGF-β receptors and signalling mechanisms. Miner Electrol Metab 1998;24:120-130
, 百拇医药
8 Schnabl B, Kweon YO, Frederick JP, Wang XF, Rippe RA, Brenner DA. The role of Smad3 in mediating mouse hepatic stellate cell
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, 百拇医药
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10 Inagaki Y, Truter S, Bou-Gharios G, Garrett LA, de Crombruggh e B, Nemoto T, Greenwel P. Activation of Proα2(I) collagen
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11 Inagaki Y, Nemoto T, Nakao A, Dijke P, Kobayashi K, Takehara K, Greenw el P. Interaction between GC box binding factors and
, http://www.100md.com
Smad proteins modulates cel l lineage-specific α2(I) collagen gene transcription. J Biol Chem 2001;276:16573-16579
12 赵东强，张晓岚，姜慧卿. TNF-α与肝星状细胞. 世界华人消化杂志 2001；9 ：947-948
13 Houglum K, Buck M, Kim DJ, Chojkier M. TNF-α inhibits liver collage n-α 1(I) gene expression through a tissue-specific regulatory
region. Am J Physiol 1998;274:G840-847
14 Rippe RA, Schrum LW, Stefanovic B, Solis-Herruzo JA, Brenner DA. NF- κB inhibits expression of the α1(I) collagen gene.
, 百拇医药
DNA Cell Biol 1999;18: 751-761
15 Iraburu MJ, Dominguez-Rosales JA, Fontana L, Auster A, Garcia-Trevij ano ER, Covarrubias-Pinedo A, Rivas-Estilla AM, Greenwel P,Rojkind M. Tumor n ecrosis factor α down-regulates expression of the α1(I) collagen gene in rat hepatic stellate cells through a
p20C/EBPβ-and C/EBPδ-dependent mechani sm. Hepatology 2000;31:1086-1093
16 黄光存，张锦生. 肝星状细胞激活的细胞内信号转导. 世界华人消化杂志 2001 ；9：1056-1060
, 百拇医药
17 Friedman SL. Molecular regulation of hepatic fibrosis, an integrated c ellular response to tissue injury.
J Biol Chem 2000;275:2247-2250
18 Li D, Friedman SL. Liver fibrogenesis and the role of hepatic stellate cells: new insights and prospects for therapy.
J Gastroenterol Hepatol 1999;14:618-633, 百拇医药