cFLIP基因表达与胃癌的关系研究
朱华乔,武汉市十四医院 湖北省武汉市 430200
罗和生,余保平,武汉大学人民医院 湖北省武汉市 430060
项目负责人 朱华乔,430200,湖北省武汉市江夏区纸坊街148号,武汉大学人民医院消化内科.
电话:027-87957300
收稿日期 2002-06-08 接受日期 2002-07-06
摘要
目的:探讨cFLIP基因在胃癌组织中表达状况及其与胃癌发生发展的关系.
, 百拇医药
方法:采用免疫组化法检测cFLIP short/long基因在48例胃癌、48例肠化胃黏膜及42例慢性胃炎黏膜中的表达，并经计算机图像分析，计算阳性细胞百分率.统计采用方差分析.
结果:cFLIPshort/long基因全部表达于胃癌组织，部分表达于肠化胃黏膜及慢性胃炎黏膜.胃癌组织中cFLIP基因表达强度(强阳性占70.8 %)显著高于肠化胃黏膜(P <0.01)及慢性胃炎黏膜(P <0.01)，且与胃癌浸润深度(P <0.05)，胃癌TNM分期(P <0.05)显著相关.而肠化胃黏膜与慢性胃炎中cFLIP基因表达差异无显著性(P >0.05).
结论: cFLIPshort/long基因特异性高表达于胃癌组织且在胃癌转化过程中是一较晚期事件，与胃癌的发生及浸润转移密切相关.
, 百拇医药
朱华乔,罗和生,余保平.cFLIP基因表达与胃癌的关系研究.世界华人消化杂志2002;10(11):1329-1330
0 引言胃癌是最常见的消化道恶性肿瘤，与其他恶性肿瘤一样，浸润转移也是胃癌患者死亡的主要原因.目前胃癌发病机制尚未完全明了，其中细胞凋亡失衡起着重要作用. CFLIP (cellular FLICE/caspase-8 inhibitory protein)是最近发现的抗凋亡基因[1]，CFLIP基因在恶性淋巴瘤，卡波济肉瘤，结肠癌等肿瘤细胞系中均有较高的表达[2].且能增强细胞对死亡受体介导的凋亡的抵抗性,然而CFLIP基因二种亚型蛋白整体表达状况与胃癌的关系国内外尚未见报道.本实验采用免疫组织化学方法对胃癌组织，肠化胃黏膜及慢性胃炎黏膜中的CFLIPshort/long 基因表达水平进行了研究，旨在初步探讨CFLIP基因表达在胃癌发生发展中的意义.
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 材料 随机收集我院2000-02/2001-10手术切除的胃癌石蜡包埋组织标本48例备用.年龄28-65岁,平均年龄48岁，男28例，女20例.按Lauren分型为肠型30例，弥漫型18例.术前均未接收放疗及化疗.对照Ⅰ组用肠化胃黏膜活检石蜡包埋组织标本48例，年龄21-65岁，平均年龄46岁，男28例，女20例.对照Ⅱ组用慢性胃炎黏膜活检石蜡包埋组织标本42例，年龄20-60岁，平均年龄45岁，男24例，女18例.各组间年龄、性别经检验差异无显著性(P >0.05).
1.2 方法 所有标本均制成4 mm厚连续切片,贴于涂有100 g/L多聚赖氨酸的载玻片上,然后进行免疫组化染色.第Ⅰ抗体为兔抗人CFLIPshort/long蛋白多克隆抗体(0.2 g/L-1),为Santa Cruz公司产品，SP试剂盒为福州迈新公司产品.微波炉抗原修复20 min后采用SP法染色，按SP试剂盒提供的说明书进行试验，并以PBS液代替Ⅰ抗作阴性对照，免疫组化完成后24 h内光镜阅片.
, 百拇医药
1.3 计算机图像分析 将免疫组化片用图像分析仪分析，每片选择4个不重复的高倍视野，计算阳性表达细胞数占全部细胞总数的百分率，即阳性表达百分率.染色结果按如下分类：- 组织标本未染色；+ <25 %的细胞染色；++25-50 %的细胞染色；+++50-75 %的细胞染色；++++>75 %的细胞染色.十～++为弱阳性,+++～++++为强阳性.
统计学处理 采用方差分析,P <0.05为有统计学意义.
2 结果
2.1 CFLIP的表达 CFLIP基因表达于细胞质，阳性呈棕褐色(图1-3)所有胃癌组织均有阳性表达，而肠化胃黏膜及慢性胃炎黏膜中CFLIP基因只部分表达，其强阳性/弱阳性分别为34/14、0/34、1/29.胃癌组织中CFLIP表达强度(强阳性占70.8 %)显著高于肠化胃黏膜(P <0.01)及慢性胃炎黏膜(P <0.01).肠化胃黏膜与慢性胃炎黏膜比较，其CFLIP基因表达无显著性差异(P >0.05)且均以弱阳性表达为主见表1.
, 百拇医药
2.2 CFLIP基因表达与胃癌浸润及转移的相关分析 见表2 结果显示 CFLIP基因与肿瘤浸润深度(c2=12.910 P <0.05) 以及T N M分期(c2=12.054 P <0.05)呈显著相关，而与患者性别、年龄及病理分型、远处转移等无明显相关(P >0.05)
表1 cFLIP基因表达情况(表中数据为阳性例数)
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表2 胃癌病理参数与cFLIP基因表达的关系
图1 CFLIPshort/long在胃癌组织中的表达，阳性染色于细胞质×400
图2 CFLIPshort/long在肠化胃黏膜中的表达，阳性染色于细胞质 ×200
, 百拇医药
图3 CFLIP short/long 在慢性胃炎黏膜中的表达，阳性染色于细胞质 ×400
3 讨论胃癌的发生发展过程中包含了一系列的基因突变，与癌基因一抑癌基因及调节肽的调控失调有关.其中凋亡失衡机制在这一过程中起重要作用.癌细胞可通过不同机制逃逸受体介导的凋亡，使肿瘤细胞继续生长.CFLIP基因是最近发现的抗凋亡基因，其基因定位于染色体2q33，细胞内CFLIP有多种拼接形式的mRNA，但在细胞内只表达两种蛋白亚型，即26KDa的短型CFLIP蛋白(CFLIPshort)和55KDa的长型CFLIP蛋白(CFLIPlong)[1].CFLIP蛋白能抑制caspase-8的活化从而阻断死亡受体Fas、TNF-R1 DR3 及TRAIL-R介导的凋亡.据研究，CFLIP可表达于一些正常组织，如心脏、骨骼肌、淋巴组织及消化道黏膜细胞等,其在恶性黑色素瘤，伯基特淋巴瘤,卡波济氏肉瘤及结肠癌细胞系等都有高水平的表达，并证实其与肿瘤发生有关[1].本研究发现， CFLIP基因在胃癌组织，肠化胃黏膜及慢性胃炎黏膜中均有不同程度表达.CFLIP基因在胃癌组织中的表达明显高于肠化胃黏膜及慢性胃炎黏膜，从而可推测CFLIP基因表达与胃癌的发生有关.有报道显示，CFLIP基因蛋白能增强细胞对死亡受体介导凋亡的抵抗性.从其作用机制来看，CFLIP基因表达亦可能是通过阻断死亡受体介导的胃黏膜细胞凋亡而诱发恶变的.胃癌的浸润转移，也是多步骤的复杂过程，与晚期癌细胞基因突变及表达产物(如细胞外基质降解酶，生长因子等)有关.本研究资料表明，肠化胃黏膜与慢性胃炎中CFLIP基因表达无明显差异，从而可推测CFLIP基因表达为胃黏膜细胞恶性转化过程中一较晚事件.同时还证实CFLIP基因表达与胃癌浸润深度、TNM分期呈正相关，因而CFLIP基因可能亦参与了促胃癌的浸润转移过程，其具体机制尚待进一步研究.
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4 参考文献1 Irmler M, Thome M, Hahne M, Schneider P, Hofmann K, Steiner V, Bodmer JL, Schroter M, Burns K, Mattmann C,Rimoldi D, French LE, Tschopp J.Inhibition of death receptor signals by cellular FLIP. Nature 1997;388;190-195
2 Tepper CG,Seldin MF. Modulation of caspase-8 and FLICE-inhibitory protein expression as a potential mechanism
of Epstein-Barr virus tumorigenesis in Burkitt抯 lymphoma. Blood 1999;94:1727-1737, 百拇医药
罗和生,余保平,武汉大学人民医院 湖北省武汉市 430060
项目负责人 朱华乔,430200,湖北省武汉市江夏区纸坊街148号,武汉大学人民医院消化内科.
电话:027-87957300
收稿日期 2002-06-08 接受日期 2002-07-06
摘要
目的:探讨cFLIP基因在胃癌组织中表达状况及其与胃癌发生发展的关系.
, 百拇医药
方法:采用免疫组化法检测cFLIP short/long基因在48例胃癌、48例肠化胃黏膜及42例慢性胃炎黏膜中的表达，并经计算机图像分析，计算阳性细胞百分率.统计采用方差分析.
结果:cFLIPshort/long基因全部表达于胃癌组织，部分表达于肠化胃黏膜及慢性胃炎黏膜.胃癌组织中cFLIP基因表达强度(强阳性占70.8 %)显著高于肠化胃黏膜(P <0.01)及慢性胃炎黏膜(P <0.01)，且与胃癌浸润深度(P <0.05)，胃癌TNM分期(P <0.05)显著相关.而肠化胃黏膜与慢性胃炎中cFLIP基因表达差异无显著性(P >0.05).
结论: cFLIPshort/long基因特异性高表达于胃癌组织且在胃癌转化过程中是一较晚期事件，与胃癌的发生及浸润转移密切相关.
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朱华乔,罗和生,余保平.cFLIP基因表达与胃癌的关系研究.世界华人消化杂志2002;10(11):1329-1330
0 引言胃癌是最常见的消化道恶性肿瘤，与其他恶性肿瘤一样，浸润转移也是胃癌患者死亡的主要原因.目前胃癌发病机制尚未完全明了，其中细胞凋亡失衡起着重要作用. CFLIP (cellular FLICE/caspase-8 inhibitory protein)是最近发现的抗凋亡基因[1]，CFLIP基因在恶性淋巴瘤，卡波济肉瘤，结肠癌等肿瘤细胞系中均有较高的表达[2].且能增强细胞对死亡受体介导的凋亡的抵抗性,然而CFLIP基因二种亚型蛋白整体表达状况与胃癌的关系国内外尚未见报道.本实验采用免疫组织化学方法对胃癌组织，肠化胃黏膜及慢性胃炎黏膜中的CFLIPshort/long 基因表达水平进行了研究，旨在初步探讨CFLIP基因表达在胃癌发生发展中的意义.
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1 材料和方法
1.1 材料 随机收集我院2000-02/2001-10手术切除的胃癌石蜡包埋组织标本48例备用.年龄28-65岁,平均年龄48岁，男28例，女20例.按Lauren分型为肠型30例，弥漫型18例.术前均未接收放疗及化疗.对照Ⅰ组用肠化胃黏膜活检石蜡包埋组织标本48例，年龄21-65岁，平均年龄46岁，男28例，女20例.对照Ⅱ组用慢性胃炎黏膜活检石蜡包埋组织标本42例，年龄20-60岁，平均年龄45岁，男24例，女18例.各组间年龄、性别经检验差异无显著性(P >0.05).
1.2 方法 所有标本均制成4 mm厚连续切片,贴于涂有100 g/L多聚赖氨酸的载玻片上,然后进行免疫组化染色.第Ⅰ抗体为兔抗人CFLIPshort/long蛋白多克隆抗体(0.2 g/L-1),为Santa Cruz公司产品，SP试剂盒为福州迈新公司产品.微波炉抗原修复20 min后采用SP法染色，按SP试剂盒提供的说明书进行试验，并以PBS液代替Ⅰ抗作阴性对照，免疫组化完成后24 h内光镜阅片.
, 百拇医药
1.3 计算机图像分析 将免疫组化片用图像分析仪分析，每片选择4个不重复的高倍视野，计算阳性表达细胞数占全部细胞总数的百分率，即阳性表达百分率.染色结果按如下分类：- 组织标本未染色；+ <25 %的细胞染色；++25-50 %的细胞染色；+++50-75 %的细胞染色；++++>75 %的细胞染色.十～++为弱阳性,+++～++++为强阳性.
统计学处理 采用方差分析,P <0.05为有统计学意义.
2 结果
2.1 CFLIP的表达 CFLIP基因表达于细胞质，阳性呈棕褐色(图1-3)所有胃癌组织均有阳性表达，而肠化胃黏膜及慢性胃炎黏膜中CFLIP基因只部分表达，其强阳性/弱阳性分别为34/14、0/34、1/29.胃癌组织中CFLIP表达强度(强阳性占70.8 %)显著高于肠化胃黏膜(P <0.01)及慢性胃炎黏膜(P <0.01).肠化胃黏膜与慢性胃炎黏膜比较，其CFLIP基因表达无显著性差异(P >0.05)且均以弱阳性表达为主见表1.
, 百拇医药
2.2 CFLIP基因表达与胃癌浸润及转移的相关分析 见表2 结果显示 CFLIP基因与肿瘤浸润深度(c2=12.910 P <0.05) 以及T N M分期(c2=12.054 P <0.05)呈显著相关，而与患者性别、年龄及病理分型、远处转移等无明显相关(P >0.05)
表1 cFLIP基因表达情况(表中数据为阳性例数)
| 等级 | 胃癌组织 | 肠化胃黏膜 | 慢性胃炎黏膜 |
| - | 0 | 14 | 12 |
| + | 4 | 15 | 21 |
| ++ | 10 | 19 | 8 |
| +++ | 22 | 0 | 1 |
| ++++ | 12 | 0 | 0 |
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表2 胃癌病理参数与cFLIP基因表达的关系
| 临床病理指标 | n | cFLIP基因表达染色结果 | ||||
| + | ++ | +++ | ++++ | P | ||
| 性 别 | ||||||
| 男 | 28 | 3 | 6 | 12 | 7 | >0.05 |
| 女 | 20 | 1 | 4 | 10 | 5 | |
| 年 龄 | ||||||
| <50 | 16 | 2 | 4 | 6 | 4 | >0.05 |
| ≥50 | 32 | 3 | 6 | 15 | 8 | |
| 病理分型 | ||||||
| 肠型 | 30 | 2 | 6 | 13 | 8 | >0.05 |
| 弥漫型 | 18 | 2 | 4 | 9 | 4 | |
| 肿瘤浸润深度 | ||||||
| T1 | 4 | 0 | 3 | 1 | 0 | |
| T2 | 10 | 1 | 3 | 4 | 2 | <0.05 |
| T3 | 20 | 1 | 2 | 12 | 5 | |
| T4 | 14 | 2 | 2 | 5 | 5 | |
| T N M分期 | ||||||
| Ⅰ | 10 | 2 | 3 | 3 | 2 | |
| Ⅱ | 7 | 0 | 1 | 4 | 4 | <0.05 |
| Ⅲ | 16 | 1 | 4 | 7 | 7 | |
| Ⅳ | 15 | 1 | 2 | 8 | 8 | |
, 百拇医药 淋巴结转移 | ||||||
| 有 | 36 | 4 | 10 | 14 | 8 | >0.05 |
| 无 | 12 | 1 | 3 | 5 | 3 | |
| 远处转移 | ||||||
| M0 | 43 | 4 | 8 | 20 | 11 | >0.05 |
| M1 | 5 | 0 | 2 | 2 | 1 |
图1 CFLIPshort/long在胃癌组织中的表达，阳性染色于细胞质×400
图2 CFLIPshort/long在肠化胃黏膜中的表达，阳性染色于细胞质 ×200
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图3 CFLIP short/long 在慢性胃炎黏膜中的表达，阳性染色于细胞质 ×400
3 讨论胃癌的发生发展过程中包含了一系列的基因突变，与癌基因一抑癌基因及调节肽的调控失调有关.其中凋亡失衡机制在这一过程中起重要作用.癌细胞可通过不同机制逃逸受体介导的凋亡，使肿瘤细胞继续生长.CFLIP基因是最近发现的抗凋亡基因，其基因定位于染色体2q33，细胞内CFLIP有多种拼接形式的mRNA，但在细胞内只表达两种蛋白亚型，即26KDa的短型CFLIP蛋白(CFLIPshort)和55KDa的长型CFLIP蛋白(CFLIPlong)[1].CFLIP蛋白能抑制caspase-8的活化从而阻断死亡受体Fas、TNF-R1 DR3 及TRAIL-R介导的凋亡.据研究，CFLIP可表达于一些正常组织，如心脏、骨骼肌、淋巴组织及消化道黏膜细胞等,其在恶性黑色素瘤，伯基特淋巴瘤,卡波济氏肉瘤及结肠癌细胞系等都有高水平的表达，并证实其与肿瘤发生有关[1].本研究发现， CFLIP基因在胃癌组织，肠化胃黏膜及慢性胃炎黏膜中均有不同程度表达.CFLIP基因在胃癌组织中的表达明显高于肠化胃黏膜及慢性胃炎黏膜，从而可推测CFLIP基因表达与胃癌的发生有关.有报道显示，CFLIP基因蛋白能增强细胞对死亡受体介导凋亡的抵抗性.从其作用机制来看，CFLIP基因表达亦可能是通过阻断死亡受体介导的胃黏膜细胞凋亡而诱发恶变的.胃癌的浸润转移，也是多步骤的复杂过程，与晚期癌细胞基因突变及表达产物(如细胞外基质降解酶，生长因子等)有关.本研究资料表明，肠化胃黏膜与慢性胃炎中CFLIP基因表达无明显差异，从而可推测CFLIP基因表达为胃黏膜细胞恶性转化过程中一较晚事件.同时还证实CFLIP基因表达与胃癌浸润深度、TNM分期呈正相关，因而CFLIP基因可能亦参与了促胃癌的浸润转移过程，其具体机制尚待进一步研究.
, http://www.100md.com
4 参考文献1 Irmler M, Thome M, Hahne M, Schneider P, Hofmann K, Steiner V, Bodmer JL, Schroter M, Burns K, Mattmann C,Rimoldi D, French LE, Tschopp J.Inhibition of death receptor signals by cellular FLIP. Nature 1997;388;190-195
2 Tepper CG,Seldin MF. Modulation of caspase-8 and FLICE-inhibitory protein expression as a potential mechanism
of Epstein-Barr virus tumorigenesis in Burkitt抯 lymphoma. Blood 1999;94:1727-1737, 百拇医药
