CK20 mRNA RT-PCR检测诊断胃癌微小转移
章希炜, 范萍, 杨宏宇, 杨力, 陈国玉,南京医科大学第一附属医院普外科 江苏省南京市210029
江苏省科委基金资助项目，NO.BS98052
项目负责人 章希炜，210029，江苏省南京市，南京医科大学第一附属医院普外科. xiwei1092@hotmail.com
电话:025-6472378
收稿日期 2001-12-04 接受日期 2002-01-04
摘要
目的:观察胃癌患者骨髓、门静脉和外周血CK20mRNA的RT-PCR检测在诊断胃癌微小转移的意义.
, 百拇医药
方法:采用RT-PCR方法检测47例胃癌患者和8例非恶性病手术患者骨髓、门静脉及外周血CK20mRNA的表达.
结果:CK20 mRNA在胃癌患者骨髓、门静脉及外周血中阳性表达率分别为41/47；40/47；33/47，随临床分期进展阳性表达率升高.骨髓和门静脉血阳性表达率稍高于外周血(P >0.05)；外周血与骨髓和门静脉血阳性表达符合率分别为88.4 %和91.2 %.8例对照患者均无阳性表达.
结论:CK20 mRNA是较特异的胃癌微小转移指标，外周血与骨髓和门静脉血有相近的CK20mRNA阳性表达率和较高的符合率.可成为方便的检测指标，作为指导综合治疗、判断疗效及预后的因素之一.
章希炜, 范萍, 杨宏宇, 杨力, 陈国玉.CK20 mRNA RT-PCR检测诊断胃癌微小转移.世界华人消化杂志 2002;10(12):1463-1464
, 百拇医药
0 引言转移和复发是导致胃癌患者死亡的主要原因，因而，确定胃癌有无转移倾向，早期诊断胃癌的微小转移对患者预后及指导综合治疗至关重要[1-4] .然而，目前的临床诊断方法不能检测循环中的微量或单个胃癌细胞，我们应用靶向细胞角蛋白20(CK20)基因mRNA的非核素逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法，检测了47例胃癌患者和8例非恶性病手术患者骨髓、门静脉及外周血中CK20的表达，探讨胃癌微小转移的诊断及其临床意义.
1 材料和方法
1.1 材料 标本采集于47例接受手术治疗的胃癌患者及8名接受腹部手术的非恶性病志愿患者，年龄79-23岁，男性38例，女性17例.
1.2方法 (1)骨髓血:麻醉平稳后，自髂前上嵴或胸骨柄穿刺抽取骨髓血2-5 ml;(2)门静脉血：进腹，探查前自胃网膜右静脉插管10-15 cm至门静脉,抽取5-10 ml血液;(3)外周血:手术前30 min自四肢表浅静脉抽取外周血5-10 ml.常规肝素抗凝，淋巴细胞分离液分离，分别分离单个核细胞，加入Trizol 1 ml于-20 ℃保存.
, 百拇医药
1.3总RNA提取 标本血的单个核细胞中加入1 ml Trizol,室温下放置5 min，加入0.2 ml氯仿，室温振荡15 min,放置2 3 min,2 8 ℃下12 000 g离心15 min .吸取上层无色液相至另一管中，加入0.5 ml异丙醇，室温下放置10 min，2 8 ℃下12 000 g离心10 min.弃上清，加入75 %乙醇1 ml(用前用DEPC水配)，振荡器混匀，2 8 ℃下7 500 g离心5 min,弃上清,半干时用无Rnase水溶解，吸头冲吸混匀,置55-60 ℃ 10 min使其充分溶解.在分光光度计上检测OD260/OD280的比值以验证RNA的纯度.RNA定量[RNA] mg/ml=OD260×44×稀释倍数.
1.4 RT-PCR方法 采用两步法，参照[5-8]文献，CK20引物序列上游:5-CAGACACACGGTGAACTATGG-3;下游:5-GATCAGCTTCCACTGTTAGACG-3,扩增产物片段长度为370 bp,b-肌动蛋白(b-actin)引物序列上游:5-CACTGTGTTGGCGTACAGGT-3;下游:5-TCATCACCATTGGCAATGAG-3,扩增产物片段长度为154 bp.引物均由加拿大Sangon上海分公司合成,PAGE纯化.RT的反应体积为20 ml.逆转录反应体系如下:10× 逆转录缓冲液2 ml,10mMdNTPs2 ml,Rnasin0.5 ml(20u),AMV逆转录酶1 ml(5u),25mMMgCl12 4 ml,Oligo(Gt)15 1 ml(0.5 mg),样本RNA3 m(2 mg),补DEPC处理过的水至体积20 ml.上述成分混匀后置于PE-2400型PCR仪中,42 ℃ 30 min,99 ℃ 5 min灭活AMV酶.PCR反应体系:逆转录产物10 ml,25Mm MgCl12 4 ml,10×PCR 反应缓冲液8 ml,TaqDNA酶1 ml(5u),引物20 pmol,补DEPC处理过的水至终体积100 ml.反应条件:预变性,94 ℃ 5 min;变性,94 ℃ 1 min;退火,60 ℃1min,延伸,72 ℃ 1 min 40个循环;最后72 ℃延伸7 min.PCR产物15 ml上样于2 %琼脂糖凝胶(0.5 mg/ml溴化乙锭),5 V/cm电泳,电泳缓冲液为1×TBE.紫外透析灯下对凝胶进行摄影.
, http://www.100md.com
统计学处理 采用x2 检验,P <0.05为差异显著.
2 结果2.1 8名非恶性病患者骨髓、门静脉及外周血中CK20无阳性表达.
2.2 CK20在47例胃癌患者骨髓、门静脉及外周血中的阳性表达率分别为41/47；40/47；33/47.骨髓及门静脉血阳性表达率稍高于外周血(P >0.05);外周血与骨髓和门静脉血阳性表达符合率分别为88.4 %和91.2 %;肿瘤临床分期Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期患者阳性表达不差异显著，Ⅰ期患者阳性表达较低(P <0.01)(见表1、2).
表1 CK20在胃癌患者骨髓、门静脉和外周血中的表达
, 百拇医药
x2检验:外周血CK20阳性表达率vs骨髓及门静脉血,外周血低P >0.05
表2 CK20阳性表达与胃癌TNM分期的关系
, 百拇医药
x2检验:临床分期Ⅰ期患者CK20阳性表达率vsⅡ、Ⅲ、Ⅳ期患者，Ⅰ期患者低(P <0.01).
3 讨论当胃癌的局部控制措施已达充分效果后，肿瘤治疗的失败多数是全身转移的结果，早期发现即可加强辅助治疗以期改善预后.微小转移是指非血液系统的恶性肿瘤在发展过程中，播散并存活于淋巴系统、血循环、骨髓、肝、肺等组织器官中的单个或微小肿瘤细胞团，常无仍何临床表现，常规检查方法如CT、MRI、单抗放射显影技术、普通病理检查等都难发现.资料表明，微小转移阳性的肿瘤患者，其转移、复发率远高于阴性患者，微小转移可作为独立的预后指标，其价值优于Dukes分期和肿瘤分级[1,5,9-13] .
CK是分布于外胚层起源细胞中的中间纤维丝，为细胞骨架的组分之一，仅在上皮来源的组织或细胞中表达.已知CK至少包括20个成员，其中CK20的上皮细胞特异性更为严格，正常组织中，仅见于胃肠道和泌尿道黏膜细胞，其他如乳腺、平滑肌、血细胞、淋巴细胞和骨髓细胞等均为阴性.CK20的表达在细胞发生化生、恶变、肿瘤转移等改变时持续表达阳性[6] .RT-PCR技术被应用于肿瘤微小转移的研究，具有高度敏感性，可准确检测1 g组织或1 ml液体中的1个癌细胞，被认为是目前检测微转移的最有效方法[14] .本研究结果8名非恶性病患者三种来源血样本均无CK20阳性表达，胃癌患者则有相当高的阳性表达，提示了CK20在胃癌微小转移中的高特异性和RT-PCR方法的高敏感性.
, 百拇医药
目前，CK20mRNA作为靶RNA用于胃癌微小转移的研究国内、外报道尚少.本研究发现：CK20在47例胃癌患者骨髓、门静脉及外周血中的阳性表达率分别为41/47；40/47；33/47.骨髓及门静脉血阳性表达率稍高于外周血(P >0.05) ;外周血与骨髓和门静脉血阳性表达符合率分别为88.4 %和91.2 %；肿瘤临床分期Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期患者阳性表达不差异显著，Ⅰ期患者阳性表达较低(P <0.01).提示：(1) CK20mRNA作为诊断胃癌微小转移的靶RNA，具有较高的特异性和敏感性；(2)由于肿瘤的血转移途径以及骨髓独特的网状结构对肿瘤细胞的浓缩作用，门静脉和骨髓血一直被作为消化道肿瘤微小转移检测的主要样本来源，RT-PCR技术的应用使得外周血有与门静脉和骨髓血相近的CK20阳性表达率以及较高的阳性表达符合率.外周血作为样本来源，方便、快捷、可以重复取样，更有利于判断预后、预测复发和判定疗效.(3) 作为全身性疾病，早期胃癌即有血转移倾向，外周血微小转移检测可以为全身综合治疗提供参考依据.
4 参考文献1 夏加增，朱正纲，刘炳亚，王敏，尹浩然.免疫组化检测胃癌淋巴结微转移的意义.世界华人消化杂志 2000;8:1113-1116
, 百拇医药
2 张宗城，张健，张积仁.消化系统肿瘤转移的诊断及评价.世界华人消化杂志 1999;7:408-409
3 Maehrara Y,Hasuda S,Koga T,Tokunaga E,Kakeji Y,Sugimachi K.Postoperative outcome and sites of recurrence in
patients following curative resection of gastric cancer.Brit J Surg 2000;87:353-357
4 Yoo CH,Noh SH,Shin DW,Choi SH,Min JS.Rrcurrence following curative resection for gastric cancer.Brit J
, http://www.100md.com Surg 2000;87:236-242
5 Wyld DK, Selby P,Timothy Perren J, Jonas SK, Allen-Mersh TG, Wheeldon J, Brechill SA.Detection of colorectal cancer
cells in peripheral blood by reverse-transcriptase polymerase chain reaction for cytokeratin20.Int J Cancer 1998;79:288-293
6 Raj GV, Moreno JG, Gomella LG.Utilization of polymerase chain reaction technology in the detection of solid tumors.
, http://www.100md.com
Cancer 1998;82:1419-1442
7 Yamaguchi K,Takagi Y,Aoki S,Futamura M,Saji S.Significant detection of circulating cancer cells in the blood by
reverse transcriptase-polymerase chain reaction during colorectal cancer resection.Annal Surg 2000;232:58-65
8 Wharton RQ,Jonas SK,Glover C,Khan ZA,Klokouzas A,Quinn H,Henry M,Allen-Mersh TG.Increasad detection of circulating
, 百拇医药
tumor cells in the blood of colorectal carcinoma patients using two reverse transcription-PCR assays and muktiple
blood asmples.Clinical Cancer Research 1999;5:4158-4163
9 Sakskura C,Hagiwara A,Shirasu M,Yasuoka R,Fujita Y,Nakanishi M,Auagane H,Masuda K,Shimomura K,Abe T,Yamagishi H.Polymerase chain reaction for detection of carcinoembryonic antigen-expressing tumor cells on milky spots
of the greater omentum in gastric cancer patients:a pilot study.Int J Cancer 2001;95:286-289
, http://www.100md.com
10 杨家辉，饶本强，王瑶，涂小煌，张连阳，陈少华，欧阳学农，戴西湖.大肠癌患者外周血癌细胞检测的意义.世界华
人消化杂志 2000;8:187-189
11 赵增顺，王少文，焦喜林，陈金辉.胃癌根治术对单细胞转移的影响.世界华人消化杂志 1998;6:610-611
12 Liu YH,Zhou RL,Rui JA.Detection of hepatoma cells in peripheral blood of HCC patients by nested RT-PCR.World J
Gastroentrol 1998;4:106-108
13 邬光惠，陈乃玲，范公忍，田惠英，熊锦华，黄耀煊.原发性肝癌患者外周血中甲胎蛋白mRNA的意义.世界华人
消化杂志 1999;7:153-155
14 Cai JH,Ikeguchi M,Maeta M,Kaibara N.Micrometastasis in lymph nodes and microinvasion of the muscularis propria in
primary lesions of submucosal gastric cancer.Surgery 1999;126:32-39, http://www.100md.com(章希炜,范 萍,杨宏宇,杨 力,陈国玉)
江苏省科委基金资助项目，NO.BS98052
项目负责人 章希炜，210029，江苏省南京市，南京医科大学第一附属医院普外科. xiwei1092@hotmail.com
电话:025-6472378
收稿日期 2001-12-04 接受日期 2002-01-04
摘要
目的:观察胃癌患者骨髓、门静脉和外周血CK20mRNA的RT-PCR检测在诊断胃癌微小转移的意义.
, 百拇医药
方法:采用RT-PCR方法检测47例胃癌患者和8例非恶性病手术患者骨髓、门静脉及外周血CK20mRNA的表达.
结果:CK20 mRNA在胃癌患者骨髓、门静脉及外周血中阳性表达率分别为41/47；40/47；33/47，随临床分期进展阳性表达率升高.骨髓和门静脉血阳性表达率稍高于外周血(P >0.05)；外周血与骨髓和门静脉血阳性表达符合率分别为88.4 %和91.2 %.8例对照患者均无阳性表达.
结论:CK20 mRNA是较特异的胃癌微小转移指标，外周血与骨髓和门静脉血有相近的CK20mRNA阳性表达率和较高的符合率.可成为方便的检测指标，作为指导综合治疗、判断疗效及预后的因素之一.
章希炜, 范萍, 杨宏宇, 杨力, 陈国玉.CK20 mRNA RT-PCR检测诊断胃癌微小转移.世界华人消化杂志 2002;10(12):1463-1464
, 百拇医药
0 引言转移和复发是导致胃癌患者死亡的主要原因，因而，确定胃癌有无转移倾向，早期诊断胃癌的微小转移对患者预后及指导综合治疗至关重要[1-4] .然而，目前的临床诊断方法不能检测循环中的微量或单个胃癌细胞，我们应用靶向细胞角蛋白20(CK20)基因mRNA的非核素逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法，检测了47例胃癌患者和8例非恶性病手术患者骨髓、门静脉及外周血中CK20的表达，探讨胃癌微小转移的诊断及其临床意义.
1 材料和方法
1.1 材料 标本采集于47例接受手术治疗的胃癌患者及8名接受腹部手术的非恶性病志愿患者，年龄79-23岁，男性38例，女性17例.
1.2方法 (1)骨髓血:麻醉平稳后，自髂前上嵴或胸骨柄穿刺抽取骨髓血2-5 ml;(2)门静脉血：进腹，探查前自胃网膜右静脉插管10-15 cm至门静脉,抽取5-10 ml血液;(3)外周血:手术前30 min自四肢表浅静脉抽取外周血5-10 ml.常规肝素抗凝，淋巴细胞分离液分离，分别分离单个核细胞，加入Trizol 1 ml于-20 ℃保存.
, 百拇医药
1.3总RNA提取 标本血的单个核细胞中加入1 ml Trizol,室温下放置5 min，加入0.2 ml氯仿，室温振荡15 min,放置2 3 min,2 8 ℃下12 000 g离心15 min .吸取上层无色液相至另一管中，加入0.5 ml异丙醇，室温下放置10 min，2 8 ℃下12 000 g离心10 min.弃上清，加入75 %乙醇1 ml(用前用DEPC水配)，振荡器混匀，2 8 ℃下7 500 g离心5 min,弃上清,半干时用无Rnase水溶解，吸头冲吸混匀,置55-60 ℃ 10 min使其充分溶解.在分光光度计上检测OD260/OD280的比值以验证RNA的纯度.RNA定量[RNA] mg/ml=OD260×44×稀释倍数.
1.4 RT-PCR方法 采用两步法，参照[5-8]文献，CK20引物序列上游:5-CAGACACACGGTGAACTATGG-3;下游:5-GATCAGCTTCCACTGTTAGACG-3,扩增产物片段长度为370 bp,b-肌动蛋白(b-actin)引物序列上游:5-CACTGTGTTGGCGTACAGGT-3;下游:5-TCATCACCATTGGCAATGAG-3,扩增产物片段长度为154 bp.引物均由加拿大Sangon上海分公司合成,PAGE纯化.RT的反应体积为20 ml.逆转录反应体系如下:10× 逆转录缓冲液2 ml,10mMdNTPs2 ml,Rnasin0.5 ml(20u),AMV逆转录酶1 ml(5u),25mMMgCl12 4 ml,Oligo(Gt)15 1 ml(0.5 mg),样本RNA3 m(2 mg),补DEPC处理过的水至体积20 ml.上述成分混匀后置于PE-2400型PCR仪中,42 ℃ 30 min,99 ℃ 5 min灭活AMV酶.PCR反应体系:逆转录产物10 ml,25Mm MgCl12 4 ml,10×PCR 反应缓冲液8 ml,TaqDNA酶1 ml(5u),引物20 pmol,补DEPC处理过的水至终体积100 ml.反应条件:预变性,94 ℃ 5 min;变性,94 ℃ 1 min;退火,60 ℃1min,延伸,72 ℃ 1 min 40个循环;最后72 ℃延伸7 min.PCR产物15 ml上样于2 %琼脂糖凝胶(0.5 mg/ml溴化乙锭),5 V/cm电泳,电泳缓冲液为1×TBE.紫外透析灯下对凝胶进行摄影.
, http://www.100md.com
统计学处理 采用x2 检验,P <0.05为差异显著.
2 结果2.1 8名非恶性病患者骨髓、门静脉及外周血中CK20无阳性表达.
2.2 CK20在47例胃癌患者骨髓、门静脉及外周血中的阳性表达率分别为41/47；40/47；33/47.骨髓及门静脉血阳性表达率稍高于外周血(P >0.05);外周血与骨髓和门静脉血阳性表达符合率分别为88.4 %和91.2 %;肿瘤临床分期Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期患者阳性表达不差异显著，Ⅰ期患者阳性表达较低(P <0.01)(见表1、2).
表1 CK20在胃癌患者骨髓、门静脉和外周血中的表达
| 标本来源 | CK20 (+) | CK20 (-) |
| 骨髓 | 41 | 6 |
| 门静脉 | 40 | 7 |
| 外周 | 33 | 14 |
| 合计 | 93 | 48 |
, 百拇医药
x2检验:外周血CK20阳性表达率vs骨髓及门静脉血,外周血低P >0.05
表2 CK20阳性表达与胃癌TNM分期的关系
| CK20 (+) | CK20 (-) | ||||||
| 骨髓 | 门静脉 | 外周 | 骨髓 | 门静脉 | 外周 | ||
| 临床分期 | Ⅰ期(n =7) | 3 | 3 | 2 | 4 | 4 | 5 |
| Ⅱ期(n =13) | 12 | 12 | 10 | 1 | 1 | 3 | |
| Ⅲ期 (n =19) | 18 | 17 | 14 | 1 | 2 | 5 | |
| Ⅳ期 ( n=8) | 8 | 8 | 7 | 0 | 0 | 1 | |
| 合计 | 41 | 40 | 33 | 6 | 7 | 14 |
, 百拇医药
x2检验:临床分期Ⅰ期患者CK20阳性表达率vsⅡ、Ⅲ、Ⅳ期患者，Ⅰ期患者低(P <0.01).
3 讨论当胃癌的局部控制措施已达充分效果后，肿瘤治疗的失败多数是全身转移的结果，早期发现即可加强辅助治疗以期改善预后.微小转移是指非血液系统的恶性肿瘤在发展过程中，播散并存活于淋巴系统、血循环、骨髓、肝、肺等组织器官中的单个或微小肿瘤细胞团，常无仍何临床表现，常规检查方法如CT、MRI、单抗放射显影技术、普通病理检查等都难发现.资料表明，微小转移阳性的肿瘤患者，其转移、复发率远高于阴性患者，微小转移可作为独立的预后指标，其价值优于Dukes分期和肿瘤分级[1,5,9-13] .
CK是分布于外胚层起源细胞中的中间纤维丝，为细胞骨架的组分之一，仅在上皮来源的组织或细胞中表达.已知CK至少包括20个成员，其中CK20的上皮细胞特异性更为严格，正常组织中，仅见于胃肠道和泌尿道黏膜细胞，其他如乳腺、平滑肌、血细胞、淋巴细胞和骨髓细胞等均为阴性.CK20的表达在细胞发生化生、恶变、肿瘤转移等改变时持续表达阳性[6] .RT-PCR技术被应用于肿瘤微小转移的研究，具有高度敏感性，可准确检测1 g组织或1 ml液体中的1个癌细胞，被认为是目前检测微转移的最有效方法[14] .本研究结果8名非恶性病患者三种来源血样本均无CK20阳性表达，胃癌患者则有相当高的阳性表达，提示了CK20在胃癌微小转移中的高特异性和RT-PCR方法的高敏感性.
, 百拇医药
目前，CK20mRNA作为靶RNA用于胃癌微小转移的研究国内、外报道尚少.本研究发现：CK20在47例胃癌患者骨髓、门静脉及外周血中的阳性表达率分别为41/47；40/47；33/47.骨髓及门静脉血阳性表达率稍高于外周血(P >0.05) ;外周血与骨髓和门静脉血阳性表达符合率分别为88.4 %和91.2 %；肿瘤临床分期Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期患者阳性表达不差异显著，Ⅰ期患者阳性表达较低(P <0.01).提示：(1) CK20mRNA作为诊断胃癌微小转移的靶RNA，具有较高的特异性和敏感性；(2)由于肿瘤的血转移途径以及骨髓独特的网状结构对肿瘤细胞的浓缩作用，门静脉和骨髓血一直被作为消化道肿瘤微小转移检测的主要样本来源，RT-PCR技术的应用使得外周血有与门静脉和骨髓血相近的CK20阳性表达率以及较高的阳性表达符合率.外周血作为样本来源，方便、快捷、可以重复取样，更有利于判断预后、预测复发和判定疗效.(3) 作为全身性疾病，早期胃癌即有血转移倾向，外周血微小转移检测可以为全身综合治疗提供参考依据.
4 参考文献1 夏加增，朱正纲，刘炳亚，王敏，尹浩然.免疫组化检测胃癌淋巴结微转移的意义.世界华人消化杂志 2000;8:1113-1116
, 百拇医药
2 张宗城，张健，张积仁.消化系统肿瘤转移的诊断及评价.世界华人消化杂志 1999;7:408-409
3 Maehrara Y,Hasuda S,Koga T,Tokunaga E,Kakeji Y,Sugimachi K.Postoperative outcome and sites of recurrence in
patients following curative resection of gastric cancer.Brit J Surg 2000;87:353-357
4 Yoo CH,Noh SH,Shin DW,Choi SH,Min JS.Rrcurrence following curative resection for gastric cancer.Brit J
, http://www.100md.com Surg 2000;87:236-242
5 Wyld DK, Selby P,Timothy Perren J, Jonas SK, Allen-Mersh TG, Wheeldon J, Brechill SA.Detection of colorectal cancer
cells in peripheral blood by reverse-transcriptase polymerase chain reaction for cytokeratin20.Int J Cancer 1998;79:288-293
6 Raj GV, Moreno JG, Gomella LG.Utilization of polymerase chain reaction technology in the detection of solid tumors.
, http://www.100md.com
Cancer 1998;82:1419-1442
7 Yamaguchi K,Takagi Y,Aoki S,Futamura M,Saji S.Significant detection of circulating cancer cells in the blood by
reverse transcriptase-polymerase chain reaction during colorectal cancer resection.Annal Surg 2000;232:58-65
8 Wharton RQ,Jonas SK,Glover C,Khan ZA,Klokouzas A,Quinn H,Henry M,Allen-Mersh TG.Increasad detection of circulating
, 百拇医药
tumor cells in the blood of colorectal carcinoma patients using two reverse transcription-PCR assays and muktiple
blood asmples.Clinical Cancer Research 1999;5:4158-4163
9 Sakskura C,Hagiwara A,Shirasu M,Yasuoka R,Fujita Y,Nakanishi M,Auagane H,Masuda K,Shimomura K,Abe T,Yamagishi H.Polymerase chain reaction for detection of carcinoembryonic antigen-expressing tumor cells on milky spots
of the greater omentum in gastric cancer patients:a pilot study.Int J Cancer 2001;95:286-289
, http://www.100md.com
10 杨家辉，饶本强，王瑶，涂小煌，张连阳，陈少华，欧阳学农，戴西湖.大肠癌患者外周血癌细胞检测的意义.世界华
人消化杂志 2000;8:187-189
11 赵增顺，王少文，焦喜林，陈金辉.胃癌根治术对单细胞转移的影响.世界华人消化杂志 1998;6:610-611
12 Liu YH,Zhou RL,Rui JA.Detection of hepatoma cells in peripheral blood of HCC patients by nested RT-PCR.World J
Gastroentrol 1998;4:106-108
13 邬光惠，陈乃玲，范公忍，田惠英，熊锦华，黄耀煊.原发性肝癌患者外周血中甲胎蛋白mRNA的意义.世界华人
消化杂志 1999;7:153-155
14 Cai JH,Ikeguchi M,Maeta M,Kaibara N.Micrometastasis in lymph nodes and microinvasion of the muscularis propria in
primary lesions of submucosal gastric cancer.Surgery 1999;126:32-39, http://www.100md.com(章希炜,范 萍,杨宏宇,杨 力,陈国玉)
