细胞外信号调节激酶在胃癌组织中的表达及其与幽门螺杆菌感染的关系
禇传莲,济南市第三人民医院 山东省济南市 250101
李延青,张燕,李文婕,赵宪邨,山东大学齐鲁医院 山东省济南市 250012
项目负责人:李延青,250012,山东省济南市文化西路40号,山东大学齐鲁医院消化内科. chucl@sanlian.com.cn
电话:0531-6921941-5314
收稿日期:2002-10-07 接受日期:2002-10-29
摘要
目的:研究胃癌组织中细胞外信号调节激酶(ERK)的表达与幽门螺杆菌(H.pylori)的感染情况，探讨胃癌组织中ERK的表达与H.pylori感染的关系.
, http://www.100md.com
方法:ERK的表达采用免疫组化S-P法，用改良Giemsa染色、快速尿素酶试验和H.pylori -IgG检测胃癌组织中H.pylori感染情况.
结果:ERK1、ERK2在胃癌组织的细胞质和/或细胞核中表达，ERK1、ERK2在胃癌组织中表达的阳性率分别为82.5 %和77.5 %，在高-中分化腺癌、低分化腺癌、黏液腺癌和未分化癌中表达的阳性率均无显著性差异(P >0.05). ERK1、ERK2的表达与胃癌的分期无关(P >0.05). H.pylori阳性胃癌患者ERK1、ERK2的表达阳性率均明显高于H.pylori阴性患者(P <0.05).
结论:人胃癌组织中ERK1、ERK2的表达与H.pylori感染有关，H.pylori感染可能通过ERK信号传导途径诱导胃上皮细胞的增生，与胃癌发生有关.
, 百拇医药
禇传莲,李延青,张燕,李文婕,赵宪邨. 细胞外信号调节激酶在胃癌组织中的表达及其与幽门螺杆菌感染的关系. 世界华人消化杂志 2003;11(4):481-482
0 引言分子生物学研究发现，丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)介导的细胞内信号传递是受体酪氨酸蛋白激酶信息传递的主要途径之一，可将胞外刺激传导至细胞核内，参与细胞生长、分化、增生的调节[1]. 细胞外信号调节激酶(extracellular-signal regulated proein kinase， ERK)是MAPK系统的重要成员. 利用免疫组织化学方法染色检测胃癌组织中ERK的表达及其与Ⅰ类致癌原幽门螺杆菌(H.pylori)感染的关系，国内外尚无报道. 本实验的目的是研究人胃癌组织中ERK的表达及其与H.pylori感染的关系，探讨ERK信号传导通路在H.pylori相关性胃癌发生中的作用.
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1材料 随机选择山东大学齐鲁医院2001年行胃癌切除术的患者为研究对象，术前均经病理证实，除外4 wk内服用过抗H.pylori药物及抗生素患者，共40例患者入选，其中男24例，女16例，年龄36-81岁，平均(57.6±4.5)岁，按细胞分化程度，高-中分化腺癌10例，低分化腺癌16例，黏液腺癌11例，未分化癌3例. 胃癌标本按TNM分期，Ⅰ期4例，Ⅱ期7例，Ⅲ期 21例，Ⅳ期8例. 所取标本均经100 mL/L甲醛固定、石蜡包埋、连续切片贴于涂有APES的玻片上备用.所检患者均同时抽取空腹静脉血2 mL(1 0000 g/min离心，取上清，-20 ℃保存备用)做H.pylori-IgG检测. 兔抗人ERK1、ERK2抗体购自北京中山生物技术公司(为Santa Cruz公司产品)，S-P试剂盒购自福州迈新生物技术公司，DAB显色试剂为北京中山生物工程公司生产，抗H.pylori -IgG及快速尿素酶试剂为福建三强公司生产.
, 百拇医药
1.2方法
1.2.1 ERK1、ERK2的表达 采用免疫组化S-P法，操作步骤按说明书进行. 用100 mL/L正常山羊血清代替一抗作为阴性对照，在光镜下观察. 以细胞质或/和细胞核内出现棕黄色颗粒为阳性，将细胞染色强度和阳性细胞百分数分为4级，阳性细胞<5 %为0分，5-30 %为1分，30-75 %为2分，>75 %为3分; 根据黄色的深浅将无显色评为0分，淡黄色评为1分，桔黄色评为2分，棕黄色评为3分. 将二者评分相加除以2作为该片的最终评分，将0分定为阴性(-)，0.5-1分定为弱阳性(+)， 1.5-2.5分定为强阳性(++).
1.2.2 H.pylori的检测 采用改良Giemsa染色，快速尿素酶试验，血清H.pylori -IgG检测(金标渗滤斑点法). 按中华医学会有关H.pylori若干问题的共识意见[2]，以上任意两项阳性则确定为H.pylori感染，其中仅一项阳性或均阴性为无H.pylori感染.
, http://www.100md.com
统计学处理 应用SAS软件包进行x2检验或Fisher精确检验. 取P <0.05为差异有显著性.
2 结果
2.1胃癌组织中ERK1、ERK2的表达 ERK1、ERK2在胃癌组织中呈细胞质和/或细胞核着色，主要为癌细胞阳性，阳性细胞呈片状、小巢状排列. ERK1、ERK2在胃癌组织中的表达阳性率分别为82.5 %和77.5 %，按细胞分化程度，ERK1在高-中分化腺癌、低分化腺癌、黏液腺癌和未分化癌中表达阳性率分别为80 %、87.7 %、72.72 %和66.66 %，ERK2在高-中分化腺癌、低分化腺癌、黏液腺癌和未分化癌中表达阳性率分别为77.78 %、81.25 %、72.72 %和100 %，二者的表达在胃癌的不同分化程度之间均无显著性差异(P >0.05). 按TNM分期，ERK1、ERK2在Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期胃癌中的表达阳性率之间无显著性差异(P >0.05).
, http://www.100md.com
2.2 H.pylori感染对胃癌组织中ERK1、ERK2表达的影响 胃癌组织中H.pylori的感染率为70 %，按H.pylori感染状态分组，H.pylori阳性患者ERK1、ERK2的表达阳性率分别为75 %和64.29 %，H.pylori阴性患者ERK1、ERK2的表达阳性率为50 %和41.6 %，二者相比差异均有显著性(P <0.05).
3 讨论近年研究发现，肿瘤的发生、发展是细胞增生和细胞凋亡失平衡、细胞过度增生的结果. H.pylori感染与人胃癌发生有关，是胃癌发生的“启动子”之一[3,4]. H.pylori感染后胃上皮细胞的增生增加，根除H.pylori可使胃上皮细胞增生数降至正常水平[5,6]，但是H.pylori感染致细胞增生的机制尚不清楚. Ras/Raf/ERK信号传导通路是细胞增生、分化的基本信号传导通路[7]. ERK包括两个高度同源的亚类ERK1和ERK2，其相对分子量分别为44 kD、42 kD，活化后可由细胞质转移至细胞核内，磷酸化活化一系列转录因子(包括ELK-1，SAP-1，c-myc，STAT等)而起生物学作用. 体外研究发现[8]， H.pylori提取物作用于胃癌细胞后可使ERK活性明显升高，经血清饥饿后更明显，而H.pylori对来自大鼠胚胎的胃正常细胞ERK的活性无影响. Meyer-ter-Vehn et al [9]也发现H.pylori 可激活ERK/MAPK级联反应，导致Erk-1的磷酸化，并可增加原癌基因c-fos的转录. 突变的H.pylori菌株不诱导MAPK活性及c-fos和c-jun的激活. 最近Mitsuno et al [10]还对不同H.pylori菌株与胃癌细胞共同培养发现，H.pylori通过ERK/MAPK信号级联途径可激活胃上皮细胞内血清应答元素(serum response element)和转录因子激活蛋白1(AP-1)的交叉激活. 本研究利用免疫组化研究人胃癌组织中ERK的表达与H.pylori感染的关系，发现胃癌组织中ERK1、ERK2呈高表达，并且发现阳性颗粒主要位于细胞质和细胞核内，而正常的胃黏膜组织无表达，提示ERK与胃癌有关. 按照H.pylori感染状态分组，H.pylori阳性的胃癌患者ERK的表达明显高于非H.pylori感染者，与此方面已有的研究结果一致，说明胃癌组织中H.pylori感染与ERK的表达相关，H.pylori感染可能通过ERK信号途径刺激胃上皮细胞的增生，可能与胃癌的发生有关.
, 百拇医药
H.pylori接触胃上皮细胞后如何激活胃上皮细胞内ERK信号传导通路? 研究发现[11] H.pylori可能通过表皮生长因子受体激活小GTP 结合蛋白而激活Ras/Raf/ERK，反过来又调节ERK1、ERK2的磷酸化，并且cagA阳性H.pylori较cagA阴性H.pylori激活ERK活性的作用更大. 说明H.pylori的致病因素细胞毒素相关基因蛋白-CagA可能在诱导ERK活性方面起作用. 已有研究显示CagA可经Ⅳ型分泌系统进入宿主细胞，但是他与ERK/MAPK级联反应的关系仍不清楚，尚需今后进一步的研究.
4 参考文献1 Sugiura R,Toda T,Dhut S,Shuntoh H,Kuno T. The MAPK kinase PekⅠacts as a phosphorylation-dependent molecular
switch. Nature 1999;399:479-482
, 百拇医药
2 中华医学会消化病学分会. 幽门螺杆菌若干问题的共识意见. 中华消化杂志 2000;20:117-118
3 Martin-de-Argila C, Boixeda D, Redondo C, Alvarez I, Gisbert JP, Garcia Plaza A, Canton R. Relation between histologic
subtypes and location of gastric cancer and Helicobacter pylori. Scand J Gastroenterol 1997;32:303-307
4 Forman D,Newell DG, Fullerton F, Yarnell JW, Stacey AR, Wald N, Sitas F. Association between infection with Helicobacter
, 百拇医药
pylori and risk of gastric cancer:evidence from a prospective investigation. BMJ 1991;302:1302-1305
5 Brenes F, Ruiz B, Correa P, Hunter F, Rhamakrishnan T, Fontham E, Shi TY. Helicobacter pylori causes hyperproliferation
of the gastric epithelium:pre-and post-eradication indices of proliferatng cell nuclear antigen. Am J
Gastroenterol 1993; 88:1870-1875
, 百拇医药 6 Bechi P, Balzi M, Becciolini A, Maugeri A, Raggi CC, Amorosi A, Dei R. Helicobacter pylori and cell proliferation of the
gastric mucosa: possible implications for gastric carcinogenesis. Am J Gastroenterol 1996;91:271-276
7 Seger R, Krebs EG. The MAPK signaling cascade. FASEB J 1995; 9: 726-735
8 Chen YC ,Zhang JZ, Li T,Sheng T, Zhu WY. The effect of Helicobacter pylori on the activity of extracellular signal
, 百拇医药
regulated kinase in human and rat gastric epithelial cells. J Beijing Med Univ 2000;2:109-112
9 Meyer-ter-Vehn T, Covacci A, Kist M, Pahl HL. Helicobacter pylori activates mitogen - activeted protein kinase cascades
and induces expression of the proto-oncogenes c-fos and c-jun. J Biol Chem 2000;275:16064-16072
10 Mitsuno Y, Maeda S, Yoshida H, Hirata Y, Ogura K, Akanuma M, Kawabe T, Shiratori Y, Omata M. Helicobacter pylori
, 百拇医药
activates the proto- oncogene c-fos through SRE transactivation. Bio Chem Biophys Res Commun 2002;291: 868-874
11 Keates S, Sougioultzis S, Keates AC, Zhao D, Peek RM Jr, Shaw LM, Kelly CP. Cag+ Helicobacter pylori induce transactivation
of the epidermal growth factor receptor in AGS gastric epithelial cells. J Biol Chem 2001;276:48127-48134, http://www.100md.com(禇传莲,李延青,张 燕,李文婕,赵宪邨)
李延青,张燕,李文婕,赵宪邨,山东大学齐鲁医院 山东省济南市 250012
项目负责人:李延青,250012,山东省济南市文化西路40号,山东大学齐鲁医院消化内科. chucl@sanlian.com.cn
电话:0531-6921941-5314
收稿日期:2002-10-07 接受日期:2002-10-29
摘要
目的:研究胃癌组织中细胞外信号调节激酶(ERK)的表达与幽门螺杆菌(H.pylori)的感染情况，探讨胃癌组织中ERK的表达与H.pylori感染的关系.
, http://www.100md.com
方法:ERK的表达采用免疫组化S-P法，用改良Giemsa染色、快速尿素酶试验和H.pylori -IgG检测胃癌组织中H.pylori感染情况.
结果:ERK1、ERK2在胃癌组织的细胞质和/或细胞核中表达，ERK1、ERK2在胃癌组织中表达的阳性率分别为82.5 %和77.5 %，在高-中分化腺癌、低分化腺癌、黏液腺癌和未分化癌中表达的阳性率均无显著性差异(P >0.05). ERK1、ERK2的表达与胃癌的分期无关(P >0.05). H.pylori阳性胃癌患者ERK1、ERK2的表达阳性率均明显高于H.pylori阴性患者(P <0.05).
结论:人胃癌组织中ERK1、ERK2的表达与H.pylori感染有关，H.pylori感染可能通过ERK信号传导途径诱导胃上皮细胞的增生，与胃癌发生有关.
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禇传莲,李延青,张燕,李文婕,赵宪邨. 细胞外信号调节激酶在胃癌组织中的表达及其与幽门螺杆菌感染的关系. 世界华人消化杂志 2003;11(4):481-482
0 引言分子生物学研究发现，丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)介导的细胞内信号传递是受体酪氨酸蛋白激酶信息传递的主要途径之一，可将胞外刺激传导至细胞核内，参与细胞生长、分化、增生的调节[1]. 细胞外信号调节激酶(extracellular-signal regulated proein kinase， ERK)是MAPK系统的重要成员. 利用免疫组织化学方法染色检测胃癌组织中ERK的表达及其与Ⅰ类致癌原幽门螺杆菌(H.pylori)感染的关系，国内外尚无报道. 本实验的目的是研究人胃癌组织中ERK的表达及其与H.pylori感染的关系，探讨ERK信号传导通路在H.pylori相关性胃癌发生中的作用.
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1 材料和方法
1.1材料 随机选择山东大学齐鲁医院2001年行胃癌切除术的患者为研究对象，术前均经病理证实，除外4 wk内服用过抗H.pylori药物及抗生素患者，共40例患者入选，其中男24例，女16例，年龄36-81岁，平均(57.6±4.5)岁，按细胞分化程度，高-中分化腺癌10例，低分化腺癌16例，黏液腺癌11例，未分化癌3例. 胃癌标本按TNM分期，Ⅰ期4例，Ⅱ期7例，Ⅲ期 21例，Ⅳ期8例. 所取标本均经100 mL/L甲醛固定、石蜡包埋、连续切片贴于涂有APES的玻片上备用.所检患者均同时抽取空腹静脉血2 mL(1 0000 g/min离心，取上清，-20 ℃保存备用)做H.pylori-IgG检测. 兔抗人ERK1、ERK2抗体购自北京中山生物技术公司(为Santa Cruz公司产品)，S-P试剂盒购自福州迈新生物技术公司，DAB显色试剂为北京中山生物工程公司生产，抗H.pylori -IgG及快速尿素酶试剂为福建三强公司生产.
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1.2方法
1.2.1 ERK1、ERK2的表达 采用免疫组化S-P法，操作步骤按说明书进行. 用100 mL/L正常山羊血清代替一抗作为阴性对照，在光镜下观察. 以细胞质或/和细胞核内出现棕黄色颗粒为阳性，将细胞染色强度和阳性细胞百分数分为4级，阳性细胞<5 %为0分，5-30 %为1分，30-75 %为2分，>75 %为3分; 根据黄色的深浅将无显色评为0分，淡黄色评为1分，桔黄色评为2分，棕黄色评为3分. 将二者评分相加除以2作为该片的最终评分，将0分定为阴性(-)，0.5-1分定为弱阳性(+)， 1.5-2.5分定为强阳性(++).
1.2.2 H.pylori的检测 采用改良Giemsa染色，快速尿素酶试验，血清H.pylori -IgG检测(金标渗滤斑点法). 按中华医学会有关H.pylori若干问题的共识意见[2]，以上任意两项阳性则确定为H.pylori感染，其中仅一项阳性或均阴性为无H.pylori感染.
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统计学处理 应用SAS软件包进行x2检验或Fisher精确检验. 取P <0.05为差异有显著性.
2 结果
2.1胃癌组织中ERK1、ERK2的表达 ERK1、ERK2在胃癌组织中呈细胞质和/或细胞核着色，主要为癌细胞阳性，阳性细胞呈片状、小巢状排列. ERK1、ERK2在胃癌组织中的表达阳性率分别为82.5 %和77.5 %，按细胞分化程度，ERK1在高-中分化腺癌、低分化腺癌、黏液腺癌和未分化癌中表达阳性率分别为80 %、87.7 %、72.72 %和66.66 %，ERK2在高-中分化腺癌、低分化腺癌、黏液腺癌和未分化癌中表达阳性率分别为77.78 %、81.25 %、72.72 %和100 %，二者的表达在胃癌的不同分化程度之间均无显著性差异(P >0.05). 按TNM分期，ERK1、ERK2在Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期胃癌中的表达阳性率之间无显著性差异(P >0.05).
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2.2 H.pylori感染对胃癌组织中ERK1、ERK2表达的影响 胃癌组织中H.pylori的感染率为70 %，按H.pylori感染状态分组，H.pylori阳性患者ERK1、ERK2的表达阳性率分别为75 %和64.29 %，H.pylori阴性患者ERK1、ERK2的表达阳性率为50 %和41.6 %，二者相比差异均有显著性(P <0.05).
3 讨论近年研究发现，肿瘤的发生、发展是细胞增生和细胞凋亡失平衡、细胞过度增生的结果. H.pylori感染与人胃癌发生有关，是胃癌发生的“启动子”之一[3,4]. H.pylori感染后胃上皮细胞的增生增加，根除H.pylori可使胃上皮细胞增生数降至正常水平[5,6]，但是H.pylori感染致细胞增生的机制尚不清楚. Ras/Raf/ERK信号传导通路是细胞增生、分化的基本信号传导通路[7]. ERK包括两个高度同源的亚类ERK1和ERK2，其相对分子量分别为44 kD、42 kD，活化后可由细胞质转移至细胞核内，磷酸化活化一系列转录因子(包括ELK-1，SAP-1，c-myc，STAT等)而起生物学作用. 体外研究发现[8]， H.pylori提取物作用于胃癌细胞后可使ERK活性明显升高，经血清饥饿后更明显，而H.pylori对来自大鼠胚胎的胃正常细胞ERK的活性无影响. Meyer-ter-Vehn et al [9]也发现H.pylori 可激活ERK/MAPK级联反应，导致Erk-1的磷酸化，并可增加原癌基因c-fos的转录. 突变的H.pylori菌株不诱导MAPK活性及c-fos和c-jun的激活. 最近Mitsuno et al [10]还对不同H.pylori菌株与胃癌细胞共同培养发现，H.pylori通过ERK/MAPK信号级联途径可激活胃上皮细胞内血清应答元素(serum response element)和转录因子激活蛋白1(AP-1)的交叉激活. 本研究利用免疫组化研究人胃癌组织中ERK的表达与H.pylori感染的关系，发现胃癌组织中ERK1、ERK2呈高表达，并且发现阳性颗粒主要位于细胞质和细胞核内，而正常的胃黏膜组织无表达，提示ERK与胃癌有关. 按照H.pylori感染状态分组，H.pylori阳性的胃癌患者ERK的表达明显高于非H.pylori感染者，与此方面已有的研究结果一致，说明胃癌组织中H.pylori感染与ERK的表达相关，H.pylori感染可能通过ERK信号途径刺激胃上皮细胞的增生，可能与胃癌的发生有关.
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H.pylori接触胃上皮细胞后如何激活胃上皮细胞内ERK信号传导通路? 研究发现[11] H.pylori可能通过表皮生长因子受体激活小GTP 结合蛋白而激活Ras/Raf/ERK，反过来又调节ERK1、ERK2的磷酸化，并且cagA阳性H.pylori较cagA阴性H.pylori激活ERK活性的作用更大. 说明H.pylori的致病因素细胞毒素相关基因蛋白-CagA可能在诱导ERK活性方面起作用. 已有研究显示CagA可经Ⅳ型分泌系统进入宿主细胞，但是他与ERK/MAPK级联反应的关系仍不清楚，尚需今后进一步的研究.
4 参考文献1 Sugiura R,Toda T,Dhut S,Shuntoh H,Kuno T. The MAPK kinase PekⅠacts as a phosphorylation-dependent molecular
switch. Nature 1999;399:479-482
, 百拇医药
2 中华医学会消化病学分会. 幽门螺杆菌若干问题的共识意见. 中华消化杂志 2000;20:117-118
3 Martin-de-Argila C, Boixeda D, Redondo C, Alvarez I, Gisbert JP, Garcia Plaza A, Canton R. Relation between histologic
subtypes and location of gastric cancer and Helicobacter pylori. Scand J Gastroenterol 1997;32:303-307
4 Forman D,Newell DG, Fullerton F, Yarnell JW, Stacey AR, Wald N, Sitas F. Association between infection with Helicobacter
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pylori and risk of gastric cancer:evidence from a prospective investigation. BMJ 1991;302:1302-1305
5 Brenes F, Ruiz B, Correa P, Hunter F, Rhamakrishnan T, Fontham E, Shi TY. Helicobacter pylori causes hyperproliferation
of the gastric epithelium:pre-and post-eradication indices of proliferatng cell nuclear antigen. Am J
Gastroenterol 1993; 88:1870-1875
, 百拇医药 6 Bechi P, Balzi M, Becciolini A, Maugeri A, Raggi CC, Amorosi A, Dei R. Helicobacter pylori and cell proliferation of the
gastric mucosa: possible implications for gastric carcinogenesis. Am J Gastroenterol 1996;91:271-276
7 Seger R, Krebs EG. The MAPK signaling cascade. FASEB J 1995; 9: 726-735
8 Chen YC ,Zhang JZ, Li T,Sheng T, Zhu WY. The effect of Helicobacter pylori on the activity of extracellular signal
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regulated kinase in human and rat gastric epithelial cells. J Beijing Med Univ 2000;2:109-112
9 Meyer-ter-Vehn T, Covacci A, Kist M, Pahl HL. Helicobacter pylori activates mitogen - activeted protein kinase cascades
and induces expression of the proto-oncogenes c-fos and c-jun. J Biol Chem 2000;275:16064-16072
10 Mitsuno Y, Maeda S, Yoshida H, Hirata Y, Ogura K, Akanuma M, Kawabe T, Shiratori Y, Omata M. Helicobacter pylori
, 百拇医药
activates the proto- oncogene c-fos through SRE transactivation. Bio Chem Biophys Res Commun 2002;291: 868-874
11 Keates S, Sougioultzis S, Keates AC, Zhao D, Peek RM Jr, Shaw LM, Kelly CP. Cag+ Helicobacter pylori induce transactivation
of the epidermal growth factor receptor in AGS gastric epithelial cells. J Biol Chem 2001;276:48127-48134, http://www.100md.com(禇传莲,李延青,张 燕,李文婕,赵宪邨)
