大肠黏膜癌变过程中Survivin蛋白的表达 郑长青，林连捷，马 颖，姜卫国，马 铁，胡刚正
郑长青，林连捷，胡刚正，中国医科大学第二临床学院消化内科 辽宁省沈阳市三好街36号 110004
马颖，姜卫国，马铁，中国医科大学第二临床学院消化内科 辽宁省沈阳市三好街36号 110004
林连捷， 110004，辽宁省沈阳市三好街36号，中国医科大学第二临床学院消化内科. linlianjie@yeah.net
项目负责人 郑长青，110004，辽宁省沈阳市三好街36号，中国医科大学第二临床学院消化内科. zhengchangqing88@163.com
电话：13940346589
收稿日期 2002-07-02 接收日期 2002-07-19
, 百拇医药
摘要
目的:探讨Survivin蛋白在人类大肠黏膜癌变过程中的作用及与大肠癌组织分化程度的关系.
方法:应用SP免疫组织化学法检测Survivin蛋白在173例石蜡切片中的表达情况，包括26例正常大肠黏膜，35例腺瘤伴轻度非典型增生，25例腺瘤伴重度非典型增生和87例大肠腺癌.
结果:Survivin蛋白主要定位于大肠腺瘤伴非典型增生和腺癌细胞的细胞质中，在正常大肠上皮细胞中不表达.在大肠正常黏膜→轻度非典型增生→重度非典型增生→腺癌的过程中Survivin表达阳性率逐渐增高，分别是0.0%、34.2%、56.0%和63.2%.但重度非典型增生和腺癌组的差异无统计学意义.Survivin在不同分化程度的腺癌中表达阳性率无明显差异，而且，Survivin表达强度与大肠腺癌分化程度无关系.
, 百拇医药
结论:Survivin的表达发生在大肠腺癌恶性转化的早期，并在癌变过程中起重要作用，但与腺癌分化程度无关.这可能为大肠癌的诊断和治疗提供了新的靶点.
郑长青,林连捷,马颖,姜卫国,马铁,胡刚正. 大肠黏膜癌变过程中Survivin蛋白的表达. 世界华人消化杂志 2002;10(9):1052-1053
0 引言Survivin是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein , IAP)家族成员，他直接抑制caspase-3, -7 [1] ,有人认为Survivin可能结合caspase-9 [2]而抑制凋亡.Giodini et al [3]认为Survivin控制微管系统的稳定性和有丝分裂纺锤体的形成，因而影响细胞分裂.Survivin 在终末分化的正常成人组织中无表达，但在多种肿瘤中有表达[4-6].Survivin这种独特的表达特点使肿瘤的靶向性治疗成为可能[7]，并可能提供新的诊断方法.我们应用免疫组织化学SP法检测正常大肠黏膜，腺瘤伴轻度、重度非典型增生，大肠腺癌中Survivin蛋白的表达情况，探讨Survivin蛋白在人类大肠黏膜癌变过程中的作用及与大肠癌组织分化程度的关系.
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 材料 中国医科大学附属二院1998/2002-05手术切除和内窥镜活检术后的大肠组织173例，男95例，女78例.其中正常对照组26例，腺瘤伴轻度非典型增生组35例，腺瘤伴重度非典型增生25例，大肠腺癌87例，各组的平均年龄分别是51.5，55.6，59.3和57.0岁.大肠腺癌组根据组织分化程度分为高分化、中分化和低分化3个亚组，各亚组例数分别是33，28，26例，患者平均年龄分别是62.0，57.9，51.1岁.所有患者均未进行过化疗或放疗.
1.2 方法 取材后用40g/L中性甲醛固定，常规制成5mm厚石蜡切片.常规用苏木素和伊红(HE)染色，由至少2位有经验的病理医生进行形态组织学研究.采用SP免疫组织化学法检测Survivin蛋白的表达.Survivin羊抗人多克隆抗体(sc-8806)为Santa Cruz公司产品，一抗工作浓度1:50，SP试剂盒为北京中山生物技术有限公司产品.石蜡切片常规脱蜡至水，30ml/L过氧化氢孵育10min，EDTA(0.01mmol/L，PH7.4)抗原修复，降至室温水洗，PBS浸泡5min，滴加封闭用正常血清工作液，室温孵育10min，滴加一抗，4℃过夜.然后PBS冲洗3次，滴加二抗，37℃孵育30min，PBS冲洗3次，滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液37℃孵育30min，PBS冲洗3次，DAB显色，水洗，苏木素复染，水洗，脱水，透明，封片. 在400倍放大的显微镜下计数至少5个随机视野，取平均值，阳性细胞数小于10%计为阴性，余下为阳性.阳性细胞数占10-29%为+, 30-59%为++，60%以上为+++.采用盲法计数.
, 百拇医药
统计学处理 采用c2检验，检验水准为0.05.
2 结果免疫组织化学法显示Survivin蛋白主要定位于大肠腺瘤伴非典型增生和腺癌细胞的细胞质中，而在正常细胞中不表达.大肠正常黏膜→轻度非典型增生→重度非典型增生→腺癌的过程中Survivin表达阳性率逐渐增高，分别是0.0%，34.2%，56.0%和63.2%.经统计学c2检验显示：各组与正常对照组表达差异有统计学意义(P<0.05), 轻度非典型增生和腺癌组差异有统计学意义(P <0.05)，轻度非典型增生和重度非典型增生组差异无统计学意义(c2＝2.80，0.052＝0.43,0.50.90)，并且，分化程度与Survivin表达强度无关系(P>0.75).
, 百拇医药
表1 Survivin 表达与大肠腺癌分化程度的关系
3 讨论在细胞癌变过程中存在细胞增生和凋亡之间的失衡，p53和bcl-2家族被详细研究[8-13].IAP家族是一种广泛表达的抑制凋亡的基因家族，Survivin是一种结构独特的哺乳类IAP分子，是迄今发现的最强的凋亡抑制因子.他表达特点是在胚胎发育过程和常见肿瘤中表达[4-6]，而在正常成熟组织中不表达，其具体机制尚不清楚.本实验的目的是研究Survivin蛋白在人类大肠腺癌发生过程中的作用及与大肠腺癌组织分化程度的关系.本研究显示在正常大肠上皮细胞中Survivin蛋白不表达，与文献报道一致.Survivin主要定位于大肠腺瘤伴非典型增生和腺癌细胞的细胞质中，在大肠正常黏膜→轻度非典型增生→重度非典型增生→腺癌的过程中Survivin表达阳性率逐渐增高，分别是0.0%, 34.2%, 56.0%和63.2%.经统计学c2检验显示：各组与正常对照组表达差异有统计学意义(P<0.05), 轻度非典型增生和腺癌组差异有统计学意义(P<0.05)，轻度和重度非典型增生组之间及重度非典型增生和腺癌组之间差异无统计学意义.但具体分析可见轻度和重度非典型增生组阳性率分别是34.2%和56.0%，患者例数分别是35和25，c2值为2.80，0.052＝0.43，0.5
研究Survivin蛋白的表达与大肠腺癌组织学分化程度的关系，本实验将87例大肠腺癌分为高分化、中分化和低分化3个亚组.各亚组样本数分别是33、28和26，Survivin表达阳性率分别是63.6%，60.7%和65.4%.经c2检验可知不同分化程度的腺癌中Survivin表达无差异，分化程度与表达强度无关系(P>0.75).此结果不同于王梅et al [14]认为在宫颈癌中Survivin的表达阳性率与组织学分级呈正相关.这种差异可能是由于组织来源不同.大肠癌Survivin表达与组织分化程度无关，这使应用Survivin作为肿瘤特异性的免疫治疗或基因治疗和诊断方法成为可能，即无论高、中、低分化的大肠癌均可通过检测Survivin而进行诊断并且用其作为大肠癌治疗的靶点.同时由于在正常细胞中Survivin蛋白不表达，所以治疗时不杀伤正常细胞.因此，本研究对大肠癌的诊断和治疗均有一定指导意义.
Survivin 作为一种新的凋亡抑制因子，其组织分布和作用机制的独特性已引起国外学者的广泛关注.但尚有许多问题有待进一步研究，如Survivin 组织细胞选择性表达的分子机制，Survivin抗凋亡的许多具体环节尚不清楚，针对Survivin的靶向治疗尚处于起步阶段.因此深入研究Survivin将为肿瘤的诊断和治疗奠定坚实的基础.
, http://www.100md.com
4 参考文献1 Shin S, Sung BJ, Cho YS, Kim HJ, Ha NC, Hwang JI,Chung CW, Jung YK, Oh BH.An anti-apoptotic protein human survivin
is a direct inhibitor of caspase-3 and -7. Biochemistry 2001 ;40:1117-1123
2 O扖onnor DS, Grossman D, Plescia J, Li F, Zhang H, Villa A, Tognin S, Marchisio PC, Altieri DC. Regulation of apoptosis
at cell division by p34cdc2 phosphorylation of survivin. Proc Natl Acad Sci USA 2000 ;97:13103-13107
, http://www.100md.com
3 Giodini A, Kallio MJ, Wall NR, Gorbsky GJ, Tognin S, Marchisio PC, Symons M, Altieri DC. Regulation of microtubule stability
and mitotic progression by survivin. Cancer Res 2002;62:2462-2467
4 Sarela AI, Verbeke CS, Ramsdale J, Davies CL, Markham AF, Guillou PJ. Expression of survivin , a novel inhibitor of
apoptosis and cell cycle regulatory protein, in pancreatic adenocarcinoma. Br J Cancer 2002;86:886-892
, http://www.100md.com
5 Mari A, Wada H, Nishimura Y, Okamoto T, Takeomoto Y, Kakishita E. Expression of antiapoptosis gene survivin in human
leukemia. Int J Hematol 2002;75:161-165
6 Das A, Tan WL, Teo J, Smith DR. Expression of survivin in primary glioblastomas. J Cancer Res Clin Oncol
2002;128:302-306
7 Yamamoto T, Tanigawa N. The role of survivin as a new target of diagnosis and treatment in human cancer.
, 百拇医药
Med Electron Microsc 2001 ;34:207-212
8 季代金，曹燕，张亚历，姜泊，余宁，冯福才，周殿元. 大肠癌HT-29，Lovo细胞p-53转录表达差异同步研究.
世界华人消化杂志 2000;8:77-79
9 张传山，王文亮，彭玮丹，胡沛臻，柴玉波，马福成. Bcl-2核酸对SMMC7721细胞的促凋亡机制.
世界华人消化杂志 2000;8:417-419
10 潘传敬，钟萍，黄晓蓉，刘宽宇，汪盛贤.胃粘膜萎缩与肠化的细胞增殖和凋亡研究.世界华人消化杂志 2000;8:143-146
11 Li HL, Chen DD, Li XH, Zhang HW, Lu YQ, Ye CL, Ren XD. Changes of NF-kB,p-53,Bcl-2 and caspase in apoptosis induced
, http://www.100md.com
by JTE-552 in human gastric adenocarcinoma cell line AGS cells: role of reactive oxygen species. World J Gastroenterol
2002; 8:431-435
12 范如英，李世荣，武子涛，吴霞. 散发性大肠癌组织及粪便P53蛋白、K-ras 及APC基因的检测.
世界华人消化杂志 2001;9:771-775
13 Erbersdobler A, Fritz H, Schnoger S, Graefen M, Hammerer P, Huland H, Henke RP. Tumour grade, proliferation,apoptosis, microvessel density, p53, and bcl-2 in prostate cancers: differences between tumours located in the transition
zone and in the peripheral zone. Eur Urol 2002; 41:40-46
14 王梅，王冰，王晓丽，莫立平，任娟，李明众.凋亡相关基因survivin 在子宫颈癌组织中的表达及其与bcl-2 、p53基因
表达相关性的初步研究.中华妇产科杂志2001;36:546-549, 百拇医药(大肠黏膜癌变过程中Survivin蛋白的表达 郑长青，林连捷，马 颖，姜卫国，马 铁，胡刚正)
马颖，姜卫国，马铁，中国医科大学第二临床学院消化内科 辽宁省沈阳市三好街36号 110004
林连捷， 110004，辽宁省沈阳市三好街36号，中国医科大学第二临床学院消化内科. linlianjie@yeah.net
项目负责人 郑长青，110004，辽宁省沈阳市三好街36号，中国医科大学第二临床学院消化内科. zhengchangqing88@163.com
电话：13940346589
收稿日期 2002-07-02 接收日期 2002-07-19
, 百拇医药
摘要
目的:探讨Survivin蛋白在人类大肠黏膜癌变过程中的作用及与大肠癌组织分化程度的关系.
方法:应用SP免疫组织化学法检测Survivin蛋白在173例石蜡切片中的表达情况，包括26例正常大肠黏膜，35例腺瘤伴轻度非典型增生，25例腺瘤伴重度非典型增生和87例大肠腺癌.
结果:Survivin蛋白主要定位于大肠腺瘤伴非典型增生和腺癌细胞的细胞质中，在正常大肠上皮细胞中不表达.在大肠正常黏膜→轻度非典型增生→重度非典型增生→腺癌的过程中Survivin表达阳性率逐渐增高，分别是0.0%、34.2%、56.0%和63.2%.但重度非典型增生和腺癌组的差异无统计学意义.Survivin在不同分化程度的腺癌中表达阳性率无明显差异，而且，Survivin表达强度与大肠腺癌分化程度无关系.
, 百拇医药
结论:Survivin的表达发生在大肠腺癌恶性转化的早期，并在癌变过程中起重要作用，但与腺癌分化程度无关.这可能为大肠癌的诊断和治疗提供了新的靶点.
郑长青,林连捷,马颖,姜卫国,马铁,胡刚正. 大肠黏膜癌变过程中Survivin蛋白的表达. 世界华人消化杂志 2002;10(9):1052-1053
0 引言Survivin是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein , IAP)家族成员，他直接抑制caspase-3, -7 [1] ,有人认为Survivin可能结合caspase-9 [2]而抑制凋亡.Giodini et al [3]认为Survivin控制微管系统的稳定性和有丝分裂纺锤体的形成，因而影响细胞分裂.Survivin 在终末分化的正常成人组织中无表达，但在多种肿瘤中有表达[4-6].Survivin这种独特的表达特点使肿瘤的靶向性治疗成为可能[7]，并可能提供新的诊断方法.我们应用免疫组织化学SP法检测正常大肠黏膜，腺瘤伴轻度、重度非典型增生，大肠腺癌中Survivin蛋白的表达情况，探讨Survivin蛋白在人类大肠黏膜癌变过程中的作用及与大肠癌组织分化程度的关系.
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 材料 中国医科大学附属二院1998/2002-05手术切除和内窥镜活检术后的大肠组织173例，男95例，女78例.其中正常对照组26例，腺瘤伴轻度非典型增生组35例，腺瘤伴重度非典型增生25例，大肠腺癌87例，各组的平均年龄分别是51.5，55.6，59.3和57.0岁.大肠腺癌组根据组织分化程度分为高分化、中分化和低分化3个亚组，各亚组例数分别是33，28，26例，患者平均年龄分别是62.0，57.9，51.1岁.所有患者均未进行过化疗或放疗.
1.2 方法 取材后用40g/L中性甲醛固定，常规制成5mm厚石蜡切片.常规用苏木素和伊红(HE)染色，由至少2位有经验的病理医生进行形态组织学研究.采用SP免疫组织化学法检测Survivin蛋白的表达.Survivin羊抗人多克隆抗体(sc-8806)为Santa Cruz公司产品，一抗工作浓度1:50，SP试剂盒为北京中山生物技术有限公司产品.石蜡切片常规脱蜡至水，30ml/L过氧化氢孵育10min，EDTA(0.01mmol/L，PH7.4)抗原修复，降至室温水洗，PBS浸泡5min，滴加封闭用正常血清工作液，室温孵育10min，滴加一抗，4℃过夜.然后PBS冲洗3次，滴加二抗，37℃孵育30min，PBS冲洗3次，滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液37℃孵育30min，PBS冲洗3次，DAB显色，水洗，苏木素复染，水洗，脱水，透明，封片. 在400倍放大的显微镜下计数至少5个随机视野，取平均值，阳性细胞数小于10%计为阴性，余下为阳性.阳性细胞数占10-29%为+, 30-59%为++，60%以上为+++.采用盲法计数.
, 百拇医药
统计学处理 采用c2检验，检验水准为0.05.
2 结果免疫组织化学法显示Survivin蛋白主要定位于大肠腺瘤伴非典型增生和腺癌细胞的细胞质中，而在正常细胞中不表达.大肠正常黏膜→轻度非典型增生→重度非典型增生→腺癌的过程中Survivin表达阳性率逐渐增高，分别是0.0%，34.2%，56.0%和63.2%.经统计学c2检验显示：各组与正常对照组表达差异有统计学意义(P<0.05), 轻度非典型增生和腺癌组差异有统计学意义(P <0.05)，轻度非典型增生和重度非典型增生组差异无统计学意义(c2＝2.80，0.05
, 百拇医药
表1 Survivin 表达与大肠腺癌分化程度的关系
| 病变类型 | n | 表达强度 | 阳性率% | |||
| - | + | ++ | +++ | |||
| 高分化 | 33 | 12 | 3 | 10 | 8 | 63.6 |
| 中分化 | 28 | 11 | 2 | 4 | 11 | 60.7 |
| 低分化 | 26 | 9 | 3 | 6 | 8 | 65.4 |
| 合计 | 87 | 32 | 8 | 20 | 27 | 63.2 |
3 讨论在细胞癌变过程中存在细胞增生和凋亡之间的失衡，p53和bcl-2家族被详细研究[8-13].IAP家族是一种广泛表达的抑制凋亡的基因家族，Survivin是一种结构独特的哺乳类IAP分子，是迄今发现的最强的凋亡抑制因子.他表达特点是在胚胎发育过程和常见肿瘤中表达[4-6]，而在正常成熟组织中不表达，其具体机制尚不清楚.本实验的目的是研究Survivin蛋白在人类大肠腺癌发生过程中的作用及与大肠腺癌组织分化程度的关系.本研究显示在正常大肠上皮细胞中Survivin蛋白不表达，与文献报道一致.Survivin主要定位于大肠腺瘤伴非典型增生和腺癌细胞的细胞质中，在大肠正常黏膜→轻度非典型增生→重度非典型增生→腺癌的过程中Survivin表达阳性率逐渐增高，分别是0.0%, 34.2%, 56.0%和63.2%.经统计学c2检验显示：各组与正常对照组表达差异有统计学意义(P<0.05), 轻度非典型增生和腺癌组差异有统计学意义(P<0.05)，轻度和重度非典型增生组之间及重度非典型增生和腺癌组之间差异无统计学意义.但具体分析可见轻度和重度非典型增生组阳性率分别是34.2%和56.0%，患者例数分别是35和25，c2值为2.80，0.05
研究Survivin蛋白的表达与大肠腺癌组织学分化程度的关系，本实验将87例大肠腺癌分为高分化、中分化和低分化3个亚组.各亚组样本数分别是33、28和26，Survivin表达阳性率分别是63.6%，60.7%和65.4%.经c2检验可知不同分化程度的腺癌中Survivin表达无差异，分化程度与表达强度无关系(P>0.75).此结果不同于王梅et al [14]认为在宫颈癌中Survivin的表达阳性率与组织学分级呈正相关.这种差异可能是由于组织来源不同.大肠癌Survivin表达与组织分化程度无关，这使应用Survivin作为肿瘤特异性的免疫治疗或基因治疗和诊断方法成为可能，即无论高、中、低分化的大肠癌均可通过检测Survivin而进行诊断并且用其作为大肠癌治疗的靶点.同时由于在正常细胞中Survivin蛋白不表达，所以治疗时不杀伤正常细胞.因此，本研究对大肠癌的诊断和治疗均有一定指导意义.
Survivin 作为一种新的凋亡抑制因子，其组织分布和作用机制的独特性已引起国外学者的广泛关注.但尚有许多问题有待进一步研究，如Survivin 组织细胞选择性表达的分子机制，Survivin抗凋亡的许多具体环节尚不清楚，针对Survivin的靶向治疗尚处于起步阶段.因此深入研究Survivin将为肿瘤的诊断和治疗奠定坚实的基础.
, http://www.100md.com
4 参考文献1 Shin S, Sung BJ, Cho YS, Kim HJ, Ha NC, Hwang JI,Chung CW, Jung YK, Oh BH.An anti-apoptotic protein human survivin
is a direct inhibitor of caspase-3 and -7. Biochemistry 2001 ;40:1117-1123
2 O扖onnor DS, Grossman D, Plescia J, Li F, Zhang H, Villa A, Tognin S, Marchisio PC, Altieri DC. Regulation of apoptosis
at cell division by p34cdc2 phosphorylation of survivin. Proc Natl Acad Sci USA 2000 ;97:13103-13107
, http://www.100md.com
3 Giodini A, Kallio MJ, Wall NR, Gorbsky GJ, Tognin S, Marchisio PC, Symons M, Altieri DC. Regulation of microtubule stability
and mitotic progression by survivin. Cancer Res 2002;62:2462-2467
4 Sarela AI, Verbeke CS, Ramsdale J, Davies CL, Markham AF, Guillou PJ. Expression of survivin , a novel inhibitor of
apoptosis and cell cycle regulatory protein, in pancreatic adenocarcinoma. Br J Cancer 2002;86:886-892
, http://www.100md.com
5 Mari A, Wada H, Nishimura Y, Okamoto T, Takeomoto Y, Kakishita E. Expression of antiapoptosis gene survivin in human
leukemia. Int J Hematol 2002;75:161-165
6 Das A, Tan WL, Teo J, Smith DR. Expression of survivin in primary glioblastomas. J Cancer Res Clin Oncol
2002;128:302-306
7 Yamamoto T, Tanigawa N. The role of survivin as a new target of diagnosis and treatment in human cancer.
, 百拇医药
Med Electron Microsc 2001 ;34:207-212
8 季代金，曹燕，张亚历，姜泊，余宁，冯福才，周殿元. 大肠癌HT-29，Lovo细胞p-53转录表达差异同步研究.
世界华人消化杂志 2000;8:77-79
9 张传山，王文亮，彭玮丹，胡沛臻，柴玉波，马福成. Bcl-2核酸对SMMC7721细胞的促凋亡机制.
世界华人消化杂志 2000;8:417-419
10 潘传敬，钟萍，黄晓蓉，刘宽宇，汪盛贤.胃粘膜萎缩与肠化的细胞增殖和凋亡研究.世界华人消化杂志 2000;8:143-146
11 Li HL, Chen DD, Li XH, Zhang HW, Lu YQ, Ye CL, Ren XD. Changes of NF-kB,p-53,Bcl-2 and caspase in apoptosis induced
, http://www.100md.com
by JTE-552 in human gastric adenocarcinoma cell line AGS cells: role of reactive oxygen species. World J Gastroenterol
2002; 8:431-435
12 范如英，李世荣，武子涛，吴霞. 散发性大肠癌组织及粪便P53蛋白、K-ras 及APC基因的检测.
世界华人消化杂志 2001;9:771-775
13 Erbersdobler A, Fritz H, Schnoger S, Graefen M, Hammerer P, Huland H, Henke RP. Tumour grade, proliferation,apoptosis, microvessel density, p53, and bcl-2 in prostate cancers: differences between tumours located in the transition
zone and in the peripheral zone. Eur Urol 2002; 41:40-46
14 王梅，王冰，王晓丽，莫立平，任娟，李明众.凋亡相关基因survivin 在子宫颈癌组织中的表达及其与bcl-2 、p53基因
表达相关性的初步研究.中华妇产科杂志2001;36:546-549, 百拇医药(大肠黏膜癌变过程中Survivin蛋白的表达 郑长青，林连捷，马 颖，姜卫国，马 铁，胡刚正)
