P选择素和ICAM-1对小鼠溃疡性结肠炎的研究
陈维雄,陈金联,达炜,陈尼维,朱金水,上海市第六人民医院消化内科 上海市 200233
项目负责人 陈维雄， 200233，上海市第六人民医院消化内科
电话：021-64369181
收稿日期 2002-03-05 接受日期 2002-03-18
摘要
目的:探讨P选择素单克隆抗体(单抗)对小鼠溃疡性结肠炎的治疗作用及其治疗机制.
方法:在小鼠溃疡性结肠炎模型上观察了黏附分子P选择素和ICAM-1的变化，并用P 选择素单抗对其进行阻断治疗.
, 百拇医药
结果:溃疡性结肠炎小鼠结肠黏膜充血、水肿，糜烂或溃疡(以直肠和远端结肠明显)，上皮细胞坏死、脱落，黏膜炎症细胞浸润(主要为中性粒细胞)及隐窝脓肿形成；P选择素单抗处理鼠未见明显病理变化，疾病活动指数(DAI)和病理学评分明显改善.ELISA法测定发现，溃疡性结肠炎时血浆P选择素和血清ICAM-1水平显著升高，而经P选择素单抗处理的小鼠P选择素未见升高.
结论:P选择素和ICAM-1与溃疡性结肠炎密切相关，P选择素单抗对溃疡性结肠炎具有治疗作用.
陈维雄,陈金联,达炜,陈尼维,朱金水.P选择素和ICAM-1对小鼠溃疡性结肠炎的研究.世界华人消化杂志 2002;10(6):722-724
0 引言近年我国溃疡性结肠炎的发病率逐渐增高.其发病机制迄今尚未明了.近年研究发现，白细胞在内皮细胞上的滚动是由选择素介导的，随后牢固的黏附则是由内皮上细胞间黏附分子-1(ICAM-1)与整合素相互作用完成[1-3].本文在建立小鼠溃疡性结肠炎模型基础上，观察黏附分子P选择素和ICAM-1的变化及P选择素单抗的防治作用.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 健康♀BALB/c小鼠，7-9wk.重约20g，共45只(中国科学院上海实验动物中心).5%硫酸葡聚糖(DSS)，购自sigma公司，Mr5000.P选择素单抗，购自苏州医学院.血浆P选择素及血清ICAM-1检测试剂盒购自苏州医学院.
1.2 方法 小鼠随机分为试验组(n=30)与正常对照组(n=15). 试验组动物口服5%硫酸葡聚糖溶液7d，再随机分为单抗组与PBS组，单抗组(n=14)第1-5天内腹腔内注射P选择素单抗，剂量为2mg/kg体重(以100ulPBS液体稀释)，PBS组(n=16)每只仅注射PBS液100ul. 正常对照组小鼠自由饮水. 所有动物均于第7天处死，分离大肠，沿肠系膜附着部剪开肠壁，置10%甲醛液中固定，分段取材.结肠炎症评价采用疾病活动指数(DAI)和病理学评分.DAI综合体重下降的百分率(体重不变为0，1-5为1分，5-10为2分，10-15为3分，大于15为4分)、大便黏稠度(正常为0，松散的大便为2分，腹泻为4分)和大便出血(正常0分，隐血阳性为2分，显性出血为4分)积分.病理学评分为HE切片10个高倍视野(100倍)的平均评分，其中以正常结肠黏膜为0级，隐窝缺损1/3时为1级，隐窝缺损2/3时为2级，固有层覆盖单层上皮伴轻度炎性细胞浸润为3级，黏膜糜烂、溃疡伴显著的炎细胞浸润者4级.血浆P选择素及血清ICAM-1采用ELISA法检测，静脉采血，分别置于含1/10体积2%EDTA.Na抗凝管及普通管中，3000转/min离心10min，收集上层，置-20℃下保存待测.
, 百拇医药
统计学处理 结果以±s表示，数据统计采用t检验.
2 结果
2.1 疾病活动指数(DAI) 小鼠在喂食DSS溶液后第3或第4天出现腹泻，隐血试验阳性，第5-6天出现程度不同的血便，体重明显减轻，DAI为2.375±0.156；但经P选择素单抗治疗的小鼠血便、腹泻明显减轻，体重未见明显下降，DAI平均为1.60±0.241，差异显著，P<0.01.
2.2 病理学评分 于喂食DSS液第7天处死动物，肉眼观察结肠炎严重度与体重下降、血便、腹泻程度相一致.结肠炎病变从肛门侧开始向上连续性发展，但逐渐减轻，以直肠、乙状结肠最为明显，而近端结肠基本正常.可见黏膜显著充血水肿，散在性糜烂或溃疡伴出血，此与人类溃疡性结肠炎相似.结肠组织HE染色，光镜下观察，越近肛门侧病理改变越明显，可见上皮细胞变化、坏死、脱落，杯状细胞减少，黏膜炎症细胞浸润(主要为中性粒细胞)、隐窝脓肿形成等.但小鼠经P选择素单抗注射治疗后，则结肠未见明显的炎性细胞浸润及充血水肿与糜烂、溃疡等，病理学评分较PBS处理的小鼠明显减低(表1).
, 百拇医药
2.3 P选择素和ICAM-1含量 循环血中P选择素和ICAM-1含量与小鼠溃疡性结肠炎程度有关.正常对照鼠P选择素和ICAM-1含量较低，小鼠有溃疡性结肠炎时血浆P选择素和血清ICAM-1含量则明显升高，经P选择素单抗治疗的小鼠P选择素和ICAM-1明显被抑制，后者与正常对照鼠无明显差别.各组血浆P选择素和血清ICAM-1的ELISA测定结果见表2.
表1 各组小鼠的病理学评分 (x±s)
, 百拇医药
bP<0.01 vs PBS组.
表2 各组动物血浆P选择素和血清ICAM-1含量 (x±s)
bP<0.01 vs 正常组或单抗组.
, 百拇医药
3 讨论
近年黏附分子在炎性细胞的浸润、肠组织炎症形成中重要作用已逐渐被人们重视.选择素是最近被确定的一类黏附分子家族，其重要成员之一的P选择素(GMP140，MW140000)主要分布于中等大小血管内皮细胞棒状小体(Weibel-palade)以及血小板α颗粒，并随这些细胞活化而迅速出现在细胞膜表面或释放至血液中，其在炎症的早期反应中起着重要作用，而E选择素或细胞间黏附分子-1(ICAM-1)在内皮细胞受刺激后数小时内表达.研究表明，黏附分子P选择素和ICAM-1通过介导中性粒细胞和单核细胞在内皮细胞上的滚动(Rolling)和黏附，在炎症的发生、发展中起着重要作用[3-9].
DSS近年被广泛用于实验性溃疡性结肠炎研究[10].本文研究中给小鼠喂食DSS液后出现腹泻，体重下降和血便等，大肠从直肠开始自下而上肠黏膜连续性炎性病变，主要表现为明显充血、水肿、炎性细胞浸润、杯状细胞减少、隐窝脓肿、糜烂或溃疡形成等.该模型与人类溃疡性结肠炎接近，可为溃疡性结肠炎的实验研究提供理想的动物模型.
, 百拇医药
本文发现小鼠喂食DSS 7d后结肠出现了显著的病理改变，但经P选择素单抗处理的小鼠结肠则未见明显的病理改变，其DAI和病理学积分改善显著.Seino et al[11]的研究结果表明ICAM-1单抗对DSS诱导的大鼠溃疡性结肠炎具有防治作用.Hamamoto et al[12]发现ICAM-1单抗或E选择素单抗对实验性溃疡性结肠炎具有治疗作用.Bennett et al[13]用ICAM-1反义寡核苷酸皮下注射溃疡性结肠炎小鼠，可阻断结肠炎的发生、发展.结果表明P选择素单抗的抗黏附治疗对溃疡性结肠炎具有治疗作用.
小鼠溃疡性结肠炎时循环血中P选择素和ICAM-1含量明显高于P选择素单抗治疗的溃疡性结肠炎小鼠，后者与正常对照鼠无明显差别(P>0.05)，这与Nielsen et al[14，15]的研究结果一致.说明P选择素和ICAM-1升高与溃疡性结肠炎炎症相关，而P选择素单抗可能通过抑制中性粒细胞、单核细胞对内皮的黏附和由此引起的炎症反应，从而使上述黏附分子表达或释放减少.
, 百拇医药
4 参考文献1 Katz JA, Itoh J, Fiocchi C. Pathogenesis of inflammatory bowel disease. Curr Opin Opin. Gastroenterol 1999;15:291-297
2 Rask-Madsen J. Current concepts of the pathogenesis of IBD. World J Gastroenterol 1998;4(suppl 2):20-22
3 Chen JL, Zhou T, Chu YD, Xu HM, Li X, Zhang MJ, Zhang DH, Wu YL. Study on intercellular adhesion-1 and P-selectin in liver
, 百拇医药 ischemia and reperfusion injury. J Smmu 1998;10:63-85
4 Woywodt A, Ludwig D, Neustock P, Kruse A, Schwarting K, Jantschek G,Kirchner H, Stange EF. Mucosal cytokine expression,cellular markers and adhesion molecules in inflammatory bowel disease.Eur J Gastroenterol Hepatol 1999;11:267-276
5 Bevilacqua MP, Nelson RM. Selectins. J Clin Invest 1993;9:379-387
6 Carlos TM, Harlan JM. Leukocyte-endothelial adhesion molecules. Blood 1994;84:2068-2101
, http://www.100md.com
7 江学良, 权启镇, 孙自勤, 王要军, 齐风. 溃疡性结肠炎患者黏附分子的变化意义. 华人消化杂志 1998;6:54-55
8 江学良, 权启镇, 孙自勤, 王要军, 齐风, 王东, 张修礼. 炎症性肠病患者外周血可溶性CD44v6检测.世界华人消化杂志 1999;7:1028
9 韩英, 李世荣. 溃疡性结肠炎治疗的新进展及新策略. 世界华人消化杂志 2000；8：1273-1275
10 Kanauchi O, Nakamura T, Agata K, Mitsuyama K, Iwanaga T. Effects of germinated barley foodstuff on dextran sulfate
sodium-induced colitis in rats.J Gastroenterol 1998;33:179-188
, 百拇医药
11 SeinoY, Tsukada H, Nakamura H, Kodama M,Fukuda K,Saito T,Miyasaka M. Effects of the anti-ICAM-1 monoclonal antibody on
dextran sodium sulphate-induced colitis in rats. J Gastroenterol Hepatol 1998;13:945-949
12 Hamamoto N, Maemura K, Hirata I, Murano M，Sasaki S, Katsu K. Inhibition of dextran sulphate sodium(DSS)-induced colitis in mice
by intracolonically administered antibodies against adhesion molecules(ELAM-1 or ICAM-1). Clin Exp Immunol 1999;117:462-468
, http://www.100md.com
13 Bennett CF, Kornbrust D, Henry S. An ICAM-1 antisense oligonucleotideprevents and reverses dextran sulfate sodium-induced
colitis in mice. J Pharmacol Exp Ther 1997;280:988-1000
14 Nielsen OH,Langholz E,Hendel J,Brynskov J.Circulating soluble intercellular adhesion molecule-1 (sICAM-1) in active inflammatory
bowel disease.Dig Dis Sci 1994;39:1918-1923
15 王青, 许琳. 溃疡性结肠炎的实验室检查和活动性评估.世界华人消化杂志 2000;8:336-337, 百拇医药(陈维雄,陈金联,达 炜,陈尼维,朱金水)
项目负责人 陈维雄， 200233，上海市第六人民医院消化内科
电话：021-64369181
收稿日期 2002-03-05 接受日期 2002-03-18
摘要
目的:探讨P选择素单克隆抗体(单抗)对小鼠溃疡性结肠炎的治疗作用及其治疗机制.
方法:在小鼠溃疡性结肠炎模型上观察了黏附分子P选择素和ICAM-1的变化，并用P 选择素单抗对其进行阻断治疗.
, 百拇医药
结果:溃疡性结肠炎小鼠结肠黏膜充血、水肿，糜烂或溃疡(以直肠和远端结肠明显)，上皮细胞坏死、脱落，黏膜炎症细胞浸润(主要为中性粒细胞)及隐窝脓肿形成；P选择素单抗处理鼠未见明显病理变化，疾病活动指数(DAI)和病理学评分明显改善.ELISA法测定发现，溃疡性结肠炎时血浆P选择素和血清ICAM-1水平显著升高，而经P选择素单抗处理的小鼠P选择素未见升高.
结论:P选择素和ICAM-1与溃疡性结肠炎密切相关，P选择素单抗对溃疡性结肠炎具有治疗作用.
陈维雄,陈金联,达炜,陈尼维,朱金水.P选择素和ICAM-1对小鼠溃疡性结肠炎的研究.世界华人消化杂志 2002;10(6):722-724
0 引言近年我国溃疡性结肠炎的发病率逐渐增高.其发病机制迄今尚未明了.近年研究发现，白细胞在内皮细胞上的滚动是由选择素介导的，随后牢固的黏附则是由内皮上细胞间黏附分子-1(ICAM-1)与整合素相互作用完成[1-3].本文在建立小鼠溃疡性结肠炎模型基础上，观察黏附分子P选择素和ICAM-1的变化及P选择素单抗的防治作用.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 健康♀BALB/c小鼠，7-9wk.重约20g，共45只(中国科学院上海实验动物中心).5%硫酸葡聚糖(DSS)，购自sigma公司，Mr5000.P选择素单抗，购自苏州医学院.血浆P选择素及血清ICAM-1检测试剂盒购自苏州医学院.
1.2 方法 小鼠随机分为试验组(n=30)与正常对照组(n=15). 试验组动物口服5%硫酸葡聚糖溶液7d，再随机分为单抗组与PBS组，单抗组(n=14)第1-5天内腹腔内注射P选择素单抗，剂量为2mg/kg体重(以100ulPBS液体稀释)，PBS组(n=16)每只仅注射PBS液100ul. 正常对照组小鼠自由饮水. 所有动物均于第7天处死，分离大肠，沿肠系膜附着部剪开肠壁，置10%甲醛液中固定，分段取材.结肠炎症评价采用疾病活动指数(DAI)和病理学评分.DAI综合体重下降的百分率(体重不变为0，1-5为1分，5-10为2分，10-15为3分，大于15为4分)、大便黏稠度(正常为0，松散的大便为2分，腹泻为4分)和大便出血(正常0分，隐血阳性为2分，显性出血为4分)积分.病理学评分为HE切片10个高倍视野(100倍)的平均评分，其中以正常结肠黏膜为0级，隐窝缺损1/3时为1级，隐窝缺损2/3时为2级，固有层覆盖单层上皮伴轻度炎性细胞浸润为3级，黏膜糜烂、溃疡伴显著的炎细胞浸润者4级.血浆P选择素及血清ICAM-1采用ELISA法检测，静脉采血，分别置于含1/10体积2%EDTA.Na抗凝管及普通管中，3000转/min离心10min，收集上层，置-20℃下保存待测.
, 百拇医药
统计学处理 结果以±s表示，数据统计采用t检验.
2 结果
2.1 疾病活动指数(DAI) 小鼠在喂食DSS溶液后第3或第4天出现腹泻，隐血试验阳性，第5-6天出现程度不同的血便，体重明显减轻，DAI为2.375±0.156；但经P选择素单抗治疗的小鼠血便、腹泻明显减轻，体重未见明显下降，DAI平均为1.60±0.241，差异显著，P<0.01.
2.2 病理学评分 于喂食DSS液第7天处死动物，肉眼观察结肠炎严重度与体重下降、血便、腹泻程度相一致.结肠炎病变从肛门侧开始向上连续性发展，但逐渐减轻，以直肠、乙状结肠最为明显，而近端结肠基本正常.可见黏膜显著充血水肿，散在性糜烂或溃疡伴出血，此与人类溃疡性结肠炎相似.结肠组织HE染色，光镜下观察，越近肛门侧病理改变越明显，可见上皮细胞变化、坏死、脱落，杯状细胞减少，黏膜炎症细胞浸润(主要为中性粒细胞)、隐窝脓肿形成等.但小鼠经P选择素单抗注射治疗后，则结肠未见明显的炎性细胞浸润及充血水肿与糜烂、溃疡等，病理学评分较PBS处理的小鼠明显减低(表1).
, 百拇医药
2.3 P选择素和ICAM-1含量 循环血中P选择素和ICAM-1含量与小鼠溃疡性结肠炎程度有关.正常对照鼠P选择素和ICAM-1含量较低，小鼠有溃疡性结肠炎时血浆P选择素和血清ICAM-1含量则明显升高，经P选择素单抗治疗的小鼠P选择素和ICAM-1明显被抑制，后者与正常对照鼠无明显差别.各组血浆P选择素和血清ICAM-1的ELISA测定结果见表2.
表1 各组小鼠的病理学评分 (x±s)
| 组别 | n | 直肠 |
| PBS组 | 16 | 1.720±0.162 |
| P选择素单抗组 | 14 | 0.585±0.108b |
, 百拇医药
bP<0.01 vs PBS组.
表2 各组动物血浆P选择素和血清ICAM-1含量 (x±s)
| 组别 | n | P选择素含量(ng/ml) | ICAM-1(ng/ml) |
| 正常组 | 15 | 0.097±0.016 | 128±31.0 |
| PBS组 | 16 | 0.262±0.054b | 361±47.4b |
| P选择素单抗组 | 14 | 0.106±0.018 | 132±29.1 |
bP<0.01 vs 正常组或单抗组.
, 百拇医药
3 讨论
近年黏附分子在炎性细胞的浸润、肠组织炎症形成中重要作用已逐渐被人们重视.选择素是最近被确定的一类黏附分子家族，其重要成员之一的P选择素(GMP140，MW140000)主要分布于中等大小血管内皮细胞棒状小体(Weibel-palade)以及血小板α颗粒，并随这些细胞活化而迅速出现在细胞膜表面或释放至血液中，其在炎症的早期反应中起着重要作用，而E选择素或细胞间黏附分子-1(ICAM-1)在内皮细胞受刺激后数小时内表达.研究表明，黏附分子P选择素和ICAM-1通过介导中性粒细胞和单核细胞在内皮细胞上的滚动(Rolling)和黏附，在炎症的发生、发展中起着重要作用[3-9].
DSS近年被广泛用于实验性溃疡性结肠炎研究[10].本文研究中给小鼠喂食DSS液后出现腹泻，体重下降和血便等，大肠从直肠开始自下而上肠黏膜连续性炎性病变，主要表现为明显充血、水肿、炎性细胞浸润、杯状细胞减少、隐窝脓肿、糜烂或溃疡形成等.该模型与人类溃疡性结肠炎接近，可为溃疡性结肠炎的实验研究提供理想的动物模型.
, 百拇医药
本文发现小鼠喂食DSS 7d后结肠出现了显著的病理改变，但经P选择素单抗处理的小鼠结肠则未见明显的病理改变，其DAI和病理学积分改善显著.Seino et al[11]的研究结果表明ICAM-1单抗对DSS诱导的大鼠溃疡性结肠炎具有防治作用.Hamamoto et al[12]发现ICAM-1单抗或E选择素单抗对实验性溃疡性结肠炎具有治疗作用.Bennett et al[13]用ICAM-1反义寡核苷酸皮下注射溃疡性结肠炎小鼠，可阻断结肠炎的发生、发展.结果表明P选择素单抗的抗黏附治疗对溃疡性结肠炎具有治疗作用.
小鼠溃疡性结肠炎时循环血中P选择素和ICAM-1含量明显高于P选择素单抗治疗的溃疡性结肠炎小鼠，后者与正常对照鼠无明显差别(P>0.05)，这与Nielsen et al[14，15]的研究结果一致.说明P选择素和ICAM-1升高与溃疡性结肠炎炎症相关，而P选择素单抗可能通过抑制中性粒细胞、单核细胞对内皮的黏附和由此引起的炎症反应，从而使上述黏附分子表达或释放减少.
, 百拇医药
4 参考文献1 Katz JA, Itoh J, Fiocchi C. Pathogenesis of inflammatory bowel disease. Curr Opin Opin. Gastroenterol 1999;15:291-297
2 Rask-Madsen J. Current concepts of the pathogenesis of IBD. World J Gastroenterol 1998;4(suppl 2):20-22
3 Chen JL, Zhou T, Chu YD, Xu HM, Li X, Zhang MJ, Zhang DH, Wu YL. Study on intercellular adhesion-1 and P-selectin in liver
, 百拇医药 ischemia and reperfusion injury. J Smmu 1998;10:63-85
4 Woywodt A, Ludwig D, Neustock P, Kruse A, Schwarting K, Jantschek G,Kirchner H, Stange EF. Mucosal cytokine expression,cellular markers and adhesion molecules in inflammatory bowel disease.Eur J Gastroenterol Hepatol 1999;11:267-276
5 Bevilacqua MP, Nelson RM. Selectins. J Clin Invest 1993;9:379-387
6 Carlos TM, Harlan JM. Leukocyte-endothelial adhesion molecules. Blood 1994;84:2068-2101
, http://www.100md.com
7 江学良, 权启镇, 孙自勤, 王要军, 齐风. 溃疡性结肠炎患者黏附分子的变化意义. 华人消化杂志 1998;6:54-55
8 江学良, 权启镇, 孙自勤, 王要军, 齐风, 王东, 张修礼. 炎症性肠病患者外周血可溶性CD44v6检测.世界华人消化杂志 1999;7:1028
9 韩英, 李世荣. 溃疡性结肠炎治疗的新进展及新策略. 世界华人消化杂志 2000；8：1273-1275
10 Kanauchi O, Nakamura T, Agata K, Mitsuyama K, Iwanaga T. Effects of germinated barley foodstuff on dextran sulfate
sodium-induced colitis in rats.J Gastroenterol 1998;33:179-188
, 百拇医药
11 SeinoY, Tsukada H, Nakamura H, Kodama M,Fukuda K,Saito T,Miyasaka M. Effects of the anti-ICAM-1 monoclonal antibody on
dextran sodium sulphate-induced colitis in rats. J Gastroenterol Hepatol 1998;13:945-949
12 Hamamoto N, Maemura K, Hirata I, Murano M，Sasaki S, Katsu K. Inhibition of dextran sulphate sodium(DSS)-induced colitis in mice
by intracolonically administered antibodies against adhesion molecules(ELAM-1 or ICAM-1). Clin Exp Immunol 1999;117:462-468
, http://www.100md.com
13 Bennett CF, Kornbrust D, Henry S. An ICAM-1 antisense oligonucleotideprevents and reverses dextran sulfate sodium-induced
colitis in mice. J Pharmacol Exp Ther 1997;280:988-1000
14 Nielsen OH,Langholz E,Hendel J,Brynskov J.Circulating soluble intercellular adhesion molecule-1 (sICAM-1) in active inflammatory
bowel disease.Dig Dis Sci 1994;39:1918-1923
15 王青, 许琳. 溃疡性结肠炎的实验室检查和活动性评估.世界华人消化杂志 2000;8:336-337, 百拇医药(陈维雄,陈金联,达 炜,陈尼维,朱金水)