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编号:10693900
丙型肝炎病毒核心区蛋白和细胞凋亡对HepG2细胞周期的影响
http://www.100md.com 2003年3月15日 《世界华人消化杂志》 2003年第3期
     全俊,胡国龄,范学工,谭德明,中南大学湘雅医院传染科 湖南省长沙市 410008

    项目负责人:全俊,410008,湖南省长沙市,中南大学湘雅医院传染科. quan73jun@hotmail. com

    电话:0731-4327221

    收稿日期:2002-10-07 接受日期:2002-10-21

    摘要

    目的:
研究丙型肝炎病毒核心区(HCV-C)蛋白和细胞凋亡对肝癌细胞HepG2细胞周期的影响.

    方法:首先运用基因重组技术构建包含HCV-C基因的真核表达质粒pcDNA3. 1,然后利用脂质体介导将重组真核表达质粒转染肝癌细胞HepG2,经G418筛选获得稳定转染HepG2 细胞(HCV-C转染HepG2细胞),经RT-PCR和间接免疫荧光法证实其中有HCV-C蛋白表达. 然后进行如下实验: (1)MTT法检测HCV-C转染HepG2细胞、空白质粒转染HepG2细胞和未转染HepG2细胞生长增生率;(2)流式细胞术(FACS)检测三组细胞凋亡率和细胞周期,以及HCV-C转染HepG2细胞经Fas抗体诱导凋亡后的细胞周期变化.

    结果: (1)HCV-C转染HepG2细胞增生率显著高于空白质粒转染HepG2和未转染HepG2细胞增生率;(2)细胞未经Fas抗体诱导凋亡时,HCV-C转染HepG2细胞S期所占百分率高于未转染HepG2细胞S期所占百分率,HCV-C转染HepG2细胞凋亡率低于无HCV-C转染HepG2细胞凋亡率;HCV-C转染HepG2细胞经Fas抗体诱导凋亡时,细胞S期所占百分率低于未经诱导凋亡细胞S期所占百分率.

    结论: (1)HCV-C蛋白具有抑制HepG2细胞凋亡的作用;(2)HCV-C蛋白促进HepG2细胞从G0/1期进入S期,从而可能促进细胞生长增生,抑制细胞凋亡;Fas抗体诱导细胞凋亡时细胞被阻滞于G0/1期.

    全俊,胡国龄,范学工,谭德明. 丙型肝炎病毒核心区蛋白和细胞凋亡对HepG2细胞周期的影响. 世界华人消化杂志 2003;11(3):350-352

    0 引言丙型肝炎病毒(HCV)感染是引起输血后肝炎的主要病原体,且HCV感染后大部分会导致感染慢性化,可引起慢性丙型肝炎、肝炎后肝硬化及肝细胞癌(HCC)等严重后果. 目前对丙型肝炎的发病机制尚不清楚,免疫损伤可能是其主要致病机制,但HCV对肝细胞的直接作用也起着一定作用,其中包括HCV对肝细胞增生和细胞周期的影响[1-3]. Kalkeri et al [4,5]发现转染了HCV全基因的细胞增生受到抑制; Werling et al [6]报道慢性丙型肝炎患者肝细胞增生率低于非HCV所致慢性肝炎的肝细胞增生率,说明HCV具有抑制肝细胞增生的能力. 丙型肝炎病毒核心区(HCV-C)蛋白对细胞增生和细胞周期的影响还不清楚. 部分认为HCV-C蛋白抑制细胞凋亡促进细胞增生[7-9],部分认为HCV-C蛋白抑制细胞增生[10]. 细胞周期分为G0/1期、S期和G2/M期,细胞周期在不同时相的多个调控点上受到调控,其中以G1/S和G2/M期转换调控点最为重要[11,12]. 细胞周期阻断与细胞凋亡关系不明确,细胞周期阻断并不是越完全越促使细胞凋亡[13]. 本实验旨在研究HCV-C和细胞凋亡对细胞周期的影响.

    1 材料和方法

    1.1
材料 DNA纯化试剂盒(QIAGEN),培养基DMEM,脂质体Lipofectamine2000、抗生素G418(GIBCO),RT-PCR逆转录试剂盒(Promega),FITC标记山羊抗人IgG(武汉博士德),兔抗人Fas多克隆抗体(Santa Cruz). 含有HCV-C,E1,E2区的质粒puc118由本所谭德明教授构建并赠送;质粒pcDNA3. 1(+)、大肠杆菌JM109及肝癌细胞系HepG2由我科保存;流式细胞仪(FACS420).

    1.2方法

    1.2.1 PCR
引物 根据HCV1a序列(AF009606)设计能扩增全长HCV-C的引物(分别在两端引入酶切位点HindⅢ及EcoRⅠ,并在下游设计终止密码),上游引物:ACAAGCTTCCCATGAGCACGAATCCTAAAC,下游引物 AGAATTCCTAGGCTGAAGCGGGCACAGTC,预计扩增片段长度为594 bp.

    1.2.2 构建包括目的基因HCV-C的重组真核表达质粒[14,15] 首先以包括HCV-C、E1和E2区的重组质粒Puc118为模板进行PCR扩增目的片段HCV-C,将纯化的PCR产物与T载体(3 000 bp)经T4 DNA连接酶4 ℃连接过夜,经氨苄青霉素筛选阳性克隆,并经HindⅢ、EcoRⅠ双酶切和PCR鉴定证实. 然后利用基因重组技术构建包括目的片段HCV-C的重组真核表达质粒pcDNA3. 1(约5 400 bp),经抗生素筛选,PCR扩增、HindIII和EcoRI双酶切以及重组质粒DNA序列测定证实重组真核表达质粒中包含目的片段HCV-C,说明含有目的基因HCV-C的重组真核表达质粒构建成功.

    1.2.3 重组真核表达质粒转染肝癌细胞HepG2 提取的重组真核表达质粒及空白质粒pcDNA3. 1经脂质体介导转染肝癌细胞HepG2,经G418筛选获得稳定转染重组真核表达质粒的HepG2细胞(分别称为HCV-C转染HepG2和空白质粒转染HepG2).

    1.2.4 RT-PCR和间接免疫荧光法检测HCV-C转染HepG2中HCV-C 表达 按Trizol RNA提取试剂盒说明提取细胞RNA,行RT-PCR检测HCV-C转染HepG2细胞中有无HCV-C mRNA表达. 将细胞置于放有盖玻片的6孔细胞培养板中培养48 h后,细胞经冷丙酮固定30 min,滴加山羊血清室温孵育20 min封闭;以丙型肝炎抗体阳性患者血清(1:8)作为一抗孵育2 h,FITC标记的山羊抗人IgG(1:32)为二抗37 ℃孵育1 h,然后经PBS漂洗3次×5 min;于荧光显微镜下观察HCV-C转染HepG2细胞中有无HCV-C 表达.

    1.2.5 MTT法检测HCV-C蛋白对HepG2细胞增生率的影响[15] 分别接种2×104个 HCV-C转染HepG2、空白质粒转染HepG2和未转染HepG2细胞于96孔细胞培养板中培养48 h后,使用MTT(四甲基偶氮唑蓝)法检测细胞生长率.

    1.2.6 流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡情况 分别传代2×105个HCV-C转染HepG2、空白质粒转染HepG2和未转染HepG2细胞至6孔细胞培养板中培养72 h,细胞经胰酶消化后用冷70 ml/L乙醇固定细胞于4 ℃保存,细胞经流式细胞术检测细胞凋亡及细胞周期情况. Fas抗体诱导HepG2细胞凋亡:HCV-C转染HepG2首先培养48 h后加入Fas抗体(200 ng/ml)后再培养24 h[16-20].

    统计学处理 利用SPSS10. 0软件进行统计分析:数据用表示,多组之间进行比较采用方差分析,当P <0. 05时,采用LSD法分别进行两两比较;两组之间进行比较采用成组设计 t检验,并以P <0. 05确定差异是否具有显著性.

    2 结果

    2.1 重组真核表达质粒经
PCR扩增可见600 bp左右的目的片段条带,HindIII 和EcoRI双酶切(图1),DNA序列测定说明包括HCV-C序列的重组真核表达质粒构建成功,与HCV1a基因进行同源性比较符合率为98. 6 %,无移码突变.

    2.2经RT-PCR和间接免疫荧光法检测证实HCV-C转染HepG2细胞中有HCV-C mRNA和蛋白质表达,而未转染HepG2 细胞和空白质粒转染HepG2细胞中无HCV-C表达.

    2.3 图2结果显示HCV-C转染HepG2细胞组生长增生率(0.32±0.04)高于空白质粒转染HepG2组(0.26±0.06)和未转染细胞组(0.26±0.05)(P <0.05),说明HCV-C蛋白促进HepG2细胞生长增生.

    2.4表1结果说明细胞未经Fas抗体诱导凋亡时,HCV-C转染HepG2细胞凋亡率低于未转染HepG2细胞凋亡率,同时HCV-C转染HepG2细胞S期所占百分率高于未转染细胞HepG2细胞S期所占百分率(P <0. 05) ; 二组细胞之间G0/1期所占百分率比较没有统计学差异(P >0.05),但HCV-C转染HepG2细胞仍低于未转染HepG2细胞;二组细胞之间G2/M期所占百分率没有显著性差别(P >0.05). 以上结果说明HCV-C蛋白促进HepG2细胞从G0/1期向S期转化,而对G2/M期没有影响. 表2结果显示HCV-C转染HepG2细胞经Fas抗体(200 ng/ml)作用后凋亡率显著增加(P <0.001),并且细胞凋亡增加时S期所占百分率少于未经Fas抗体诱导凋亡对照组S期所占百分率(P <0.05) ;G0/1期所占百分率与未经Fas抗体诱导凋亡对照组比较虽统计学上没有差异(P >0.05),但经Fas抗体诱导凋亡组仍高于未经Fas抗体诱导凋亡组;二组细胞之间G2/M期所占百分率没有显著性差异(P >0.05). 说明Fas抗体诱导细胞凋亡时也是作用于G1/S调控点,使HCV-C转染HepG2细胞阻滞于G0/1期,而对G2/M期没有影响.

    泳道M、D:DNA marker

    泳道1、2:酶切后重组真核表达质粒

    泳道3: 未酶切重组真核表达质粒

    图1(PDF) 重组真核表达质粒双酶切鉴定.

    图2(PDF) HCV-C蛋白对细胞增生.

    表1 HCV-C蛋白对HepG2细胞周期的影响(x±s,%)
细胞组别nG0/1S期G2/M期细胞凋亡率
未转染细胞组671.50±6.0815.17±3.8713.33±2.638.63±0.72
HCV-C转染组666.55±2.09b19.43±1.85a14.02±1.41b5.17±0.76a


    aP <0.05 vs 未转染细胞组; bP >0.05 vs 未转染细胞组.

    表2 细胞凋亡对HCV-C转染HepG2细胞周期的影响(x±s,%)
细胞组别nG0/1S期G2/M期凋亡率
未诱导凋亡对照组666.55±2.09b19.43±1.85a14.02±1.41b5.17±0.76a
Fas抗体诱导凋亡组470.43±3.6115.13±2.2014.45±1.6914.43±1.13


    aP <0.05 vs Fas抗体诱导凋亡组; bP >0.05 vs 未转染细胞组.

    3 讨论目前公认HCV-NS5和NS3蛋白具有促进细胞增生、抑制细胞凋亡的功能[21-24] ;而HCV-C蛋白对细胞增生的影响还没有定论. 细胞增生、死亡是受细胞周期调控的,细胞周期分为G0/1期、S期和G2/M期,其中最关键的两期为S期和M期. 不同生物细胞增生周期时间不同,主要是由G1期持续时间所决定的,而且G1启动是细胞周期启动的关键,因此G1/S期的调控尤为重要. 本实验结果表明HCV-C蛋白主要作用于G1/S调控点,促进HepG2细胞由G1期进入S期,由此可能启动并加速细胞周期进程,促进细胞增生和抑制细胞凋亡. 但HCV-C蛋白作用于G1/S调控点的机制有待进一步研究. Cho et al [8]发现HCV-C蛋白通过上调细胞中cyclin E促进细胞增生;Kwun et al [22]发现HCV-C蛋白通过抑制P21促进细胞增生. 当HCV-C转染HepG2细胞经Fas抗体诱导凋亡时S期百分率减少,细胞被阻滞于G1期. 增生细胞对某些凋亡诱因的敏感性常依赖于细胞周期,本实验结果表明不管是HCV-C蛋白抑制细胞凋亡,还是由Fas抗体诱导细胞凋亡增加时都不是作用于G2/M期. 细胞周期阻断与细胞凋亡关系不明确,并不是细胞周期阻断越完全越促使细胞凋亡;细胞周期阻断并不直接诱导细胞凋亡,他可能是细胞凋亡的重要前提[25]. 细胞凋亡和增生分化是独立的两种方式,但细胞凋亡和增生分化可同时存在;细胞凋亡可发生在细胞周期不同时相. 细胞凋亡与细胞增生并非一定成负相关,许多研究证明肿瘤组织含有激活的癌基因,但细胞却出现大量死亡;在慢性丙型肝炎患者肝细胞凋亡率和增生率可能同时升高,但存在增生/凋亡失衡[26].目前已知具有致凋亡作用的C-myc和腺病毒蛋白E1A都是细胞增生的诱导物.

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